Cuestionario Microbiología farmacéutica.

Práctica 1.- Diseño de medios de cultivo.

1. ¿Qué es un medio de cultivo, qué finalidad tiene diseñarlo y con base

a qué se debe diseñar?

• Medio de cultivo

Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el

desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un
cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que
los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los
componentes, en:
1. Medios sintéticos o medios químicamente definidos
2. Medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen
animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz,
harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya
mencionadas, pero que son químicamente indefinidas y de composición
variable.
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el
diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los mismos.

• Finalidad que tiene diseñar un medio de cultivo

Finalidad del diseño: El diseño de un medio de cultivo tiene como finalidad la

elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento del
microorganismo y la formación de productos correspondientes al proceso a
desarrollar.
• ¿Con base a qué se deben diseñar?

Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el
microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los
requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso,
la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias
primas. Otros aspectos que son también importantes se refieren a todos los
procesos y operaciones previas y posteriores a la etapa de fermentación y al
conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de algunos
productos.1
Requerimientos nutricionales de los microorganismos (generalidades de
crecimiento bacterias, hongos, levaduras)

2. ¿Qué es el crecimiento microbiano?

En un sistema biológico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las

estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Según ello, el aumento
de la masa celular producido por acumulación de productos de reserva (glucógeno,
poliβhidroxibutirato) no constituyen crecimiento. Se puede considerar como
crecimiento al incremento de células individuales, por un lado, y por otro lado se
puede considerar al crecimiento del número de células (proliferación de la
población).2

3. Principales fuentes de carbono usadas en procesos microbiológicos

industriales y su función

• Almidón
• Sacarosa
• Azucares reductores
• Hemicelulosas
• Celulosas

Las fuentes de carbono son empleadas en el metabolismo para la formación de

biomasa, así como la producción de metabolitos primarios o secundarios. [3]

4. Principales fuentes de nitrógeno usadas en procesos microbiológicos

industriales y su función

Usualmente existen dos fuentes de carbono, orgánica e inorgánica:

• Para las fuentes inorgánicas están las sales de amonio y las sales de nitrato
• Para las fuentes orgánicas se emplean aminoácidos, proteínas, urea

Generalmente se emplean para como segundo metabolito y con este cambian

dependiendo de la fuente de nitrógeno el pH del medio provocando cambios o
metabolitos primarios.3

La mayoría de los procesos industriales pueden utilizar nitrógeno de fuentes

orgánicas o inorgánicas. El nitrógeno inorgánico puede ser suministrado como sales
de amonio, a menudo sulfato de amonio o fosfato de amonio dibásico. El amoniaco
también puede ser utilizado para ajustar el pH de la fermentación. Las fuentes
orgánicas incluyen aminoácidos, proteínas y urea. El nitrógeno frecuentemente es
suministrado en forma cruda, que son esencialmente subproductos de otras
industrias, como licor escarpado de maíz, extractos de levaduras, peptonas y harina
de soya. Los aminoácidos purificados sólo son utilizados en situaciones especiales,
usualmente como precursores para productos específicos.

• Licor escarpado de maíz.

Es un subproducto de la extracción del almidón a partir de maíz y su primer uso en
fermentación fue para la producción de penicilina en 1940. La composición del
extracto varía dependiendo de la calidad del maíz y las condiciones del proceso.
Los extractos concentrados generalmente contienen cerca del 4% (p/v) de
nitrógeno, incluyendo un amplio rango de aminoácidos, vitaminas y minerales.
Cualquier azúcar residual es usualmente convertido a ácido láctico (9-20%, p/v) por
bacterias contaminantes. Tiene mucha importancia por su utilización como
componente esencial de los medios para la producción de varios antibióticos y
enzimas.

• Extractos de levaduras.
Pueden ser producidos a partir de desechos de panadería y levadura de cerveza, u
otras cepas de Sacharomyces cerevisiae. Estos extractos usados en la formulación
de medios de fermentación son normalmente concentrados de componentes
solubles de células de levadura hidrolizada libres de sal. Los extractos de levadura
con cloruro de sodio en concentraciones mayores al 0.05% (p/v) no pueden ser
utilizadas en procesos de fermentación debido a problemas potenciales de
corrosión. Estos extractos son obtenidos mediante autolisis de las células, y pueden
estar disponibles como líquidos con un contenido de 50-65% de sólidos, pastas
viscosas o polvos secos, contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas hidrosolubles y
un poco de glucosa.

• Peptonas.
Las peptonas son usualmente muy caras para fermentaciones industriales a gran
escala. Éstas son preparadas por hidrólisis ácida o enzimática de materiales con
gran contenido de proteínas: carne, caseína, gelatina, queratina, cacahuates, harina
de soya, etc. Su composición de aminoácidos varía dependiendo de la fuente
original de proteínas. Por ejemplo, la gelatina produce peptonas ricas en prolina e
hidroxiprolina, pero casi no contienes aminoácidos azufrados. Las peptonas a partir
de plantas contienen una gran cantidad de carbohidratos.

• Harina de soya.
Los residuos que quedan de las semillas de soya después de haber sido procesados
para extraer su aceite, se componen de 50% de proteína, 8% de compuestos no
nitrogenados, 30% de carbohidratos y 1% de aceite. Los residuos de la harina de
soya son frecuentemente utilizados en fermentaciones antibióticas, porque los
componentes son metabolizados lentamente, con lo que se elimina la posibilidad de
represión del producto de formación.
Es muy importante también la correcta elección de una determinada fuente cuando
se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los
costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompañar a las
distintas materias primas utilizadas.4

5. Importancia de los minerales, clasificación y cantidades adicionadas de

las sales minerales en un medio de cultivo y como se clasifican y en
cantidades adicionadas

La importancia es que influyen en diferentes procesos metabólicos y de síntesis

como, por ejemplo:

Fosforo tiene participación en la composición de ADN ARN y ATP.

En conclusión los elementos como el Hierro, Zinc, Manganeso, Molibdeno, Cobalto,

Cobre y Calcio tienen una función como coenzimas y catalizadores de principales
reacciones metabólicas y por lo general se usan en concentraciones de 1 g a 10
g.3

6. Mencione que características consideraría para diseñar un medio de

cultivo para bacterias y ¿por qué?

Para el diseño de un medio de cultivo para bacterias es importante considerar:

• La bacteria de interés para la cual se esta diseñando el medio de cultivo. Ya

que, con base en las condiciones de crecimiento como pH, temperatura,
humedad de esta, se logrará establecer las optimas características para el
diseño del medio.
• Requerimientos de macronutrientes, micronutrientes y factores de
crecimiento para el desarrollo de la bacteria. Para escoger la mejor selección
de nutrientes que conformen la mezcla que formará al medio para permitir la
producción máxima posible de producto de interés y manteniendo al mínimo
la producción de productos indeseables, debiendo ser componentes baratos
pero de calidad consistente, disponibles y de fácil acceso durante cualquier
temporada del año, además de causar problemas mínimos referentes al
 proceso de producción, extracción y purificación de productos resultantes,
así como para el tratamiento de residuos.
• Cantidad de sustratos necesarios para conseguir el crecimiento de la
biomasa, su mantenimiento y para producir los rendimientos de productos
requeridos, debiendo establecerse las cantidades óptimas de agua, fuentes
de carbono, nitrógeno, factores de crecimiento y si es necesaria la adición de
precursores, reguladores metabólicos o si hay requerimientos de oxígeno.

7. Diseño de un medio de cultivo para hongos

• Características generales de crecimiento del hongo o grupo de hongos de

interés ya sea físicas o químicas.
• Establecer requerimientos nutricionales del microorganismo y los
componentes necesarios del proceso para la producción del producto de
interés, que serán incluidos en el medio de cultivo.
• Por medio de la ecuación

Establecer los sustratos necesarios para la obtención del rendimiento de productos

requerido.

• Tomando en cuenta la composición general para un medio de cultivo para

hongos:

Elemento % en peso seco

Carbono 40-63
Nitrógeno 7-10
Fosforo 0.4-4.5
Azufre 0.1-0.5
Potasio 0.2-2.5
Sodio 0.02-0.5
Calcio 0.1-1.4
Magnesio 0.1-0.5
 Hierro 0.1-0.2

Para medios sólidos proporción de agar es mayor al 15% y en los semisólidos

alrededor del 5%.3

• Tomando en cuenta los parámetros anteriores un posible medio de cultivo

general para hongos sería:

-Agar 15 gramos

-Peptona 5 gramos (como fuente de nitrógeno).

-Glucosa 32 gramos

-Potasio 0.8 gramos

-Calcio 0.2 gramos

-Tripteína 2 gramos (como fuente de diversos micronutrientes minerales y algunos

factores de crecimiento como aminoácidos).

Para agregarse 55 gramos en 1000 mL de agua purificada.

Referencias

1) Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología.

Bioprocesos. Trabajo práctico nutrición microbiana: Diseño de medios de
cultivo. [Internet]. Consultado: 9-02-2019. Disponible en:
http://bioprocesos.unq.edu.ar/Biopro%20I/TP%20Nutricion.pdf
2) A Brock, T. & M. Madigan. Microbiología. 6ta Edición. Prentice Hall
Hispanoamérica S. A; México: 1993.
3) P.F Stanbury. A. Whitaker. “Principles of Fermentation Technology”. Media
for Industrial Fermentations. 1ra Ed. Pergamon Press England, 1989.
4) Waites M., Morgan N. Industrial Microbiolgy: an introduction. Blackwell
science: United Kingdom: 2001.

8. Procedimiento experimental
Propagación

DETERMINACIÓN DE DENSIDAD ÓPTICA Y PESO SECO

DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DNS

Seminario 1A

1. Crecimiento de bacterias , hongos y levaduras

En microbiología el crecimiento se define como el incremento en el número de

células.

•La bipartición (fisión binaria) es el proceso por el cual una célula se divide
para formar dos células iguales.
•El intervalo que transcurre en la formación de dos células a partir de una
célula se llama generación y el tiempo requerido para esto es el tiempo de
generación o tiempo de duplicación.
El crecimiento de un cultivo bacteriano puede ocurrir en un sistema cerrado o en un
sistema abierto. En el primero no ocurre renovación de los nutrientes y las
sustancias tóxicas se acumulan en el medio, al contrario de lo que sucede en un
sistema abierto. Un ciclo de crecimiento en un sistema cerrado presenta cuatro
fases diferentes:

1. Fase de latencia: generalmente, el crecimiento bacteriano no se inicia tras

el cultivo en un nuevo medio, notándose esta fase inicial sin grandes
diferencias a nivel del crecimiento. Esta fase puede tener varias
explicaciones, como diferencias de condiciones entre el cultivo inicial y el
 nuevo; células que sufrieron daños anteriormente y necesitan un tiempo para
recuperar; inoculación de un cultivo antiguo: síntesis de los componentes
celulares necesarios para la división celular.
2. Fase exponencial: todas las células entran en división celular durante un
periodo de tiempo que depende de la cantidad de nutrientes presentes en el
medio. En esta fase, las células están en su mejor estado de desarrollo,
siendo este el momento dispensable para la realización de ensayos
científicos. La tasa de crecimiento es afectada por las condiciones de cultivo
y también por las características genéticas de los microorganismos
3. Fase estacionaria: después de la fase de crecimiento exponencial, puede
ocurrir la depleción de uno de los nutrientes esenciales al crecimiento celular
o la acumulación de un producto de metabolismo que impida el crecimiento.
De esta forma, las bacterias cesan su crecimiento, entrando en una fase
estacionara, durante la cual la tasa de crecimiento es nula.
4. Fase de declive o de muerte celular: en el caso de que el cultivo bacteriano
continúe tras la fase anterior, las células van a acabar por morir, pudiendo
inclusivamente ocurrir lisis celular. La muerte celular ocurre a una velocidad
mucho menor que el crecimiento bacteriano.

HONGOS Y LEVADURAS

Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benéficas o

perjudiciales. Las levaduras se utilizan en la elaboración de alimentos como el
pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, también se utilizan en la obtención de
enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando
producen la alteración del sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de
la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos.
Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su
observación microscópica. Su forma puede ser desde esférica a ovoide,
alimonada, piriforme, cilíndrica, triangular e incluso alargada. La mayoría se
reproducen asexualmente por gemación multicelular o por gemación polar. Unas
pocas especies se reproducen por fisión. En los cultivos en placas de agar es
difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la
observación microscópica de los microorganismos es la única forma segura de
diferenciarlas. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y
algo mucosas; la mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque algunas
tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su
actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. La mayoría de las levaduras
crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen mejor que
la mayoría de las bacterias en sustratos que contienen elevadas
concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es
decir son osmotolerantes. Sin embargo la mayoría de las levaduras necesitan
mayor humedad que los mohos. Para la mayoría de las levaduras la Aw mínima
de crecimiento oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de
crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura óptima en torno
a los 25 a 30°C y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47°C. Crecen
mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de
 crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los azúcares son la fuente
energética más apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden
oxidar los ácidos orgánicos y el alcohol.

2. Métodos para medir número de células (# total de células, # células

vivas), métodos para evaluar masa celular 8directos e indirectos).

Los métodos de cuantificación se clasifican en

• Directos (se cuentan directamente a las células o colonias p.ej.

Microscopios y placas)
• Indirectos (se basan en algún parámetro que permite deducir la evolución
del número de m.o. p.ej. Turbidimetría)
• Viables. (conteo de células vivas p.ej. conteo por filtración)
• Totales (conteo de células vivas y muertas p.ej. Coulter conter)

COULTER CONTER (DIRECTO Y TOTAL)

Consta de 2 cámaras separadas por una barrera en la cual hay un orificio de 5-10
micrómetros de diámetro.
La resistencia eléctrica a través del orificio se encuentra normalizada y en ambos
compartimientos hay electrodos que se encargan de medir dicha resistencia y se
hace pasar de un compartimiento a otro. Cada vez que un m.o. pasa por el orificio
de una cámara a otra, la resistencia eléctrica se incrementa ya que la
conductividad de la célula es menor que la del medio. Dicha alteración de la
resistencia se registra electrónicamente como pulsos contados.

Método de dilución y vaciado en placa (directo viable)

1.-Se toma un 1mL de la muestra y se realizan diluciones para llegar a la dilución
1:106
2.- Se toma 1 mL de cada dilución y se vierte en una caja petri estéril diferente.
3.- Se adiciona el medio de cultivo estéril a una temperatura aproximada de 50°C
4.-Homogenizar
5.- Incubar
6.- Contar las colonias inmersas y en superficie
7. Multiplicar por el factor de dilución
8. Reportar el resultado como UFC/mL

Espectrofotometría (indirecto total)

1.- Determinar una longitud de onda para calibrar
2.- Se utiliza el medio de cultivo sin m.o. como blanco y se ajusta a 100 de
transmitancia
3.- Se traza una curva patrón con muestras de m.o. de concentración conocida
4.- Se grafica absorbancia (Y) vs. Numero de m.o. (x)
5.- Leer la muestra problema
6.- Interpolar y conocer la concentración de la muestra

Actividad metabólica (indirecto y viable)

La actividad metabólica puede usarse para medir indirectamente una población
microbiana. Entre los métodos utilizados se puede determinar la tasa de formación
de un producto metabólico como ácidos o bases, o bien, se puede determinar la
tasa de utilización de un sustrato. También se puede determinar la tasa de reducción
de determinados colorantes.
Por ejemplo reducción del azul de metileno.

5) Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología.

Bioprocesos. Trabajo práctico nutrición microbiana: Diseño de medios de
cultivo. [Internet]. Consultado: 9-02-2019. Disponible en:
http://bioprocesos.unq.edu.ar/Biopro%20I/TP%20Nutricion.pdf
6) A Brock, T. & M. Madigan. Microbiología. 6ta Edición. Prentice Hall
Hispanoamérica S. A; México: 1993.
7) Waites M., Morgan N. Industrial Microbiolgy: an introduction. Blackwell
science: United Kingdom: 2001.
8) P.F Stanbury. A. Whitaker. “Principles of Fermentation Technology”. Media
for Industrial Fermentations. 1ra Ed. Pergamon Press England, 1989 pag: 71-
87