UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUIMICA
PRACTICA N° 2

DETERMINACIÓN Y ANALISIS DE CARBOHIDRATOS

Objetivos

1. Extraer lactosa a partir de leche descremada.

2. Separar e identificar los carbohidratos procedentes de jugo de frutas y leche,
mediante pruebas químicas específicas para carbohidratos.
3. Caracterizar los productos obtenidos por cromatografía en capa fina.
4. Establecer la relación entre la cantidad de lactosa extraída y el volumen de leche
utilizada.

Fundamento Teórico:

Los hidratos de carbono, también llamados azúcares, glúcidos o sacáridos, son un grupo
de biomoleculas cuya característica química principal es su naturaleza polihidroxílica
con otra función más oxidada, el grupo carbonilo de aldehídos y cetonas. En estas
funciones se centra su reactividad.

Los carbohidratos están distribuidos ampliamente en vegetales y animales en los cuales

tienen participación estructural, funcional y metabólica. Los carbohidratos se clasifican
dependiendo del numero de átomos de carbono que posee y la función aldehídica o
cetonia, estas a su vez le confiere la base para la mayoría de las reacciones usadas para
su identificación y cuantificación. Cuando el carbohidrato esta formado por una sola
molécula de carbohidrato, se denomina monosacárido, por dos, disacárido y por mas de
dos, polisacárido.

Los disacáridos son azucares formados por la unión de dos monosacáridos mediante el
enlace glucosídico. Si este enlace se efectúa entre dos carbonos anoméricos, el
disacárido no tendrá el potencial aldehído o cetona libre, por lo tanto no dan positivas
aquellas pruebas que involucren la participación de estos grupos, recibiendo el nombre
de azúcar no reductor, la sacarosa y la trealosa son ejemplos de los disacáridos no
reductores. Todos los disacáridos que posean un carbono anomérico libre, darán
positivas estas reacciones, llamándose azucares reductores, debido a que promueven la
reducción del reactivo usado y ellos mismos se oxidan. Aunque la mayoría de los
disacáridos carecen de importancia para el hombre, con algunas excepciones como la
sacarosa, su estudio se debe a que disacáridos como la maltosa y la celubiosa, se
originan como producto de la hidrólisis de polisacáridos, la maltosa, por ejemplo, es el
producto de la hidrólisis del glucógeno y el almidón. Los polisacáridos, si son
abundantes y representan para el hombre la principal fuente de energía metabólica de
fácil aprovechamiento, el almidón, constituido por solo moléculas de glucosa es sin
lugar a dudas la base alimenticia del globo terrestre, especialmente en la población de
bajos recursos.

En esta practica se realizan algunos ensayos calorimétricos que pueden ayudar a

clasificar e, incluso, a identificar un determinado azúcar entre varios posibles. El
principal problema es la sensibilidad de algunos de ellos, que los hacen poco útiles en
muestras muy diluidas. Se incluyen en este Curso de Prácticas por su carácter
pedagógico.

Análisis cromatográfico de Carbohidratos

La cromatografía en capa fina: Es una técnica que permite separar e identificar los
carbohidratos por comparación con patrones. Las pruebas cualitativas pueden ser
generales y aplicables a un grupo de carbohidratos o específicas y características de un
azúcar en particular. Esta clase de cromatografía utiliza como fundamento el hecho de
algunos medios absorbentes como la alúmina y el gel de sílice se colocan para obtener
una superficie óptima y realizar la separación de los componentes de la mezcla
presentes en la muestra.
Después de la separación cromatográfica algunas sustancias presentaron colores propios
debido a su estructura molecular y pueden ser visualizadas por observación directa a la
luz. Existen otras que son invisibles en el espectro de luz visible y su presencia debe ser
determinada utilizando algún agente químico que las haga observable éstos se conocen
como reveladores.

Materiales y reactivos

Papel filtro Frasco lavador

Material de Prueba Mortero y pistilo
Vasos de precipitados Estufa
Embudo Pinzas
Tubos de ensayo Plancha de calentamiento
Pipetas Cámara de cromatografía
Probeta Capilares
Balanza Jugos de frutas.
Varilla de vidrio Leche en polvo descremada
Termómetro Placas de sílica gel de 5 cm x 10 cm.
Solventes de cromatografía
  Eluyente para cromatografía: Butanol - acido acético – agua: 4:1: 4. Mezcle
inicialmente el butanol con el agua y espere 15 minutos; posteriormente
adicione el ácido acético.

 Solución Reveladora : Anilina – difenilamina – ácido fosfórico 5:5:1. Mezcle 5

volúmenes de solución de anilina (100 mg/ 10 ml en acetona) con 5 volumenes
de solución de difenilamina (100 mg/ 10 ml en acetona )y 1 volumen de ácido
fosfórico al 85%.

 Patrones de carbohidratos prepare volúmenes pequeños 10g/L en isopropanol

al 10% v/v de glucosa, fructosa, lactosa, galactosa, sacarosa, almidón, ribosa,
almidón. Prepare 5 ml de cada uno de los patrones, guarde en el congelador las
soluciones sobrantes.

Acido acético 10%, carbonato de calcio, etanol 95%, carbón activado

PROCEDIMIENTO

Preparación de los extractos de frutas

Colocar en un mortero la pulpa de la fruta (papaya, manzana o remolacha) macerar,, y

con ayuda de una gasa obtener el extracto para evitar residuos sólidos. Tome 3 ml del
extracto y adicione 3 mls de etanol y centrifugue para remover la proteína
desnaturalizada.
Sembrar en una placa de cromatografía en capa fina con ayuda de un capilar 4μL de
muestra (extracto de fruta), lactosa (extraída a partir de la leche), y soluciones
patrones de azucares previamente preparadas (glucosa, fructosa, lactosa, galactosa,.
Sacarosa, ribosa y almidón.) a espacio de 1, 5 cm y a una distancia de 1, 5 cm del
borde inferior de la placa, dejar entre la última muestra sembrada un espacio de 1cm
para sembrar los patrones a espacios de 1cm respectivamente. Coloque la lámina en una
cámara cromatográfica con 50ml de mezcla de solventes: n- butanol – ácido acético –
agua (4: 1: 4). Inicialmente adicione n-butanol y agua, mezcle y espere 15 minutos,
posteriormente el ácido acético y mezcle. (Presaturación de la cámara de cromatografía
aproximadamente 1 hora antes de colocar la placa). Desarrolle la lámina hasta cuando el
frente del solvente haya migrado casi hasta el extremo (aproximadamente 8,5 cms) esta
es la distancia que el solvente recorre en una hora. Marque con una línea de lado a lado
el frente de migración del solvente. Secar totalmente la placa en el horno a 37 0C, hasta
eliminar el olor del solvente.
Luego revele con solución de ninhidrina (0.5g en 50ml de acetona antes de usarse),
posteriormente coloque la placa en el horno a 100 0C, durante 10 minutos
aproximadamente, inmediatamente colocar el cromatograma en cámara de yodo.
Dibuje las manchas reveladas y mida las distancias de migración para calcular los
Rf, identifique los carbohidratos presentes en la muestras.
 PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOS

Para la realización de las pruebas cualitativas de los carbohidratos utilice los patrones de
carbohidratos previamente preparados y uno de los extractos de frutas y reporte los
azucares posibles que se encuentren en dicho extracto, teniendo en cuenta también los
resultados cromatográficos.

Consultar el fundamento químico de las pruebas.

Prueba Procedimiento Volumen VOLUMEN

En un tubo de ensayo colocar:

P. de Molish Sustancia problema 0.5 ml

R. de Molish: 2 gotas
α-naftol al 10% en etanol
Mezclar
H2SO4 concentrado 0,3 ml
Dejar caer lentamente de por las paredes del
tubo. La aparición de un anillo violeta-rojizo
en el sitio de contacto de los dos líquidos,
indica que la muestra contiene carbohidratos.
0.5 ml
P. de Barfoed Sustancia problema
Reactivo de Barfoed 1,5 ml
Acetato de cobre cristalizado 13,3 g en 200 ml
de H2O destilada. Filtrar si es necesario.
Añadir 1.8 ml de ácido acético glacial
(CH3COOH).
Mezclar y calentar en baño de agua hirviente,
contando los minutos y sacar del baño cada
tubo inmediatamente después que haya
aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O.
Anotar el tiempo que corresponda a cada
carbohidrato.
La aparición de un precipitado rojo, antes de
los 6 min. Indica la presencia de un
monosacárido. La aparición de un escaso
precipitado rojo, entre 9 y 12 min indica la
presencia de Lactosa o Maltosa.
 Sustancia problema 0.5 ml
P. de Bial
Reactivo de Bial 1 ml
300 ml de HCl concentrado en 250 ml de H2O
destilada, añadir 1,5 g de orcinol y 8 gotas de
cloruro férrico al 1% (Cl3Fe.6H2O)
Mezclar 1 ml
Llevar a baño de maría hirviente durante 3
min. La aparición de un color verde botella,
brillante y totalmente transparente, indica la
presencia de una pentosa. Algunos azucares
dan con el Bial una coloración verde, pero está
es opaca.
Prueba Procedimiento Volumen
En un tubo de ensayo colocar:

Sustancia problema 0.5 ml

P. de Seliwanoff
Reactivo de Seliwanoff: 1 ml
Resorcinol al 0.5 % en H2O, tomar 3 ml
añadir 12 ml HCl concentrado, añadir H2O
c.s.p. 35ml.
Llevar a baño de María hirviente durante
10min. La formación de un color rojo cereza,
indica la presencia de fructosa.
Sustancia problema 1 ml
P. de Lugol
Reactivo de Lugol: 1 gota
A 5 g de Iodo y 10 g de K añadir H2O c.s.p
100 ml
Mezclar y observar. La aparición de una
coloración azul indica la presencia del almidón
y una coloración roja, indica el glucógeno o
eritrodextrina. Si el color no cambia, el
carbohidrato es un monosacárido o un
disacárido.

Sustancia problema 0.5 ml

P. de Benedict Reactivo de Benedict
Mezclar 1ml
 Llevar a baño de María hirviente por 5 min.
La aparición de un precipitado verde, amarillo
o rojo indica la presencia de un azúcar
reductor.
Sustancia problema 2 ml
P. de Fenilhidrazina
Reactivo de fenilhidrazina. 0.5 ml
Se mezclan fenilhidrazina, ácido acético
glacial y agua destilada en una proporción de
1:1:4
Mezclar bien
Coloque los tubos en agua de baño hirviendo
durante 10 min.
Al final del período de calentamiento, enfrié
los tubos en chorro de agua
Dejar en reposo durante 5 min
Examinar al microscopio la forma
característica de los cristales de osazona,
colocando con mucho cuidado una gota en el
portaobjeto. Cubrir con la laminilla
cubreobjeto evitando dañar los cristales con
movimientos bruscos o exceso de muestra.

1.5.3 HIDRÓLISIS ÁCIDA DE DISACARIDOS

Tome dos tubos de ensayo y siga el siguiente procedimiento:

Tubo Solución Volumen de la solución HCl 1 N H2O

disacárido del disacárido (ml) (ml) (ml)
1 Lactosa 1 (muestra problema) 1 0
2 Lactosa 1 (Patrón) 0 1

Seguidamente:
1. Hervir simultáneamente los tubos en baño de María durante 1 min.
2. Neutralizar el tubo 1 añadiendo 7 gotas de NaOH 1 N y 7 gotas de agua al tubo 2
3. A cada tubo añada 0.5 ml de Benedict y lleve a baño de María por 2 min.
4. Observe los resultados y anote en su informe.

CUESTIONARIO
1. Explique por qué el monosacárido gliceraldehido da negativa la P. Molish.
 2. Cuales son las aplicaciones prácticas de las pruebas estudiadas.

3. Los carbohidratos obtenidos corresponden a lo esperado por usted? Justifique

su respuesta.

4. Dibuje los monosacáridos glucosa, galactosa, ribosa y fructosa, clasifíquelos

según el número de átomos de carbono y la función principal.

5. Efectué un enlace hemiacetálico y uno hemicetálico, escriba las diferencias entre

ambos enlaces.

6. Escriba las funciones: aldehídica, cetónica, alcohólica, ácida, colóquelas en

Orden de reactividad y explique el por qué de ese orden.

7. Explique en que consiste la hidrólisis ácida de disacáridos.

8. Escriba y compare las fórmulas de la maltosa y la trealosa.

9. Defina los siguientes términos: azúcar reductor y azúcar no reductor, cite

ejemplo

10. Efectué un enlace glucosídico.

11. Defina los siguientes términos: carbono anomérico, centro quiral, levorrotatorio.

12. Qué condiciones debe reunir el solvente para realizar una eficiente separación de
los componentes de una mezcla.

13. Explique porqué muchos adultos son intolerantes a la Leche, los mamíferos en
sus primeras etapas de desarrollo su mayor fuente de energía y alimento
fundamental es la leche, pero en los humanos se puede presentar problemas
digestivos asociados a diarreas y cólicos entre otros por su consumo, a que se
debe esto y proponga alternativas para la solución del problema.

14. Cual son las proteínas presentes en la leche, Explique como puede usted
separar las proteínas a partir de este procedimiento.

15. Consultar en que consiste el proceso de pasteurización de la leche y para que se

realiza este proceso.

Bibliografía
Lenhninger, Nelson, Cox. Principles of Biochemistry. Worth Publisher. Cuarta edición,
2005.

Bohinki. Addison - Wesley Iberoamericana. Bioquímica. Quinta edición, 1.991.

Devlin, Thomas M. Editorial Reverte. Bioquímica. Volumen 2, 2000.

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Anzola, Cecilia y López, E. Guías de laboratorio de Bioquímica. Universidad

Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias. Departamento de Química , 2005.

Bacca, Cecilia y Bermúdez, M. Manual de Bioquímica. Universidad INCCA de

Colombia.1994.