LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Angela Viviana Ruales Salcedo

HIDROLISIS ENZIMÁTICA DE ALMIDÓN:

DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS

Echeverri G. Ximenaa, Fierro L. Dayanab, Ruiz M. Cristianc, Sánchez L. Yeisond & Ovalle Q. Juane.

Laboratorio de bioquímica
Departamento de Ingeniería Química
Facultad de Ingeniería y Arquitectura
Universidad Nacional de Colombia - Sede Manizales

e-mail: lxecheverrigut@unal.edu.coa, defierrol@unal.edu.cob, ysanchezl@unal.edu.cob,

crcruizmo@unal.edu.cob, jpovalleq@unal.edu.cob

1. INTRODUCCIÓN orientado en una posición donde es más

La hidrólisis es una reacción química en la que
se disocia el agua en H+ y OH- por la acción de
una molécula que se combina con una especie u
otra. (1) Es decir, uno de los fragmentos del par
molecular recibe una molécula de hidrogeno,
mientras que el otro grupo acepta un grupo
hidroxilo.
AB + H2 O ⇄ AH + BOH
Fig. 1 Reacción hidrólisis
Las reacciones de hidrólisis consisten
generalmente en el rompimiento de
macromoléculas tales como polipéptidos, los
polisacáridos y los ácidos nucleicos. (2) En las
reacciones de hidrolisis industriales se emplean
dos tipos de catalizadores, agentes ácidos y
agentes enzimáticos.
Las enzimas, o catalizadores biológicos, son
moléculas de naturaleza proteica que
disminuyen la energía de activación de las
reacciones que catalizan, de forma que se
aceleran sustancialmente la tasa de reacción, sin
ser modificada o consumida en la misma. Los
catalizadores no modifican los equilibrios de la
reacción.
Una reacción catalizada enzimáticamente se
lleva a cabo dentro de una región de la enzima
denominada sitio activo o cavidad catalítica. El
sustrato queda fijado en el sitio activo,
probable que ocurra la reacción. Esta unión da
lugar a la formación temporal del complejo
enzima-sustrato que aumenta la eficacia de la
reacción por disminución de la energía
requerida para la ruptura y formación de nuevos
enlaces, sin que se requiera un aumento elevado
de la temperatura. (3). Una reacción enzimática
sencilla puede describirse de la siguiente
manera (Fig.2). E, S y P representan enzima,
sustrato y producto, respectivamente. ES y EP
son complejos del enzima con el sustrato y con
el producto.
𝑘1 𝑘2
E + S ⇄ ES → E + P
𝑘_1
Fig. 2 Reacción enzimática
El comportamiento cinético de una amplio
número de reacciones enzimáticas se puede
modelar empleando la ecuación de Michaelis–
Menten (Ec.1) modelo válido para condiciones
de estado estacionario, es decir, cuando [𝐸𝑆] es
constante. (4)
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉= Ec.1
𝐾𝑚 + [𝑆]
La expresión anterior puede transformarse en la
Ecuación de Lineweaver-Burk (Ec.2), útil en la
determinación de los parámetros 𝐾𝑚 y 𝑉𝑚𝑎𝑥 .
1 𝐾𝑚 1 1
=( ) + Ec.2
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

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Durante la experiencia en el laboratorio se Amilosa

pretende determinar experimentalmente los
parámetros cinéticos de la enzima α-amilasa, en
la hidrólisis del almidón grado analítico
empleando la linealización de la ecuación de
Michaelis Menten (Ecuación de Lineweaver-
Burk), es decir el método de velocidades
iniciales.
La amilosa es un polímero de cadena lineal
formado de unidades D-glucosa unidas
mediante enlaces α-1,4. Poseen un extremo no
reductor y otro reductor. Su peso molecular
varía entre algunos miles y 150.000Da. La
estructura de amilosa se muestra en la figura 3.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Fig. 3 Estructura molécula de amilosa, tomado de (7)
Determinar los parámetros cinéticos de la
Amilopectina
enzima α-amilasa en almidón grado analítico.
La amilopectina es el componente mayoritario
de almidón, supone entre el 70 y 80% en peso.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Es un polímero de unidades de D-glucosa de
- Realizar una revisión bibliográfica
cadenas ramificadas de longitud mediana (20 a
para determinar las condiciones
35 unidades) con enlaces glucosídico en la
óptimas para llevar acabo la hidrólisis
cadena principal de tipo α-1,4 y con enlaces α-
de almidón con α-amilasa.
1,6 en los puntos ramificados, formando de esta
manera una estructura ramificada. Su peso
- Determinar la eficiencia catalítica del
molecular oscila en el intervalo comprendido
proceso de hidrólisis enzimática.
entre 106 y 107 Dalton. Alrededor del 4.5% de
las unidades de glucosa están implicadas en los
- Comprender el proceso de hidrólisis
enlaces α-1,6. Los almidones formados
enzimática del almidón.
exclusivamente de amilopectinas se conocen
como almidones céreos. En la figura se expone
- Aplicar los conocimientos teóricos
la estructura de la molécula de la amilopectina.
adquiridos durante la
fundamentación.

3. MARCO TEORICO

Almidón
El almidón es un homopolisacárido de reserva
producido por las plantas, constituye una fuente
esencial de energía para todos los organismos
vivos. El almidón se presenta en forma de
gránulos redondeados cuyos tamaños oscilan
entre 2 y 100 µm. Este polímero de glucosa
anhidra está químicamente integrado por dos
componentes: la amilosa y la amilopectina. (5)
Ambas son moléculas de alto peso molecular,
influyen de manera determinante en las
propiedades sensoriales y reológicas del
almidón. (6)
Fig. 4 Estructura molécula amilopectina, tomado de (7)
Hidrólisis de almidón
La hidrólisis del almidón está compuesta por 3
etapas: gelatinización, licuefacción o
dextrinizacion y sacarificación. Gelatinización:
Cuando el almidón es calentado en exceso de
agua entra en una fase de transición; fase
asociada a una difusión de agua dentro del
gránulo, hidratación, pérdida del orden de
región cristalina y lixiviación de la amilosa y

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amilopectina. Licuefacción: es el proceso Tabla 1. Propiedades de algunas α-amilasas de

mediante el cual a partir de un almidón origen microbiano, tomado de (8)
gelatinizado se obtiene una rápida disminución
de la viscosidad en virtud de una hidrólisis
parcial. Se presenta cuando la enzima α-amilasa
corta las cadenas de los polímeros amilosa y
amilopectina en cadenas de tamaño regular,
dando como resultado dextrinas, maltosa,
maltotriosa y maltopentosa (se puede generar
durante o después de gelatinizar el almidón). La
hidrólisis total del almidón a glucosa (a partir de
la maltodextrosas producidas en la etapa
anterior) se denomina fase de sacarificación. En
la hidrólisis almidones hay muchas variables
del proceso que influyen de manera importante
en la degradación hidrolítica. Entre las que cabe
resaltar el tamaño de partícula, relación de
amilosa:amilopectina, extensión de la
asociación molecular entre los componentes del
almidón, grado de cristalinidad, longitud de la
cadena de amilosa y presencia de complejos
lípidos-amilosa, entre otros. (6)
4. METODOLOGÍA
α-Amilasa
4.1. MATERIALES Y EQUIPOS
La enzima α-amilasa, también denominada α-
Materiales
1,4-glucanohidrolasa, es una glucanasa
Almidón grado analítico
endoactiva que cataliza la hidrólisis de la
Solución buffer (para rango pH en enzima)
cadena lineal (amilosa) y la ramificada
Enzima: α-amilasa
(amilopectina) del almidón rompiendo al azar
Agua destilada
los enlaces α-1,4 glicosídicos para formar
Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
glucosa, maltosa y una mezcla de dextrinas, que
contienen enlaces ramificados de formados por
Equipos
moléculas de glucosa que presentan enlaces α-
Espectrofotómetro
1,6 provenientes de las uniones glicosídicas de
Baño termostático
la estructura original.
pH-metro
Cronometro
Las condiciones óptimas del proceso operación Tubos de ensayo
de hidrolisis depende fundamentalmente del Pipeta
origen de la α-amilasa empleada (plantas, Pera
animales y microorganismos). Existen α- Termómetro
amilasas de origen bacteriano o fuentes Bureta
fúngicas, siendo estas últimas las más utilizadas Gradilla
a nivel industrial. En la tabla 1 se exponen Toallas adsorbentes
algunas propiedades de estas enzimas.

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4.2. METODOLOGÍA curva de calibración de absorbancia en función

de concentración. Para obtener la curva se
 Preparación de soluciones deben preparar una serie de soluciones de
glucosa de distinta concentración (ver tabla 3).
Solución de ácido 3,5-dinitrosalicílico: Más adelante se aplica el método DNS a cada
Disuelva 5g de 3,5-dinitrosalicílato por solución, y se lee la absorbancia en un
calentamiento en 100 mL de NaOH 0,2 N; espectrofotómetro a una longitud de onda
adicione 250 mL agua y 150 g de tartrato de 540nm. Con los datos recogidos se elabora la
sodio y potasio. Lleve a 500mL con agua curva de calibración requerida para análisis
destilada. posteriores.
Solución buffer: Tabla 3. Serie de soluciones de glucosa.
La elección de la solución buffer depende de la
personalidad de la enzima. Durante el Agua
Concentración Glucosa
Tubo destilada
laboratorio se empleará α-amilasa de Bacillus (g/L)
(mL)
25% (mL)
subtilis, Según la literatura consultada (ver tabla 0 0 5 0
1 12,5 4,75 0,25
1.) este tipo de enzima funciona un intervalo de
2 25 4,5 0,5
pH de 6,5 a 7.5. Basándonos en esta 3 37,5 4,25 0,75
información se utilizará una solución buffer de 4 50 4 1
5 62,5 3,73 1,25
fosfatos, puesto que maneja el intervalo de pH
6 125 2,5 2,5
requerido. 7 200 1 4
Solución buffer fosfatos: disolver 27.6 g de 8 250 0 5
NaH2 PO4 ∙ H2O en 100 mL de agua destilada,
53.65 g de Na2 HPO4 7 ∙ H2O disolver en Hidrólisis enzimática
solución, llevar el volumen final a 1 L.  Gelatinización:
Se prepara una disolución madre de almidón de
Tabla 2. Soluciones amortiguadoras. Tomada de (9) 1.0% (p/v) en tampón fosfatos 0.1M (pH 7.5).
La disolución se calienta durante 5 minutos a
Buffer
Amortiguador Acido Base pKa pH una temperatura de 37°C.
[M]

Acetatos
CH3COOH CH3COONa
4.74 4.74 2.0  Velocidades iniciales:
[1.0 M] [1.0M]
NaHPO4 Na2HPO4 Rotule 6 tubos de ensayo como sigue: B
Fosfatos 7.2 7.50 1.5
[0.5M] [1.0M] (blanco), 𝑆1 , 𝑆2 , 𝑆3 , 𝑆4 y 𝑆5 . Agregar a cada tubo
NH4CL NH3
Amoniacal
[0.15M] [0.45M]
9.24 9.71 0.60 de ensayo las cantidades de solución de
NaHCO3 Na2CO3 almidón, buffer (pH 7.5) y agua que se indican
Carbonatos 10.33 10.38 0.15
[0.07M] [0.08M] en la tabla 4.

Curva de calibración de glucosa (DNS) Tabla 4. Cantidad de reactivos para determinar

Determinación de azucares reductores: El velocidad de reacción a diferentes concentraciones
método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) es de sustrato. Tomada de
método espectrofotométrico basado en una Tubo B 𝑆1 𝑆2 𝑆3 𝑆4 𝑆5
reacción REDOX que ocurre entre el ácido y los Concentración 5.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
de sustrato
azúcares reductores presentes en la muestra. (mg/mL)
Solución a - 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
α-amilasa (mL)
El método DNS tiene la capacidad de oxidar a Solución de 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
los azúcares reductores dando resultados sustrato (mL)
Agua 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
colorimétricos que se pueden medir con una
longitud de onda de entre 540 nm y 570 nm en
Someta los tubos de ensayo a baño maría a 37°C
el espectrofotómetro. La concentración de
por 7 minutos. Si es necesario modifique el pH
azúcares reductores se determina utilizando una

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hasta el óptimo (7.5), puede emplear HCl o
NaOH según lo requiera. A continuación,
añada, a cada tubo de ensayo, la cantidad de
enzima especificada en la tabla, homogenice y
deje incubando por 15 minutos. Determine
azucares reductores en los tubos de ensayo a los
siguientes tiempos: 3, 6, 9, 12 y 15 minutos.
Para determinación de los azucares reductores
presentes en las muestras en los tiempos
propuestos se empleará el método DNS. En este
procedimiento se mezclan 0,5 mL de la muestra
con 0,5 mL del reactivo DNS, luego se lleva a
baño termostático por 5 minutos e
inmediatamente se detiene la reacción con baño
de hielo. Se agrega 5 mL de agua destilada, se
agita y se deja en reposo por 15 min. Finalmente
se determina el valor de la absorbancia para una
longitud de onda de 540nm. La concentración
de los azúcares reductores totales liberados en
la muestra se calcula con la curva de calibración
obtenida previamente, la cual determina la
absorbancia en función de la concentración.
(10). Adicionalmente se debe calcular un
blanco, este se prepara usando el mismo método
descrito anteriormente con la salvedad de que
no se adiciona enzima. Cuando la absorbancia
de una muestra sobrepasa el límite superior del
espectrofotómetro, es necesario diluir con agua
destilada. Si por el contrario es menor al límite
inferior se requiere repetir el ensayo con una
mayor cantidad de solución de glucosa. Para
tener una mayor fiabilidad de los resultados es
recomendable trabajar por duplicado. (11)
Bibliografía
1. Flores J, Caballero C, Moreira MA. Una
interpretación aproximativa del concepto de
hidrólisis en estructuras peptídicas en un curso
de bioquímica del IPC en el contexto de la
teoria de los campos conceptuales de
Vergnaud. ; 2008.
2. Villada Pinilla WA. Determinación
experimental de las condiciones de operación.
Tesis de grado. Bogotá D.C.: Universidad
Nacional de Colombia, Facultad de
Ingeniería; 2010.
3. Puerta Gómez AdP. Unidad didáctica para la
enseñanza de las enzimas apoyada en TIC bajo
el modelo enseñanza para la comprensión.
Bogotá D.C.: Universidad Nacional de
Colombia, Facultad de Ciencias; 2013.
4. Universidad Pablo de Olavide Sevilla.
Práctica 5, Cinética enzimática:
Determinación espectofotométrica de la
constante de Michaelis-Menten de la papaína.
[Online]. [cited 2019 02 24. Available from:
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/do
cencia/biotec_termo/Practica5TyCQ0506.pdf
.
5. Martínez Gallegos JF. Utilización de α-
amilasas en la formulacion de detergentes
industriales. Tesis doctoral. Granada:
Universidad de Granda, Facultad de Ciencias;
2005.
6. Cruz Ruiz KA. Modelado del proceso de
hidrólisis enzimática de almidones
gelatinizados del fruto de la planta de banano.
Tesis. Medellín: Universidad Nacional de
Colombia , Facultad de Minas; 2012.
7. Meneses J, Corrales CM, Valencia M. Síntesis
y caracterización de un polímero
biodegradable a partir de almidón de yuca.
Articulo. Envigado: Escuela de Ingeniería de
Antioquia.; 2007.
8. Pandey A, Poonam N, Soccol CR, Soccol VT,
Singh D, Mohan R. Advances in microbial
amylases. Biotechnology and Applied
Biochemistry 31; 2000.
9 Universidad Autónoma Metropolitana.
. Práctica 4 Disoluciones amortiguadoras.
[Online]. [cited 2019 02 24. Available from:
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/gmt
a/practicas_QA_Nuevo_plan/PRACTICA_4.
pdf.
10. Ávila Núñez R, Rivas Pérez B, Hernández
Motzezak R, Chirinos M. Contenido de
azúcares totales, reductores y no reductores en
Agave cocui Trelease. Artículo. Santa Ana de
Coro: Universidad del Zulia; 2012.
11. Nacional Ip. ENZINETIC-UPIIG. [Online].
[cited 2019 02 24. Available from:
https://sites.google.com/site/enzineticupiig/8-
cinetica-enzimatica/8-1-metodologia.
[Página 5 / 5]