Identificación de los microrganismos

La identificación de microorganismos de forma rápida y segura es condición indispensable para

las empresas que operan en la producción de alimentos. La tipología de casuísticas en las que

esto es necesario es muy amplia y diversa, las más comunes son:

Por temas de seguridad alimentaria: Cuando se detectan indicios de contaminación en un

producto es necesario identificar a la mayor brevedad posible y con el mayor nivel de

rigurosidad el microorganismo causante. Esto es frecuente con productos propensos a

la contaminación por patógenos como la Salmonella, E.Coli o Listeria monocytogenes.

Cómo se trabaja en la identificación de microorganismos en los laboratorios de control de

alimentos

Para identificar microorganismos son imprescindibles equipos avanzados y un personal técnico

cualificado, por lo que en AINIA aconsejamos contar con laboratoriospreparados para ello.

Aunque la tecnología hoy es variada, un equipamiento imprescindible es contar con

un espectrómetro de masas MALDI-TOF o MALDI-Biotyper, que permite la identificación

rápida de microorganismos mediante la comparación del espectro proteico de los

microorganismos frente a una amplia base de datos.

También se hace necesario dominar las técnicas de

secuenciación de ADN y de identificación molecular, así

como de caracterización y tipificación a nivel de

cepa,utilizando técnicas como la REP-PCR.

 Microscopio

Es una herramienta que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser

observados a simple vista. El tipo más común y el primero que fue inventado es el microscopio

óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene dos lentes que permiten obtener una

imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. La ciencia que investiga los objetos

pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía.

Microscopio compuesto fabricado hacia 1751 por Magny. Proviene del laboratorio del duque de

Chaulnes y pertenece al Museo de Artes y Oficios, París.

El microscopio fue inventado por Zacharias Janssen en 1590. En 1665 aparece en la obra

de William Harvey sobre la circulación sanguínea al mirar al microscopio los capilares

sanguíneos, y Robert Hooke publicó su obra Micrographia.

En 1665 Robert Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y notó que el

material era poroso; contenía cavidades poco profundas a modo de celditas a las que

llamó células. Se trataba de la primera observación de células muertas. Unos años más

tarde, Marcello Malpighi, anatomista y biólogo italiano, observó células vivas. Fue el primero en

estudiar tejidos vivos al microscopio.

A mediados del siglo XVII el holandés Anton van Leeuwenhoek, utilizando microscopios

simples de fabricación propia, describió por primera

vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos.

El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación

científica, puede considerarse el fundador de

la bacteriología. Tallaba él mismo sus lupas, sobre pequeñas

esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el

milímetro (su campo de visión era muy limitado, de décimas

de milímetro). Con estas pequeñas distancias focales

alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la

sangre, las bacterias y los protozoos; examinó por primera

vez los glóbulos rojos y descubrió que el semen contiene espermatozoides. Durante su vida no

reveló sus métodos secretos, y a su muerte, en 1723, 26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal

Society de Londres.

Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por la

asociación de Chris Neros y Flint Crown, obtenidos en 1740 por H. M. Hall y mejorados

por John Dollond. De esta época son los estudios efectuados por Isaac Newtony Leonhard Euler.

En el siglo XIX, al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con

combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al mercado objetivos

acromáticos excelentes.
Tipos de microscopios

 Microscopio óptico

 Microscopio simple

 Microscopio de luz ultravioleta

 Microscopio de fluorescencia

 Microscopio petrográfico

 Microscopio de campo oscuro

 Microscopio de contraste de fases

 Microscopio de luz polarizada

 Microscopio confocal

 Microscopio compuesto

 Microscopio electrónico

Tipos de medios cultivos

Medios nutritivos: son aquellos que poseen los

componentes mínimos para que pueda producirse el

crecimiento de bacterias que no necesiten

requerimientos especiales. El medio más conocido

de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que

resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.

b) Medios de enriquecimiento: incorporan una serie de factores que resultan indispensables

para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de

sangre u otros productos biológicos que aportan dichos factores. Un ejemplo de este tipo es el

Agar Chocolate.

c) Medios selectivos: son utilizados para favoreces el crecimiento de ciertas bacterias contenidas

en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar

nutricionalmente el crecimiento de una población polimicrobiana específica. Un ejemplo de estos

medios es el Caldo Selenito.

d) Medios inhibidores: cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente

el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores

podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Un ejemplo de

este tipo de medios es el Mac-Conkey.

e) Medios diferenciales: se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que

ayuden a diferenciar géneros o especies. Algunos ejemplos de este tipo de medios de cultivo son

el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente

diferencial), entre otros.

f) Medios de identificación: son los destinados a comprobar alguna cualidad especifica que

puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios deben poseer

los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de microorganismos, el sustrato específico

que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. Ejemplos de estos

medios es el Agar Kligler y el Simmons.

g) Medios de multiplicación: sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un

microorganismo ya aislado. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de

estos medios.
Características de medio de cultivo

Crecimiento microbiológico

El crecimiento bacteriano es la división de una bacteria en dos células hijas en un proceso

llamado fisión binaria. Suponiendo que no se produzca ningún caso de mutación las células hijas

resultantes serán genéticamente idénticas a la célula original. De este modo tiene lugar la

"duplicación local" de la población bacteriana. Las dos células hijas creadas tras la división no
sobreviven necesariamente. Sin embargo, si el número de supervivientes supera la unidad, en

promedio, la población bacteriana experimenta un crecimiento exponencial. La medición de una

curva del crecimiento exponencial de las bacterias en un cultivo ha sido tradicionalmente una

parte de la formación de todos los microbiólogos. Los procesos fundamentales empleados para

ello son la enumeración bacteriana (conteo

bacteriano) por métodos directos e individuales

(microscopía, citometría de flujo), por métodos

directos y masivos (biomasa), por métodos

indirectos e individuales (conteo de colonias), o

por métodos indirectos y en bloque (número más

probable, turbidez, absorción de nutrientes). Los modelos permiten conciliar la teoría con las

mediciones.

Pruebas de esterilidad

Preparar los medios de cultivo a partir de medios deshidratados comerciales o preparados en base

a sus formulaciones. Ajustar el pH con soluciones 1N de hidróxido de sodio o 1N de ácido

clorhídrico para que, después de esterilizar en autoclave, se obtenga el valor indicado en cada

caso. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Medio A. Medio fluido de cioglicolato

Mezclar los ingredientes hasta que estén completamente disueltos en agua, calentar si es

necesario. Ajustar el pH, calentar nuevamente sin hervir y filtrar a través de papel filtro

humedecido. Añadir la solución de resarsurina de sodio y envasar en tubos adecuados.

Esterilizar. El medio presenta coloración rosa superficial por la oxidación del mismo, la cual no
debe rebasar la tercera parte del volumen total. Si la coloración es mayor, se puede calentar una

vez en baño de agua hasta que la coloración desaparezca. Usarse cuando la coloración se

reestablezca a la décima parte del volumen total del medio.

Medio B. Medio fluido de tioglicolato con polisorbato 80

Preparar el medio como lo realiza para el medio A, adicionar por cada litro de medio 50 mL de

polisorbato 80. Esterilizar.

Medio C. Medio Fluido de tioglicolato con penicilanasa

Preparar el medio como se indica en el medio A. A cada tubo de medio estéril adicionar

suficiente penicilinasa estéril para inactivar la penicilina presente en la muestra.

Medio D. Medio fluido de tioglicolato con polisorbato 80 adicionado de penicilinasa

Preparar el medio como indica medio B. A cada tubo con medio estéril, adicionar suficiente

penicilinasa para inactivar la penicilina presente en la muestra.

Medio E. Caldo soya tripticaseína

Disolver los ingredientes en 500 mL de agua, calentando suavemente hasta que la disolución sea

completa y llevar al aforo a 1000 mL. Ajustar el pH, filtrar y envasar en tubos adecuados.

Esterilizar.

Medio F. Caldo soya tripticaseína con polisorbato 80

Preparar el medio como se indica en el medio E. Adicionar 5 ml de polisorbato 80 por cada litro

de medio.

Medio G. Caldo soya tripticaseína con penicilinasa

Preparar el medio como se indica en Medio E. Adicionar la cantidad suficiente de penicilinasa

para inactivar la penicilina presente en la muestra.

Medio H. Caldo soya tripticaseína con polisorbato 80 adicionado de penicilinasa

Preparar el medio como se indica en medio F. A cada tubo con medio estéril adicionar suficiente

penicilinasa estéril para inactivar la penicilina presente en la muestra.

Solución I. Solución al 1% de peptona

Disolver un gramo de digerido péptico de tejido animal en 1000 mL de agua destilada, filtrar y

ajustar el pH a 7.1±0.2, Distribuir en envases conteniendo 100 mL cada uno y esterilizar.

Solución II. Solución al 1% de peptona con polisorbato 80

Preparar la solución como se indica en I. Agregar 1 mL de polisorbato 80 por cada litro de

solución. Envasar y esterilizar.

Solución III. Solución al 0.85% de cloruro de sodio

Disolver 8.5g de cloruro de sodio en agua destilada y llevar al aforo a 1000 mL, distribuir en

envases conteniendo 100 mL cada uno y esterilizar.

Solución IV. Solución de peptona y extracto de carne con polisorbato 80

Disolver los ingredientes en agua destilada, llevar al aforo a 1000 mL, ajustar el pH, envasar y

esterilizar.

Solución V. Solución de penicilinasa

Preparar la solución de penicilinasa y valorarla en unidades Levy. Esterilizar la solución de

penicilinasa por filtración a través de membrana.

Solución VI. Meristato de isopropilo

Utilizar meristato de isopropilo esterilizado por filtración a través de membrana con pH del

extracto acuoso de 5.5 o mayor. Determinar el pH del extracto acuoso y envasar en frascos

estériles.

Como se puede observar, es crítico que los medios estén estériles, lo

que se hace mediante esterilización por calor húmedo en la mayoría

de los casos, razón por la cual la autoclave debe estar funcionando

correctamente, en ICLAB contamos con personal calificado y apto

para realizar pruebas de calibración, ajuste y validación de esterilización por éste método.

Preparación de medio de cultivo

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los

microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque

las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco

exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes

que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.

Existen medios cuya composición permite el crecimiento de:

1. un gran número de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud),

2. determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los

denominados medios selectivos.

3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas o test

bioquímicos (utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.).

Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:

1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgánicos (hidratos de

carbono, aminoácidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)

2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones,

indicador de pH, etc.

Durante las prácticas se van a manejar medios de cultivo de

composición muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a

consistencia: medios sólidos, semisólidos y líquidos. Este último

aspecto es importante a la hora de la preparación de los

mismos. Aunque los medios artificiales o sintéticos se pueden

preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden

adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que añadir la

cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composición, la caducidad, y la cantidad que

debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.

Objetivos concretos de la práctica

1. Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los

microorganismos in vitro.
2. Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de

microbiología.

3. Hacer un primer acercamiento a la manipulación de microorganismos. Adquirir la idea de la

importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las técnicas más comunes para realizarlo.

Realización práctica

Preparación de medios de cultivo

Cada mesa de trabajo se encargará de la preparación de una cantidad suficiente de un

determinado medio de cultivo, para ser utilizado, en su momento, por todos los alumnos del

grupo de prácticas. Las instrucciones a seguir dependerán del número de mesa y el medio de

cultivo asignado, pero en todos los casos, los pasos son los siguientes:

1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte de un

preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del

fabricante o del profesor, añadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentración

deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar

el preparado hasta la ebullición del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una

completa disolución del agar (medios sólidos y semisólidos); para medios líquidos no es

necesario calentar, únicamente se agita la mezcla hasta la completa disolución de la misma.

2. Esterilizar la disolución.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el

crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el

procedimiento será diferente:

a) Medios sólidos en placa.- Tapar el matraz con tapón de

algodón y cubrir con papel de aluminio. Llevar a esterilizar

al autoclave (1210C) durante 15-20 minutos. Una vez estéril

repartir en placas de Petri estériles y dejar en reposo para que solidifique.

b) Medios líquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razón de unos 2-4 ml

por tubo, tapar con tapón de aluminio y llevar a esterilizar en autoclave.

Microbiología del ambiente

El estudio de la microbiología es de suma importancia desde que los

microorganismos son parte de nuestra naturaleza. Los

microorganismos han sido de utilidad para el hombre aun desde antes

del conocimiento de su existencia, el estudio de los microorganismos y

el conocimiento sobre ellos ha sido aplicado en el ámbito médico, industrial, económico y

ambiental. El conocimiento de los microorganismos ha servido para evitar pérdidas económicas

en cosechas de productos agrícolas, al conocer los microorganismos patógenos que infectan y

dañan los cultivos y poder saber cómo controlar o evitar que estos microorganismos ataquen los

cultivos.

Microbiología del agua

La microbiología es el campo científico que se ocupa del estudio de los organismos

microscópicos, comúnmente conocidos como microorganismos.

¿Qué son los microorganismos?

Todas las criaturas vivientes están formadas por células. Las células son unas muy pequeñas

unidades básicas de la vida. Son las estructuras mas pequeñas capaces de realizar los procesos

básicos de la vida, tales como absorción de nutrientes y expulsión de desechos. Las células solo

se pueden observar al microscopio.

Los microorganismos son organismos normalmente formados por una sola célula.

Debido a esto, a veces se les denomina “organismos unicelulares”.

Son tan pequeños que los humanos no los podemos visualizar. Solo los podemos ver a través de

un microscopio, mediante el cual las células son agrandadas enormemente.

Al principio, los microorganismos no eran vistos como un tipo

diferente de organismo. Los microorganismos que realizaban

fotosíntesis (ver ciclo del carbono) eran incluidos en el reino

vegetal, y los microorganismos que ingerían alimentos eran

situados en el reino animal. Sin embargo, en el siglo XIX, los científicos identificaron una

amplia variedad de microorganismos con diversas estructuras celulares, estructuras internas muy

específicas, y patrones de reproducción muy específicos que les hicieron darse cuenta de que

estos organismos no pertenecían a los reinos vegetal ni animal.

Microbiología del aire

La Microbiología del aire comienza en el siglo XIX, con Pasteur y Miquel que diseñaron

métodos para estudiaros microorganismos en el aire y descubrir la causa de algunas

enfermedades. Desde entonces numerosos investigadores han trabajado en este campo tanto en el

aire exterior como en recintos cerrados. Las enfermedades transmitidas por el aire, producidas

por bacterias, virus y hongos, son las respiratorias (neumonía, tosferina, tuberculosis,

legionelosis, resfriado, gripe), sistémicas (meningitis, sarampión, varicela, micosis) y alérgicas.

PERMANENCIA

El tiempo que permanecen los microorganismos en el aire depende de la forma, tamaño y peso

del microorganismo y de la existencia y potencia de las corrientes aéreas que los sostengan y los

eleven.

La sedimentación de los microorganismos por gravedad sólo es importante en el aire en calma.

El impacto que sufren las partículas del aire cuando encuentran un obstáculo,es mayor cuando

partículas grandes inciden a altas velocidades hacia objetos pequeños.

El lavado del aire por la lluvia termina rápidamente con el proceso de dispersión,siendo diez

veces más eficiente que la sedimentación y la impactación.

GRACIAS

NECESIDAD DEL ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AIRE.

El aire es un vehículo que puede transportar esporas de hongos y

también bacterias adheridas apartículas de polvo o contenidas en

gotitas microscópicas de líquido (aerosoles). Son los denominados

bioaerosoles. Estos microorganismos pueden alcanzar los

alimentos que están siendo procesados yalterarlos, por lo que es necesario conocer cuál es el

nivel de riesgo que se está corriendo para aplicar medidas correctoras si esto fuese necesario.

Esto tiene una importancia especial en las instalaciones que ponen en contacto con los alimentos
grandes volúmenes de aire (como en los procesos de deshidratación por secado lento o forzado

con chorros de aire).

Microbiología de los alimentos

La microbiología de alimentos es una rama de la microbiología que

se encarga del análisis de la composición microbiana de los

alimentos, mediante técnicas estandarizadas que permiten la

detección de diferentes agentes microbianos3. Esta disciplina asume

el análisis de aspectos positivos que tienen los microorganismos sobre los alimentos, como la

producción de alimentos gracias a microorganismos y también de aspectos negativos que tienen

los microbios sobre los alimentos, como la descomposición de productos alimenticios y la causa

de enfermedades hacía las personas que consumen alimentos contaminados con

microorganismos.

Los microorganismos, como ya lo han fundamentado teóricos especialistas en la

microbiología,se puede decir que vale pico se pueden encontrar en varios hábitats, ya sea en

nuestro cuerpo, alimentos, el suelo, las plantas, el aire y en toda superficie a nuestro alrededor, es

decir los alimentos no son totalmente estériles, debido a que los microorganismos son

omnipresentes, aunque no sean visibles al ojo humano. Gran parte de las enfermedades que son

transmitidas por alimentos contaminados con microorganismos, se deben a la inoculación de

microorganismos ajenos a los microbios comunes de un alimento.

Microbiología del suelo

Microbiología del Suelo. Rama de la microbiología que ha

surgido producto del creciente reconocimiento de los

numerosos procesos llevados a cabo por

las bacterias, hongos y otros microbios en el suelo.