Toxicología

Trabajo Práctico Nº2

Metabolismo de xenobióticos. Actividad Glutatión-S-Transferasa y su

modulación por compuestos inductores. Relevancia en el monitoreo
ambiental.

Profesores:

Gerardo Castro
Maria Eugenia Maciel

Alumnos:

Santiago Fabbro: santi.fabbro@gmail.com

Tomas Ehrenfeld: tomas.uriel.ehrenfeld@gmail.com

2º Cuatrimestre 2018

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Introducción:
En el transcurso de la evolución los animales y el ser humano han adquirido una capacidad
para metabolizar compuestos extraños para el organismo de modo de facilitar su
eliminación. Estos compuestos, denominados xenobióticos (Xb), se encuentran presentes
en los alimentos y en el medio ambiente por lo que inevitablemente entramos en contacto
con ellos. Suelen ser de naturaleza lipofílica, por lo que tienden a acumularse en las grasas
y esto hace que su eliminación sea mucho más problemática, pudiendo acumularse en el
organismo y llegar a desencadenar fenómenos de toxicidad. Gran parte de estos
compuestos sufren reacciones de biotransformación o metabolización que modifican su
estructura química con el fin de facilitar su eliminación y/o detoxificación. Las enzimas
encargadas de realizar estas reacciones de transformación se encuentran
fundamentalmente en el hígado. Estas enzimas pueden metabolizar diferentes compuestos
químicos, tienen baja especificidad de sustrato y pueden ser inducibles por Xb. Las
reacciones involucradas en el proceso de metabolización son múltiples y diversas, y se las
puede subdividir en 2 etapas o fases. Las reacciones de Fase I engloban procesos químicos
de distinta naturaleza (principalmente oxidación, reducción e hidrólisis), cuyo resultado es la
modificación química de las moléculas, introduciendo grupos polares en partes de la
molécula de menor polaridad. Las reacciones de Fase II son reacciones de conjugación, en
las cuales los compuestos hidroxilados o metabolitos procedentes de la Fase I se acoplan a
un sustrato endógeno. Estas reacciones de Fase II resultan en un considerable aumento de
la hidrosolubilidad y, por lo general, también en una disminución de su actividad toxicológica
y/o farmacológica. El objetivo final de la biotransformación de un xenobiótico es obtener
metabolitos menos lipofílicos, más fáciles de eliminar por vía renal o biliar y, por lo general,
menos tóxicos. La exposición crónica a un contaminante ambiental o a un fármaco puede
provocar en diversos tejidos un incremento en la actividad metabolizante, causando un
incremento en la cantidad presente de una enzima, fenómeno denominado inducción
enzimática. Las sustancias inductoras alteran la expresión de enzimas individuales,
aumentando de manera selectiva la capacidad de metabolizar los xenobióticos. La mayoría
de los inductores son capaces de estimular su propio metabolismo, además de provocar el
metabolismo de otras sustancias. Ciertos Xb electrófilos tóxicos como algunos carcinógenos
y fármacos, se conjugan con glutatión GSH (nucleófilo), en reacciones que pueden
representarse:
donde R = un xenobiótico electrófilo R + GSH---> R-S-G
Las enzimas encargadas de catalizar estas reacciones son las Glutatión S transferasas
(GST). Éstas se encuentran localizadas principalmente en el citosol y en menos grado en
las mitocondrias. Protegen a las células de sustancias tóxicas mediante la conjugación del
grupo tiol del glutatión con Xb electrófilos, y de ese modo ayuda a defender a las células
contra los efectos mutagénicos, carcinogénicos y tóxicos de los compuestos. Si los
xenobióticos con potencial tóxico no fueran conjugados con el GSH, quedarían libres para
poder combinarse covalentemente con ADN, ARN o proteínas celulares y así causar un
daño grave a la células. Por lo tanto, es un mecanismo de defensa importante contra ciertos
compuestos tóxicos.
Objetivo:
Evaluar la actividad enzimática GST frente a la acción de inductores, como
biomarcador de exposición y de alteraciones en el metabolismo normal de xenobióticos.

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Técnica:
Determinar la actividad GST según el método de Habig et al (1974), en citosol de
hígado de ratas machos expuestos a concentraciones conocidas de fenobarbital. La GST
cataliza la conjugación del grupo tiol del glutatión con CDNB (2,4- clorodinitrobenceno).
El producto de la reacción, GS-DNB conjugado, absorbe a 340nm. Se emplea como
sustrato CDNB por ser adecuado para la amplia gama de isoenzimas de GST.
El incremento en la absorbancia es directamente proporcional a la actividad de la
GST en la muestra.
Materiales y Equipamiento:
• Muestra biológica: citosol de hígado de animales tratados y controles
• Buffer fosfato 100mM pH 6.5 con 0.1% de Triton X-100
• Solución de glutatión reducido (GSH) 20mM
• Solución de 2,4-clorodinitrobenceno (CDNB) 20mM en etanol
• Agua destilada • Etanol absoluto
• Espectrofotómetro
• Vortex
• Cubetas de cuarzo 1ml
• Viales de vidrio de 4, 15 y 24ml
• Pipetas de vidrio
• Micropipetas automáticas
• Vaso de precipitado
• Hielo
Procedimiento:
Muestra biológica:
La muestra de citosol fue diluída 1/20 con buffer fosfato 100mM pH 6.5 con 0.1% de
Triton X-100. Las ratas macho de la cepa fueron tratadas durante 3 días consecutivos con
80mg de Fenobarbital en Solución fisiológica (NaCl 0.9%) por kilo de peso de animal, vía
intraperitoneal (IP). A los controles solo se les administró Solución fisiológica, IP. Después
de 24 horas de la última dosis los hígados de los animales control y tratados, por separado,
fueron homogeneizados con buffer fosfato 100mM y EDTA 2mM pH 7.4, y centrifugados a
9000xg durante 20min a 4ºC. El sobrenadante obtenido se centrifugó nuevamente pero a
105000xg durante 60min a 4ºC. El pellet obtenido corresponde a la fracción microsomal y el
sobrenadante a la fracción citosólica.
Soluciones para el ensayo enzimático:
30.72mg de Glutatión reducido (GSH) 20 mM fueron disueltod en 5 ml de agua
destilada. Luego, se disolvieron 20.26mg de 2,4-clorodinitrobenceno (CDNB) 20 mM en 5 ml
de etanol absoluto.
Determinación de la actividad de GST:
En cubetas semimicro de cuarzo de 1 ml se hicieron agregados secuenciales de los
reactivos. Se agitaron suavemente con varilla e inmediatamente colocaron en el
espectrofotómetro. Se midieron los cambios de absorbancia en espectrofotómetro a λ 340
nm. La reacción se inicia con la adición del CDNB. Se controló que el tiempo que transcurre
entre el agregado de CDNB y la primer lectura sea de 1 minuto. La primer lectura fue al
minuto de la adición de CDNB y luego se realizaron 5 lecturas más cada 60 seg. De modo
de tener 6 lecturas.

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 Resultados:

Tabla I. Absorbancias obtenidos para los distintos tiempos.

0 1 2 3 4 5 ΔAbs/min Promedio

0.418 0.420 0.423 0.425 0.428 0.431 0.0026

Blanco 0.0066
0.842 0.853 0.864 0.875 0.886 0.895 0.0106

0.739 0.938 1.114 1.272 1.415 1.545 0.1612

Control 0.1652
0.846 1.055 1.244 1.408 1.556 1.692 0.1692

0.885 1.139 1.359 1.547 1.714 1.856 0.1942

Tratad
0.2038
o
0.967 1.257 1.501 1.709 1.883 2.034 0.2134

Dado que en el duplicado del blanco se puso el doble de CNB, para los cálculos
sólo se utilizó el primer blanco que figura en la tabla I.

Utilizando la siguiente ecuación:

𝛥𝐴𝑏𝑠340/𝑚𝑖𝑛 × 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑚𝑙) × 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑛𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑙/𝑚𝑖𝑛 = Ecuación 1
0.0096𝜇𝑀−1 × 1𝑐𝑚 × 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑚𝑙)

Se obtuvieron los valores de actividad de la GST tanto para el control como para la muestra:

Tabla II. Valores obtenidos para la actividad de la enzima GST.

GST(nmol/ml/min)

Control 3387.50

Tratado 4191.67

Conclusión:
Se observó una alteración de la actividad enzimática GST, sin embargo no se
alcanzaron los valores esperados. A pesar de esto, es notable la diferencia en la
actividad de la enzima, lo cual delata la presencia de un xenobiótico. Se pudo
observar un continuo incremento en la absorbancia, lo que se traduce como un
incremento de la actividad de la GST a lo largo del tiempo.