INSTITUTO POLITÈCNICO NACIONAL.

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Métodos de Análisis.

Separación de grupos usando cromatografía

por exclusión.

Alumno: Mondragón Ramos Devay

5QV1 Sec. 3

Prof. Víctor M. Macías Martínez

03 de Mayo del 2019.

Objetivo.

Analizando los parámetros que componen al lecho cromatográfico, el alumno

aprenderá como desalar una proteína a través de la cromatografía por exclusión
molecular.

Fundamento.

La cromatografía de exclusión molecular, o cromatografía en gel, es una técnica

poderosa y particularmente útil para especies de alta masa molecular. Los
empaquetamientos para la cromatografía de exclusión molecular constan de
pequeñas partículas (~10µm) de sílice o polímero que contienen una red de poros
uniformes a los que pueden difundir las moléculas de soluto o de disolvente.
Mientras están en los poros, las moléculas son efectivamente atrapadas y
removidas del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia promedio de las
moléculas de analito depende de su tamaño efectivo. Las moléculas que son
significativamente más grandes que el tamaño de poro promedio del
empaquetamiento son excluidas y, por lo tanto, no experimentan retención, lo que
significa que viajan a la misma velocidad que la base móvil en la columna. Las
moléculas que son apreciablemente más pequeñas que los poros pueden penetrar
a través de laberintos de poros, así que son retenidas por tiempos mayores; son
las últimas en eluir.
Empacamiento de la columna. Se utilizan dos tipos de empaquetamiento de

Resultados.

Tabla 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna.

Volumen de
No. de tubo A615 observada
elución (mL)
1 3 0.0
2 6 0.0
3 9 0.003
4 12 0.005
5 15 0.005
6 18 0.007
7 21 0.008
8 24 0.015
9 27 0.702
10 30 0.523
11 33 0.117
12 36 0.023
13 39 0.009
14 42 0.01
15 45 0.02
 Determinación del volumen vacío.
0.8

0.7

0.6

0.5

0.4
A615

0.3

0.2

0.1

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Vol umen de el uci ón

Figura 1. Volumen vacio, elución de la Dextrana azul

a) ¿Cuál fue el volumen total de la columna? 85.55 mL

b) ¿Cuál fue el volumen de vacío (vo) de la columna? 27 mL

c) ¿Qué importancia tiene determinarlo?

Porque el volumen vacío nos dice a partir de qué punto comenzarán a ser
eluídas las partículas de mayor tamaño, y nada debe ser eluído antes de
ese volumen, de lo contrario, podría haber un error en el perfil de elución.

d) Determine el volumen que ocupa en la columna, el líquido que se encuentra

al interior de la estructura de gel (Vi)y vol del gel solo (Vg)

Vi= 44.15 mL
Vg= 14.4 mL
Calculos
VolumenTotal =volumen vacio+ volumen interno+ volumen de gel
2
Vol T =π∗r ∗h
Vol T =π∗1.1025∗24 .7
VolT =85.55
Agua retenida : 2.5ml en 5 ml de volumen del lecho *Fabricante
1 g−¿ 5 ml 1 g−¿ 2.5 ml
X=17.66 g X=44.15 mL
X −¿ 85.55 ml 17.66 g−¿ x
Vt−Vo−Vi=Vg
85.55 mL−27 mL−44.15 mL=14.4 mL
Vg=14.4 mL

Tabla 2. Separación del sulfato de Amonio y la Albúmina.

Vol. Masa del Masa del tubo
No. de A280nm (NH4)2SO4
Elución tubo vacío con precipitado
tubo observada (mg)
(mL) (g) seco (g)
1 3 0.0 - - -
2 6 0.0 - - -
3 9 0.0 - - -
4 12 0.0 - - -
5 15 0.0 -- - -
6 18 0.0 - - -
7 21 0.0 - - -
8 24 0.221 - - -
9 27 0.523 - - -
10 30 0.012 8.605 8.63 0.025
11 33 0.010 6.709 6.738 0.029
12 36 0.008 5.306 6.72 1.414
13 39 - 8.616 8.673 0.057
14 42 - 6.602 6.646 0.044
15 45 - 7.475 - -
16 48 - 7.722 - -
17 51 - 8.587 - -
18 54 - 6.330 - -
19 57 - 8.575 - -
20 60 - 5.231 - -
21 63 - - - -
22 66 - - - -
23 69 - - - -
24 72 - - - -
25 75 - - - -
Figura 2. Perfil de elución de la albúmina y sulfato de amonio
a) ¿Qué sustancia eluyó primero y cual después? Explique por qué.

Por el tamaño de la proteína albúmina éste será el primero debido a que es

de mayor tamaño que el tamaño del poro del gel por lo tanto fue excluida
primero, a diferencia del sulfato de amonio que es de menor tamaño, siendo
este retardado al entrar a la red tridimensional de las esferas de gel.

b) ¿Qué es un gel? ¿Qué características debe tener el que es

cromatográficamente útil?

Un gel es un sistema coloidal donde la fase continua es sólida y la dispersa

es líquida. Los geles presentan una densidad similar a los líquidos, sin
embargo su estructura se asemeja más a la de un sólido. El gel que se
ocupan para estas cromatografías debe ser uno que tenga carga y sea una
red que permita una separación adecuada.

c) Mencione por lo menos tres aplicaciones diferentes a la usada en la

práctica, que puede tener está técnica.

Cambios de buffers. Después de cromatografías de intercambio iónico,

afinidad o de interacción hidrofóbica. Desalado. Proteínas, polisacáridos,
polipéptidos etc. Pueden ser desalados antes de ser concentrados o
liofilizados. Eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos nucléicos.
Eliminación de compuestos de bajo peso molecular marcados. I125, FITC
de las soluciones de marcaje de proteínas. Para reacciones entre
 macromoléculas y reactivos de bajo peso molecular. Eliminación de
productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas. Purificación de
macromoléculas. Determinación del peso molecular de las proteínas.

d) Describa las estructuras químicas del Sephadex, del bio-gel A y del

bio-gel p, indicando donde y de que forma se da el entrecruzamiento
en cada caso y el tipo de enlace que presenta.

Sephadex. Biogel A

Bio-Gel B
Discusión.
La separación de estas mezclas por el tamaño de la partícula es muy útil en para
la identificación y separación de proteínas entre proteínas o con alguna otra
especie química, como el caso del desarrollo de esta práctica, como vimos las
partículas grandes que no caben en la red viajan por el gel más rápido que las
partículas que son más pequeñas y pueden ser capturadas por el tamaño del poro
del gel. Por lo tanto el volumen de elución es inversamente proporcional al peso
molecular.
El perfil de elución nos da la información necesaria para saber cuándo se separan
las sustancias y este se basa en la aparición de las especies químicas en el
filtrado en función del tiempo, esto lo medimos gracias al espectrofotómetro que
mide la absorbancia de las especies químicas presentes en el filtrado.
En la práctica determinamos el volumen vacío que nos permite conocer a partir de
cuando habrá elución, no puede salir nada antes que el Vo por lo cual es una
forma de referencia si estamos trabajando adecuadamente con la columna o si
controlamos adecuadamente el goteo y la altura del disolvente.
También para finalizar hay que tener en cuenta que al término de la separación
hay que limpiar el gel con algún regulador que permita la extracción de las
impurezas sin dañar a nuestro gel.

Conclusiones.
 La cromatografía por exclusión se basa en la diferencia de tamaño de
partícula por lo que el parámetro más importante es la fase estacionaria de
tamaño (porosidad) adecuada)
 Debido al peso la albumina fue la primera en ser separada
 El (NH4)2SO4 quedo retenido en las porosidades de la fase estacionaria y
con ello se logró la separación de la proteína.

Bibliografía.

 Hernández J. Cromatografía por exclusión molecular disponible en:

https://bioquibi.webs.ull.es/practicas/6.pdf consultado el : 05/abril/19

 http://www.ehu.eus/biofisica/pdf/practica_4.pdf

 Análisis Químico Cuantitativo. D. C. Harris. Grupo Editorial Iberoamérica,

1992.

 Calcárcel, M.; A. Gómez H. 1998. "Técnicas Analíticas de Separación". Ed.

Reverté, pp. 573-592