Algunos ejemplos prácticos de validación de métodos en el

laboratorio analítico.

Piet van Zoonen*, Ronald Hoogerbrugge, Steven M. Gort, Henk J. van de Wiel, Henk A. van 't
Klooster

Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente (RIVM), P.O. Box 1, 3720 BA Bilthoven,
Países Bajos

La validación de métodos es un elemento clave tanto en la elaboración de métodos de

referencia como en la evaluación de la competencia de un laboratorio para producir datos
analíticos confiables. Por lo tanto, el alcance del término validación del método es amplio,
especialmente si se tiene en cuenta que existe, o al menos, una relación estrecha entre la
validación, la calibración y el control de calidad QA / QC. Además, la validación debe incluir
más que el paso instrumental solo desde que todo el ciclo desde el muestreo hasta el
resultado analítico final es importante en la evaluación de la validez de un resultado analítico.
En este artículo, la validación se coloca en el contexto del proceso de producción de
información química. Se presentan dos casos con más detalle: el desarrollo de un estándar
europeo para clorofenoles y su validación mediante un ensayo en colaboración a gran escala, y
la validación intralaboratorio de un método para etilentiourea utilizando técnicas analíticas
alternativas.

1. Introducción
La calidad es una noción relativa: nunca 'alta' ni 'baja' en sentido absoluto, sino más bien
adecuada o inadecuada en términos de la medida en que un producto, proceso o servicio
cumple con los requisitos especificados previamente por un objetivo o un cliente.

El producto principal de un laboratorio químico analítico es información sobre la composición

química de los sistemas de materiales, generalmente en términos de la identidad y / o
cantidad de uno o más componentes relevantes en muestras tomadas de estos materiales.

La calidad de la información científica en general se evalúa mediante estándares aceptados

internacionalmente de objetividad, integridad, reproducibilidad y rastreabilidad, en cualquier
caso antes de su publicación.

Los criterios esenciales para la calidad de la información química producida son la utilidad y
confiabilidad, que están estrechamente relacionadas con los márgenes de incertidumbre en
los resultados de la medición, tanto en lo que respecta a la identidad como a la concentración
de los componentes objetivo.

Con respecto a estos criterios correlacionados, los requisitos mínimos generalmente los
establece el cliente y generalmente se deducen de un propósito previamente especificado. Por
lo tanto, la calidad de la información química producida debe ser reconocida objetivamente
por el cliente como el usuario final de esta información. Para mediciones químicas, este podría
ser un químico clínico que necesite conocer la identidad de ciertos compuestos aislados de un
fluido biológico, o un químico polimérico que desee verificar la estructura molecular de un
producto de síntesis, o un investigador de salud que quiera saber si la concentración de cierto
compuesto tóxico en cierto alimento está por encima de cierto nivel de concentración. No es
difícil imaginar las consecuencias en términos de costos, riesgos para la salud, etc. cuando, en
un examen más cercano o una evaluación estadística de los resultados de la medición, un
'positivo' resulta ser falso, o el margen incierto de una concentración medida parece ser del
100% y no del 10% inicialmente informado. La evaluación y validación de los métodos
analíticos y los procedimientos de laboratorio son, por lo tanto, de suma importancia, ya que
los medios destacados son el uso de materiales de referencia adecuados (preferiblemente
certificados) y la participación en pruebas de competencia entre laboratorios.

Las exigencias de calidad de la infraestructura, el equipo, los procedimientos operativos, el

personal y la organización del laboratorio deben deducirse de los requisitos de calidad que
debe cumplir la información química producida. Se puede lograr un reconocimiento formal de
este tipo de calidad a través de la acreditación o certificación, basada en estándares y pautas
de calidad internacionales, según lo publicado por la ISO, la OCDE y el CEN.

La validación de los métodos analíticos no es más que un paso esencial en el proceso integral
de aseguramiento de la calidad y control de calidad de las mediciones químicas en sistemas de
materiales [1,2].

Figura 1. El análisis químico como proceso cíclico.

2. El análisis químico como proceso integral.

El análisis químico de cualquier sistema material puede describirse como una cadena de
decisiones, acciones y procedimientos [3]. La naturaleza cíclica de muchos procesos de análisis
químico se muestra esquemáticamente en la Fig. 1.

El último paso (interpretación y evaluación de los resultados del análisis) eventualmente debe
proporcionar una respuesta al problema inicial, generalmente establecido por ej. Un problema
científico o un contexto legal. Si la respuesta no es satisfactoria, se puede seguir nuevamente
el ciclo de análisis, después de un cambio o adaptación de uno o más pasos. Algunas veces
esto lleva al desarrollo de un nuevo método o (parte de un) procedimiento, por ejemplo, para
lograr una mejor separación de ciertos componentes, o para alcanzar un límite de detección
más bajo para compuestos específicos.

Como cualquier cadena, una cadena de análisis químico es tan fuerte como su eslabón más
débil. En general, los enlaces más débiles en un proceso analítico no son los que generalmente
se reconocen como partes de un análisis químico, como la separación cromatográfica o la
detección espectrométrica, sino los pasos anteriores, que a menudo tienen lugar fuera del
laboratorio analítico: la selección del objeto (s) a muestrear, diseño del plan de muestreo,
submuestreo, técnicas de muestreo y transporte y almacenamiento de muestras.

Cuando el laboratorio analítico no es responsable del muestreo, el sistema de gestión de

calidad a menudo ni siquiera tiene en cuenta estos vínculos débiles en el proceso analítico.

Además, si elementos como la preparación de la muestra de laboratorio, la extracción o la

limpieza de las muestras no se han realizado cuidadosamente, incluso los instrumentos
analíticos más avanzados y de calidad controlada y las sofisticadas técnicas informáticas no
pueden impedir que los resultados analíticos sean cuestionables.

Finalmente, cuando la interpretación y evaluación de los resultados analíticos no tienen una

base estadística, no queda claro qué tan significativos son estos factores, lo que determina en
gran medida su utilidad.

Por lo tanto, en nuestra opinión, el control de calidad y el aseguramiento de la calidad deben

incluir todos los pasos del análisis químico como un proceso integral, de los cuales la validación
de los métodos analíticos utilizados es solo uno, aunque importante, paso.

En la práctica de laboratorio, los criterios de calidad deben estar relacionados con la

justificación del plan de muestreo, la validación de métodos, instrumentos y procedimientos
de laboratorio, la confiabilidad de las identificaciones, la exactitud y precisión de las
concentraciones medidas y la comparabilidad de los resultados de laboratorio con la
información relevante. Producido antes o en otro lugar.

3. Calidad, información e incertidumbre.

Según Shannon [4], obtener información está reduciendo la cantidad de incertidumbre, según
los resultados de las mediciones.
Las siguientes fuentes de incertidumbre en el análisis cuantitativo han sido identificadas por
EURACHEM [5]:

Definición incompleta del mensurando.

 Muestreo
 Extracción incompleta / preconcentración
 Matriz efectos e interferencias
 Contaminación durante el muestreo o preparación de la muestra.
 Sesgo personal en la lectura de instrumentos analógicos.
 Falta de conocimiento / medición imperfecta de los efectos de las condiciones
ambientales en el procedimiento de medición
 Incertidumbre de pesos y equipos volumétricos.
 Resolución del instrumento o umbral de discriminación.
 Valores asignados a estándares de medición y materiales de referencia.
 Valores de constantes y otros parámetros obtenidos de fuentes externas, utilizados en
el algoritmo de reducción de datos
 Aproximaciones y supuestos incorporados en el procedimiento de medida
 Variación aleatoria.

Sin embargo, uno debe darse cuenta de que, para un problema particular, debe intentar
evaluar la influencia relativa de las fuentes alternativas en el resultado final, por ejemplo. Si la
fuente dominante de incertidumbre del procedimiento tiene un RSD del 25%, no es muy
eficiente exigir una precisión del 6,1% en la medición o el pesaje del volumen de la muestra
inicial.

Según lo estipulado por Horwitz y Albert [6], la variabilidad entre laboratorios es el

componente de error dominante en el mundo del análisis práctico de ultratracia. Llegan a la
conclusión de que un solo laboratorio no puede determinar su propia estructura de error,
excepto en el contexto de los materiales de referencia certificados o los resultados de
consenso de otros laboratorios.

Nuevamente, se subraya la importancia del uso de materiales de referencia, ya que

proporcionan información sobre el efecto combinado de muchas de las posibles fuentes de
incertidumbre.

En la literatura, así como en la práctica de laboratorio, la cuantificación de la incertidumbre en

el análisis cualitativo (identificación, elucidación de la estructura molecular) apenas se aborda.
Sin embargo, hay posibilidades, por ejemplo, cuando se utiliza la búsqueda de bibliotecas
asistida por computadora de espectros moleculares para la identificación de compuestos
orgánicos. Si se utiliza un índice de similitud adecuado, como el sistema basado en la
reproducibilidad de Cleij para diferentes tipos de espectros moleculares [7], es posible
especificar un umbral cuantitativo de incertidumbre, ya que los intervalos de confianza se
utilizan en el análisis cuantitativo.

En una próxima versión del programa de estudios EURACHEM, la cuantificación de la

incertidumbre también se referirá al análisis cualitativo.
 4. Características de validación / criterios de rendimiento.

Los criterios clave para la evaluación de un método analítico son los siguientes [8 ^ 10].

 Selectividad / especificidad ciudad

 Límite de detección
 Límite de cuantificación
 Recuperación
 Rango de trabajo y linealidad
 Exactitud / veracidad
 Precisión (repetibilidad, reproducibilidad)
 Robustez / robustez.

Si estos criterios se aplican o no a la validación de un método en particular, depende del

propósito y la naturaleza del método. En sus directrices, la Junta Holandesa para la
acreditación distingue entre los métodos "nuevo", "estándar" o "modificado" para caracterizar
la naturaleza de un método; un método estándar en esta definición es un estándar (inter)
nacional totalmente validado, mientras que, por otro lado, los métodos se clasifican de
acuerdo con su propósito, por ejemplo, Componentes cualitativos / cuantitativos o traza-
analíticos vs componentes principales. Los requisitos de validación para tales métodos se
resumen en la Fig. 2 [11].

5. Enfoques actuales de validación.

En una revisión reciente [12] se discuten los enfoques actuales para la validación de métodos
químicos analíticos. Se identifican algunas deficiencias de los esquemas de validación
existentes, como la insuficiente cobertura de la variabilidad en el espacio o el tiempo, y los
desajustes entre los criterios de validación y el uso previsto del método, por ejemplo, el uso en
el control reglamentario. Se intenta vincular los conceptos de validación utilizados en
diferentes campos, como la incertidumbre de la medición y el error de predicción. Se
recomienda un enfoque de modelado estadístico general para combinar diferentes aspectos
de la validación, y se ilustra con un ejemplo. Este tipo de modelación debe ser la base para el
desarrollo de nuevos esquemas de validación basados en estadísticas que integren las
actividades actuales de validación y garantía de calidad.
 Figura 2. Requisitos de validación exigidos por la Junta de Acreditación de los Países Bajos.

Se afirma que la validación incluye la evaluación inicial de las características de rendimiento,

varios tipos de pruebas interlaboratorios y el control de calidad. Por lo tanto, la validación se
ocupa de asegurar que un proceso de medición produzca mediciones válidas; Esto también se
ha llamado garantía de medición [13].

El concepto de validación de un método de análisis se puede usar en (al menos) tres sentidos:
en el sentido estricto y tradicional, el término denota la validación de un método químico
como se describe en un procedimiento operativo estándar (SOP). En un sentido más amplio, la
validación puede estar relacionada con un método de análisis (por ejemplo, en una norma
(inter) nacional) que explícitamente deja libertad para adaptar el procedimiento a la
infraestructura en una situación específica. En este caso hay más SOP, todos de conformidad
con el `método maestro'. Finalmente, en un sentido aún más amplio y quizás poco
convencional, la validación de los métodos analíticos puede considerarse desde la perspectiva
de quienes usan los resultados analíticos para otros fines. El método de análisis para los
usuarios finales de los resultados analíticos equivale a la especificación de un resultado
analítico (por ejemplo, "clenbuterol en el hígado"), con el implícito "analizado por cualquier
método razonable". Por consiguiente, un método específico de análisis en el sentido químico
analítico puede considerarse como una realización de la clase de todos los métodos
actualmente aplicados para medir el componente X en la matriz Y.

En principio, cada modificación del protocolo invalida una validación existente de acuerdo con
la norma ISO 5725. Se han realizado muchos trabajos de validación en esfuerzos conjuntos de
IUPAC, ISO y AOAC International (ver [14] para su historia temprana). Los resultados aparecen
como una serie de protocolos armonizados. La segunda edición de la norma ISO 5725 [15]
tiene mucho en común con el Protocolo IUPAC / ISO / AOAC para el diseño, la realización y la
interpretación de estudios en colaboración [16]. Se hicieron importantes contribuciones a
algunos de los problemas mencionados anteriormente en otros dos protocolos [17,18], en
pruebas de eficiencia (PT) y en control de calidad interno (IQC), respectivamente. El protocolo
internacional armonizado para las pruebas de eficiencia de los laboratorios analíticos
(químicos) [17] considera estudios de rendimiento de laboratorio, en los que cada laboratorio
utiliza su propio método analítico en oposición a los estudios de rendimiento de método de
ISO 5725 (nomenclatura según [ 19]). Aunque el propósito de las pruebas de competencia es a
menudo principalmente la evaluación o mejora del rendimiento del laboratorio, es razonable
considerarlo también como una validación de rendimiento del método con nuestra definición
más amplia del método (por ejemplo, desde la perspectiva de un cliente interesado en el
(clenbuterol en medidas del hígado). Esto resolvería los problemas de los diferentes
laboratorios que tienen diferentes SOP y los SOP que cambian de vez en cuando en cada
laboratorio. Hay una repetición prescrita en los esquemas de pruebas de aptitud con
frecuencias de una vez cada 2 semanas a una vez cada 4 meses que se consideran razonables.
Esto resuelve el problema con la naturaleza estática de la validación ISO 5725 y, al variar los
materiales de prueba, también el problema de no evaluar la variabilidad de la matriz.

A pesar de todas las ventajas, la prueba de eficiencia según las directrices de la IUPAC [17] no
puede considerarse una metodología de validación completa por sí sola. En primer lugar, no
proporciona la validación específica de SOP. Más importante aún, el esquema requiere
estudios interlaboratorios repetidos, lo que restringe severamente la cantidad y variedad de
muestras que se pueden analizar. Por lo tanto, la prueba de eficiencia es una metodología de
validación extensa. Finalmente, en el protocolo actual, la única característica de rendimiento
considerada es el sesgo de laboratorio, la mayoría de las veces en forma de una puntuación z.
Esta información por sí sola puede ser insuficiente para juzgar la finalidad.

Se ha demostrado que una garantía de medición efectiva requiere validación en diferentes

escalas. Los métodos recientemente desarrollados o implementados generalmente se validan
primero utilizando la validación interna. Este tipo de validación debe complementarse con la
validación de control de calidad interna en curso en cada laboratorio y con la participación del
laboratorio en esquemas interlaboratorios. Teniendo en cuenta la naturaleza compleja de
muchos métodos modernos de análisis, los esquemas de pruebas de eficiencia, que permiten
SOP específicos de laboratorio, son más relevantes que los esquemas de evaluación de
métodos como ISO 5725. Actualmente, existe una vinculación insuficiente entre los tres
esquemas de validación validación interna, control de calidad interno y pruebas de eficiencia.
El modelo que se presenta en este artículo, junto con los conceptos de incertidumbre de
medida y de propósito de uso, proporciona una base para el desarrollo de enfoques de
validación integrados.

Durante una reciente Consulta Conjunta FAO / OIEA de Expertos sobre la validación de
métodos analíticos para el control de alimentos, el "método ideal validado" se definió de la
siguiente manera [9]: "El método validado ideal es el que ha progresado completamente a
través de un estudio de colaboración en de conformidad con los protocolos
internacionalmente armonizados para el diseño, la realización y la interpretación de los
estudios de rendimiento de los métodos. Esto generalmente requiere un diseño de estudio
que incluya un mínimo de 5 materiales de prueba, ella participación de 8 laboratorios que
informan datos válidos y, en la mayoría de los casos, incluye réplicas ciegas o niveles divididos
para evaluar los parámetros de repetibilidad dentro del laboratorio. '' Los factores limitantes
para completar los estudios ideales de validación en varios laboratorios incluyen altos costos,
falta de suficientes laboratorios expertos disponibles y dispuesto a participar en tales estudios,
y limitaciones generales de tiempo.

6. Validación utilizando métodos analíticos alternativos.

Las estrategias de validación descritas anteriormente suponen que los métodos se aplican de
forma rutinaria en diversos laboratorios. En un entorno de investigación, se puede desarrollar
y validar un método bastante único para su uso en solo uno o pocos estudios. Entonces, por
supuesto, uno quisiera establecer la misma cantidad de información sobre la validez del
método. Sin embargo, algunas de las herramientas habituales, como la participación en
esquemas de eficiencia y el uso de materiales de referencia probablemente no sean posibles.

Hogendoorn et al. Analizan una serie de ejemplos prácticos, es decir, el cribado y análisis de
pesticidas polares en programas de monitoreo ambiental mediante cromatografía líquida de
columna acoplada y cromatografía de gases y espectrometría de masas. [20]. Uno de los
ejemplos es un estudio sobre los niveles de etilenotiourea (ETU) en aguas subterráneas. A
continuación, se describen los principales aspectos de la validación, se pueden encontrar más
detalles en [20].

En la validación de ambos métodos, el procedimiento de calibración es muy importante y

proporciona la información para varios de los criterios. La calibración se basa en muestras
enriquecidas que son comparables a las muestras de agua subterránea que se analizarán, lo
que da en sí misma, en comparación con el análisis de estándares, los datos de recuperación.
Las muestras de calibración se ordenan en el tiempo y entre las muestras reales. Por lo tanto,
la posible influencia de las condiciones durante el análisis (robustez) de las muestras se
captura automáticamente en la secuencia de calibración.

Para determinar el rango de trabajo de ambos métodos, los datos de calibración son evaluados
por la aplicación de hoja de cálculo Calwer [21]. El resultado se muestra en la Fig. 3. La
aplicación permite una evaluación exhaustiva de la curva de calibración, por ejemplo, con
respecto al modelo de calibración apropiado. Los resultados se presentan al usuario tanto por
número, como por resultados de pruebas estadísticas, y por gráficos, para permitir una
interpretación gráfica. Estos resultados muestran para la calibración por UVUU / HPLC ^ UV
que se prefiere el modelo de calibración más simple (y = bx), ya que los modelos más
complejos (y = a + bx o y = a + bx + cx2) no muestran ninguna significación. No hay mejoras
relevantes ni relevantes de la desviación estándar residual. Calwer también ofrece la
oportunidad de probar la dependencia de la concentración de los residuos. En la mayoría de
los programas de calibración, la regresión de mínimos cuadrados ordinarios se utiliza para
calcular la curva de calibración. Este enfoque se basa en la homoscedasticidad de las
mediciones. Luego, las desviaciones a bajas concentraciones deben mostrar desviaciones de
un modelo de calibración razonable que sean iguales a las desviaciones en el límite alto del
rango de trabajo. Para ETU esta suposición es claramente violada; por lo tanto, se utiliza un
modelo adecuado para los residuos en combinación con la regresión de mínimos cuadrados
ponderados. Además de la presentación gráfica, también se calcula la probabilidad de registro,
lo que permite un criterio de selección objetivo entre varios modelos de varianza. La regresión
ponderada se ha aplicado en nuestro laboratorio durante aproximadamente 5 años, lo que
demuestra que el supuesto de varianza igual en el rango de trabajo casi siempre se viola
gravemente. La aplicación de un modelo de variación razonable da implícitamente la
desviación estándar a bajas concentraciones y, por lo tanto, estima el límite de detección. La
estrategia de modelos de varianza, regresión ponderada en combinación con el criterio de
máxima verosimilitud, se formaliza para la calibración / validación de la comparación de
métodos en ISO 13752 [22].

Figura 3. Curva de calibración para ETU analizada por HPLC ^ UV. Varios modelos de calibración
se prueban estadísticamente y se aplica un modelo para la varianza.
La selectividad del método se verifica comparando la forma y la retención de muestras reales y
muestras de calibración con el cromatograma de soluciones estándar.

Para el análisis de ETU en aguas subterráneas, no se dispone de materiales de referencia ni de

esquemas de prueba de eficiencia. Una precisión razonable está asegurada por una serie de
precauciones:

 Las soluciones estándar se realizan mediante dos rutas independientes.

 El material de referencia sólido se comprueba mediante espectroscopia IR para
detectar impurezas
 Un estudio comparativo con otro laboratorio (familiarizado con este análisis)
 Todas las 60 muestras de agua subterránea se analizan mediante dos métodos
independientes, HPLV ^ UV y GC ^ MS.

Los resultados se muestran en la Fig. 4.

El análisis de todas las muestras por los dos métodos de análisis ofrece la oportunidad de
comparar la varianza entre las muestras reales con la varianza esperada basada en los
resultados de validación de ambos métodos con el mismo tipo de regresión. Para las
concentraciones intermedias y relativamente altas de ETU en aguas subterráneas (s 1 Wg / l),
la variación entre ambos métodos cumple con sus expectativas. Sin embargo, para
concentraciones muy bajas (6 1 Wg / l) la varianza entre los resultados de ambos métodos es
mucho mayor de lo esperado. Esta desviación podría ser una indicación de que la dispersión
natural en los materiales que interfieren en el agua subterránea no está completamente
cubierta por las muestras utilizadas para los experimentos de calibración / validación. Estas
interferencias aparentemente solo tienen un efecto sustancial sobre la incertidumbre de la
medición en niveles bajos (6 1 Wg / l) del analito.

Esta fuente adicional de incertidumbre podría perturbar la suposición de que el método con
las mejores características de validación debería ser preferido como método de referencia (la x
en la ecuación de regresión y = a + bx). Sin precauciones, la fuente adicional de varianza se
trata mediante esquemas de regresión habituales debido a que las estimaciones de
rendimiento del método y para la pendiente de la relación de calibración (b) son demasiado
bajas. En la comparación de métodos, esto implica que la proporción de los resultados del
método y con respecto a los resultados del método x se subestima. Un enfoque alternativo
para comparar métodos analíticos explora las variaciones 'conocidas' de ambos métodos [23,
24]. Sin embargo, estos resultados también se verán perturbados por la variación de la matriz
adicional, ya que se compartirán de acuerdo con la proporción de estas variaciones
"conocidas". Recientemente Carrol et al. [25] describieron las implicaciones estadísticas de
fuentes adicionales de varianza en el análisis de regresión, sugiriendo una corrección bastante
simple (método de momentos) para obtener una estimación razonable de la relación entre los
dos métodos.
 Figura 4. Desviaciones estándar relativas de la reproducibilidad en función de la
concentración para todas las combinaciones de muestra / componente. Para comparación
también se traza la curva de Horwitz.