GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

Práctica 1.
Realizado por: Alexis Gutiérrez y Aydee Torres Páez
Asignatura: Biología Periodo : II
1. Objetivo General
Reconocer y contrastar la existencia del ácido desoxirribonucleico ADN a nivel experimental en muestras vegetales
para reforzar los conceptos y aprendizajes obtenidos en clase

Objetivo específico

Afianzar los conceptos relacionados con los ácidos nucleicos presentes en las células de los diferentes seres de la
naturaleza

Abstract: The objective of the experiment is to extract DNA of different fruits and vegetables. On our case we
developed three different experiments, the first one adding a really well-known commercial brand of liquid detergent
(Fairy) and common salt. In the second experiment we used just a private label of liquid detergent and in the third
experiment we used again Fairy and pineapple juice

Pregunta problema:____________________________________________________________________________
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HIPOTESIS:___________________________________________________________________________________
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2. Marco Teórico

Puede obtenerse ADN de cualquier célula viva, a excepción de los eritrocitos humanos que son enucleados. La técnica
es básicamente la misma para todo tipo de célula. En primer lugar se rompen las células ya sea por métodos mecánicos
o químicos, y se extraen las proteínas mediante incubación con una proteinasa. A continuación se separan el ADN y el
ARN del resto de constituyentes de la célula utilizando una mezcla con fenol. Los ácidos nucleicos se distinguen de las
restantes sustancias bioquímicas en que no se disuelven en fenol. Tras la centrifugación, el fenol se separa de la fase
acuosa. Las proteínas y las grasas permanecen en el fenol, pero el ADN y el ARN se encuentran en la fase acuosa. Los
restos de fenol pueden eliminarse con cloroformo. El fenol se disuelve en el cloroformo, mientras que los ácidos
nucleicos permanecen en la fase acuosa. Posteriormente la adición de etanol hará que el ADN se vuelva insoluble y
forme un precipitado visible, semejante a un trozo de algodón, el cual puede ser fácilmente extraído y disuelto en una
solución de agua y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), listo para su análisis. El ADN de un peso molecular inferior,
como el de plásmidos bacterianos, no puede ser extraído de la misma manera y debe recuperarse por centrifugación. El
ARN contaminante puede entonces eliminarse mediante tratamiento con una ARNasa.

La concentración de ADN en una solución puede determinarse mediante espectrofotometría. El ADN absorbe la luz a una
longitud máxima de onda de 256 nm. Una solución de ADN de 1 mg/ml tiene una densidad óptica a 256 nm. Las
proteínas absorben la luz a una longitud máxima de onda de 280 nm. El índice de densidades ópticas a 256 y a 280 nm
es un indicador de la pureza de la solución.

Extracción del ADN en tejidos vegetales.

Los agregados vegetales como polisacáridos, fenoles y compuestos secundarios son el principal problema encontrado en
la extracción y purificación del ADN vegetal, estos pueden deteriorar el ADN e inhibir la acción de la
enzima Taq polimerasa para usos de la PCR . Las hojas de diversas especies de plantas poseen niveles variados de
alcaloides, esteroides, flavonoides, glucósidos cianogénicos, gomas, taninos, resinas y algunos ácidos que pueden
comprometer la extracción del ADN.

De modo general, el protocolo de extracción más utilizado para las diferentes especies vegetales es el CTAB (bromuro
de cetiltrimetilamonio), que normalmente integra un buffer para estabilizar el pH en torno de 8, una sal para disociar las
proteínas del ADN, un detergente para solubilizar las membranas y auxiliar en la inactivación de algunas enzimas. Los
detergentes deben romper las membranas celulares para que ocurra la liberación del ADN. Algunos protocolos usan SDS
(dodecil sulfato de sodio) como detergente, otros usan CTAB y otros usan sarcosil.
Actualmente existen numerosos protocolos que permiten extraer el ADN de diferentes especies y tejidos vegetales. La
diversidad de técnicas manifiesta la variabilidad en la composición química de los vegetales, que impide el desarrollo de
un protocolo universal. Sin embargo, los fundamentos de cada etapa son comunes a todos los métodos.

3. Materiales y Reactivos

Materiales Reactivos
vasos de precipitado 100 (1) y 250 mL (1) Cloruro de Sodio
1 pipeta de 10 mL Alcohol isopropilico frio
1 Agitador de vidrio Jabol líquido, detergente o shampoo
Papel filtro Papaina o ablandador de carnes
Hielo Bolsa Agua destilada
2 cucharas plasticas Gotero
3 tubos de ensayo
Mortero
Licuadora
Palillo de pincho
DEBEN TRAER LOS ESTUDIANTES
Marcador sharpie, Cinta de enmascarar, toallas
scoot, cronometro, Material vegetal. (asignado por
la docente)

NO OLVIDE CONSULTAR LAS FICHAS DE SEGURIDAD DE TODOS LOS REACTIVOS USADOS.

4. Procedimiento para la extracción de ADN vegetal

1. Preparar una solución de tejido vegetal en trozos pequeños, procesada con sal, agua destilada y shampoo
(detergente) mediante los siguientes pasos:
2. En una licuadora, mezclar 150 g de muestra vegetal por taza de agua destilada (250ml).
3. Licuar por 15-20 segundos, hasta que la solución se mezcle.
4. En una taza, preparar una solución consistente en una cucharadita de té de shampoo y dos pizcas de sal.
5. Agregar 20 ml (4 cucharaditas) de agua destilada.
6. Disolver la sal y el shampoo revolviendo lentamente con la cuchara de plástico evitando formar espuma.
7. A la solución preparada en el paso 3, agregar tres cucharaditas de té de la mezcla de tejidos vegetales del
paso 1.
8. Mezclar la solución con la cuchara por 5-10 minutos.
9. Mientras uno de los miembros del grupo mezcla la solución de tejido vegetal, otro miembro pondrá el filtro Nº
2 de café dentro de otra taza de plástico. Doblar el borde del filtro alrededor de la taza para que el filtro no
toque el fondo de la taza.
10. Filtrar la mezcla vertiéndola dentro del filtro y dejar que la solución drene por algunos minutos hasta que sean
5 ml aproximadamente de filtrado para testear.
11. Tomar un tubo de ensayo con alcohol frío. Para mejores resultados el alcohol debe estar tan frío como sea
posible.
12. Llenar la pipeta plástica con la solución de tejido vegetal y agregarla al alcohol. El ADN no es soluble en
alcohol. Cuando el alcohol se agrega a la mezcla, los componentes, excepto el ADN, permanecen en la
solución mientras el ADN precipita en la capa de alcohol.
13. Dejar la solución reposar por 2 a 3 minutos sin mover. Es importante no batir el tubo de ensayo. Se puede
observar el ADN blanco el cual precipita en la capa de alcohol.
14. Cuando se obtienen buenos resultados, habrá suficiente ADN para levantar con una varilla de vidrio (el ADN
se enrolla a la varilla). O usando una pipeta de Pasteur que haya sido calentada en la punta para formar un
gancho, se puede recuperar (tomar) algo de ADN. El ADN tiene la apariencia de mucus blanco y fibroso.

5. ANALISIS DE RESULTADOS

1. Qué finalidad tiene el exponer las células a un detergente fuerte.

2. Elabore un cuadro donde se evidencia la utilidad de cada uno de los reactivos o materiales para la liberación
del ADN
3. Que pasos cambiaria en el protocolo para obtener ADN animal
4. Realiza un dibujo de la acción del detergente sobre las células.
5. ¿Qué son soluciones buffer y cuál es su importancia biológica?
6. ¿Qué relación tiene las diferentes soluciones y el comportamiento de estas según sean hipotónicas-
isotónicas e hipertónicas, para la liberación de la molécula de ADN?
7. consulta cual es la importancia de los protocolos de extracción de ADN para la biología molecular
8. Investiga y explica brevemente en qué consiste la técnica PCR- Souther Blot, electroforesis.
9. Que usos y aplicaciones de impacto social tiene el aislamiento de ADN y las técnicas de biología molecular
anteriormente citadas en el punto 7.
6. BIBLIOGRAFÍA.

1. Zabala Castro J.. Manual técnicas básicas de biología molecular. México 2005 p 31-44
2. Starr Cecie. Biología. Conceptos y aplicaciones. Edt. Cengage Learning. México 2013. Pg 223 – 235
3. Audesirk Teresa. Biología la vida en la tierra. Edt. Pearson. México. 2012. Pg. 200 - 240
4. http://www.geocities.ws/pedrojrocha/pr/rocha23_3.pdf
5. http://bioxeo4eso.weebly.com/uploads/5/8/5/7/5857408/extraccion_de_adn.pdf