Aula5 1 PDF

Introdução à Bioquímica
Função das Proteínas
Dra. Fernanda Canduri

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.
Departamento de Física. UNESP
São José do Rio Preto. SP.

BioMoleculares. Departamento de Física.Física. Câmpus Rio Preto.
Preto.
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www. biocristalografia.
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Tópicos
! Mioglobina
! Hemoglobina
! Miosina e actina
! Anticorpos

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Mioglobina - Estrutura
! Primeira proteína a ter sua estrutura

determinada por cristalografia de raios X (1959).
! Pequena proteína intracelular do músculo dos
vertebrados com função de ligar oxigênio (O2).
! Possui 153 resíduos de aminoácidos, sendo
que a maioria faz parte de oito hélices α.
! Possui um único grupamento heme.

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Mioglobina
O grupo heme

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Estrutura da mioglobina
! O heme está encaixado em uma concavidade

hidrofóbica
! Duas cadeias laterais hidrofóbicas auxiliam na
manutenção da posição do heme.
! O sistema de anel heterocíclico do heme é um
derivado porfirínico, contendo 4 grupos
pirrólicos

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Estrutura da mioglobina
! O átomo de Fe(II) do grupo heme, quando

exposto ao O2 é oxidado de maneira
irreversível a Fe(III), forma que não liga O2.
! A porção protéica da mioglobina impede essa
oxidação e torna possível a ligação reversível
do O2 ao heme.
! A oxigenação leva a mudança de coloração da
molécula de mioglobina.
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Outras moléculas se ligam ao heme
! Além do O2, outras moléculas podem se ligar

ao grupo heme: CO, NO e H2S
! A afinidade destes compostos é muito maior
do que o O2.

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Função da mioglobina
Somente uma proteína armazenadora de O2?
Sua principal função fisiológica consiste em facilitar o

transporte de oxigênio nos músculos.
A mioglobina aumenta a solubilidade efetiva do O2 no

músculo, atuando como um carregador /
descarregador molecular para aumentar a velocidade
de difusão do O2.

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! Função de armazenar O2:

Importante nos mamíferos aquáticos.
Nesses animais, a concentração de mioglobina

nos músculos é aprox. 10x maior do que nos
mamíferos terrestres.

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A ligação reversível do O2 à mioglobina (Mb) é

descrita por uma equação de equilíbrio
Mb + O2 ↔ MbO2
A constante de dissociação (K) para essa
equação é:
K = [Mb][O2] / [MbO2]

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A dissociação do O2 da mioglobina é caracterizada por
sua saturação fracional YO2, que é definida como a
fração dos sítios de ligação ocupados pelo O2.
YO2 = [MbO2] / [Mb] + [MbO2] = [O2] / K +[O2]

Desde que o O2 é um gás, sua concentração é
expressa por sua pressão parcial (pO2)
YO2 = pO2 / K + pO2
Essa equação descreve uma hipérbole

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! Numa pO2 baixa, pouco O2 se liga à

mioglobina (YO2 é muito baixa).
! A medida que a pO2 aumenta, mais O2 liga-
se a Mb.
! Numa pO2 muito alta, quase todos os sítios
estão ocupados - diz-se que a Mb está
saturada de O2.

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! A inclinação da hipérbole aumenta à medida que

diminui o valor de K.
! Quando pO2 é igual a K, metade da Mb estará
saturada com O2
! Isso pode ser mostrado substituindo-se K por pO2 na
equação anterior:
se pO2 = K, YO2 = pO2/K + pO2 " YO2 = 0,5
Então, K pode ser definido como o valor de pO2, no qual
Y=0,5
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! É conveniente definir K como p50, ou seja, a pressão

de O2 na qual Mb está 50% saturada
! A p50 para a Mb é de 2,6 torr (760 torr=1atm)
" no intervalo fisiológico da pO2 no sangue, a Mb está
quase totalmente saturada com O2.
YO2=0,97 a pO2=100 torr e 0,91 a pO2=30 torr
A Mb é um modelo útil para o estudo de outras

proteínas de ligação.
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Hemoglobina
! Tem função fisiologicamente específica – o

transporte de O2.
! Constitui um sistema sofisticado de transporte
que fornece a quantidade adequada de O2 aos
tecidos.

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Estrutura da hemoglobina
! É uma proteína tetramérica, com a estrutura

quaternária α2β2 (um dímero αβ).
! As subunidades α e β são relacionadas
estrutural e evolutivamente entre si e com a
mioglobina.
! Sua estrutura foi elucidada por Max Perutz em
1968, o pai da cristalografia de proteínas por
difração de raios X.
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Cada monômero da estrutura tetramérica da
hemoglobina possui um grupo heme

BioMoleculares. Departamento de Física.
Física. Câmpus Rio Preto.
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Estrutura da hemoglobina
Apenas cerca de 18% dos resíduos de

aminoácidos são identicos na mioglobina e
nas subunidades da hemoglobina, mas os
três polipeptídeos possuem estruturas
terciárias similares.

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A estrutura da hemoglobina
! A ligação do O2 altera toda a estrutura do tetrâmero, de

forma que a estrutura da desoxiemoglobina e a da
oxiemoglobina são perceptivelmente diferentes.
! Em ambas as formas, as subunidades α e β fazem
contato extenso: os contatos na interface α1-β1 e seu
equivalente, envolvem 35 resíduos, e os da interface
α1-β2 envolvem 19 resíduos.
! Essas associações são predominantemente
hidrofóbicas, embora envolvam ligações de H e pares
iônicos.

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Oxihemoglobina e desoxihemoglobina

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A estrutura da hemoglobina
! Os pares das subunidades α1−α2 e β1−β2 estão

separados por um canal de ~20Å de diâmetro
preenchido com solvente.
! Quando o O2 se liga, os contatos α1−β2 e α2−β1
sofrem um deslocamento, produzindo uma
alteração na estrutura quaternária.
! Esse rearranjo estrutural é um elemento crucial
no comportamento da ligação do O2 à
hemoglobina.
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Ligação do O2 à hemoglobina
! A hemoglobina tem uma p50 total de 26 torr

(em uma pressão de O2 de 26 torr, metade
da hemoglobina está saturada com O2)
! Valor cerca de 10x maior do que a p50 da
mioglobina (2,8 torr)
! A hemoglobina não apresenta uma curva
hiperbólica de ligação ao O2, como na
mioglobina.
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A ligação de O2 à hemoglobina segue o traçado de
uma curva sigmóide

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! A hemoglobina pode transferir mais O2 para

os tecidos do que transferiria se
apresentasse uma curva hiperbólica com a
mesma p50
! Nas pressões arteriais de O2, está quase
totalmente saturada com O2, mas nas
pressões venosas de O2 está somente
metade saturada.
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! Em qualquer sistema de ligação, uma curva

sigmóide é característica de uma interação
cooperativa entre os sítios:
A ocupação de um sítio pelo ligante afeta a

ocupação dos demais sítios por ligantes
adicionais

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Equação de Hill
! Tentativa inicial de analisar a curva sigmóide

de dissociação do O2 da hemoglobina foi
realizada por Archibald Hill (1910)
! Hill presumiu que a hemoglobina (Hb) liga n
moléculas de O2 em uma única etapa
Hb + n O2 " Hb(O2)n
ou seja, com cooperatividade infinita.
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Equação de Hill
Em analogia a equação
YO2 = pO2/K + pO2 para a Mb,
YO2 = (pO2)n / (p50)n + (pO2)n
é conhecida como equação de Hill.
Ela descreve o grau de saturação da
hemoglobina como uma função da pO2.
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" A cooperatividade infinita da ligação de O2 como
descrita por Hill é uma impossibilidade física
! A quantidade n, a constante de Hill, aumenta com o

grau de cooperatividade de uma reação,
proporcionando uma caracterização conveniente de
uma reação de ligação de ligante
n=1, a equação descreve uma hipérbole (reação não
cooperativa)
n>1, a equação descre uma sigmóide (reação
positivamente cooperativa)
n<1, reação negativamente cooperativa

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A constante de Hill, n, e o valor de p50 que melhor
descrevem uma curva de saturação da Hb podem
ser determinados graficamente pela equação
YO2 / 1 - YO2 = (pO2)n / (p50)n

Tomando o log em ambos os lados, tem-se
uma equação linear
log (YO2 / 1 - YO2) = n log pO2 – n log p50

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Gráfico de Hill
A curva linear do log

(YO2 / [1 - YO2]) pelo
log de pO2,
chamada curva de
Hill, tem uma
inclinação de n e
um intercepto de log
p50 no eixo do log
pO2.

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Modelos mais realistas para analisar a ligação
cooperativa do O2 à Hb foram desenvolvidos
Proteínas alostéricas
A cooperatividade da ligação do O2 à Hb é um modelo

clássico
A ligação de um ligante pode aumentar ou diminuir a
afinidade de ligação de ligantes a outros sítios da
proteína – são interações alostéricas

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Existem dois modelos propostos para
explicar a ligação cooperativa do ligante
1. Modelo de simetria do alosterismo (proposto

por Monod, Wyman e Changeux em 1965):
a. Uma proteína alostérica é um oligômero de
subunidades simetricamente relacionadas;
b. Cada subunidade existe em dois estados
conformacionais em equilíbrio;
c. O ligante pode ligar-se à subunidade em ambas as
conformações. Somente a mudança conformacional
altera a afinidade pelo ligante;
d. As subunidades devem alterar a conformação de
modo combinado.
Modelo de simetria de MWC
! A principal objeção ao modelo de simetria consiste

na dificuldade de acreditar que a simetria
oligomérica seja perfeitamente conservada em
todas as proteínas
! E, embora algumas proteínas exibam
cooperatividade negativa, o modelo explica
somente a cooperatividade positiva.

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2. Modelo sequencial - proposto por Daniel
Koshland
! É uma alternativa ao modelo de simetria.

! A ligação do ligante induz uma alteração
conformacional na subunidade à qual se liga e, pela
influência dessa sobre as subunidades vizinhas,
surgem interações cooperativas
! As mudanças conformacionais ocorrem
sequencialmente à medida que mais sítios de ligação
estão sendo ocupados
! A afinidade varia com a conformação.

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As proteínas que seguem o modelo sequencial
do alosterismo podem apresentar
cooperatividade positiva ou negativa
! Se o acoplamento mecânico entre as subunidades for

particularmente forte, as mudanças conformacionais
ocorrerão simultaneamente, mantendo sua simetria
! Neste caso, o modelo de simetria pode ser considerado
um caso extremo do modelo sequencial
! A ligação do O2 à Hb exibe características de ambos os
modelos – é combinada e causa mudanças estruturais
pequenas

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Mecanismo de cooperatividade da ligação de
O2
Como a ligação de um O2 num grupo heme afeta a

afinidade de ligação de outro grupo heme?
A informação é transmitida de modo mecânico para

os demais grupos heme por movimentos da
proteína.
Esses movimentos são responsáveis pelas
diferentes estruturas quaternárias da oxi- e desoxi-
Hb.
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A hemoglobina possui dois estados
conformacionais
! Baseadas nas estruturas cristalográficas das formas

oxi e desoxi, Perutz formulou um mecanismo para a
oxigenação da Hb:
Há dois estados conformacionais estáveis: o estado R,

oxigenado, e o estado T, desoxigenado.
As conformações das 4 subunidades diferem do estado T

para o R.
A ligação do O2 inicia uma série de movimentos coordenados.

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Formas R e T
! A característica da transição T " R da Hb é que suas

subunidades estão tão firmemente acopladas que
não podem acontecer grandes mudanças estruturais
terciárias dentro de uma subunidade, sem que
ocorram mudanças estruturais quaternárias em toda
a proteína – só há duas formas R e T.
! Nenhuma subunidade ou dímero muda sua
conformação de modo independente.

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Formas R e T
! O estado T tem baixa afinidade pelo O2, devido ao

comprimento da ligação Fe-O2 (0,1 Å maior).
! Quando 1 O2 liga-se a um dímero, a tensão gerada no
estado T é suficiente para levar a proteína ao estado R
! Então todas as subunidades são convertidas
simultaneamente ao estado R, tenham ou não O2
ligado.
! Nesta conformação, as subunidades não-ocupadas
apresentam maior afinidade pelo O2.

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O efeito Bohr
! As mudanças conformacionais que ocorrem na Hb pela

ligação do O2 reduzem os pKs de vários grupos (N-terminal
das α e C-terminal das β).
! No estado T esses grupos ácidos com carga positiva
participam de ligações iônicas o que eleva seus pKs, ao
passo que no estado R tais interações não existem.
! O aumento do pH (remoção de prótons), estimula a
hemoglobina a ligar mais O2 em pressões de O2 mais
baixas – é o efeito Bohr – Christian Bohr (1904)

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O efeito Bohr

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O efeito Bohr desempenha funções
importantes
O2 " pulmões para os tecidos

CO2 " difunde-se dos tecidos para os capilares e
pulmões
O CO2 dissolvido transforma-se lentamente em
bicarbonato (HCO3-)
CO2 + H2O " H+ + CO3-
No eritrócito, a enzima anidrase carbônica acelera essa
reação. Então, a maior parte do CO2 é transportado no
sangue na forma de bicarbonato.
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Nos pulmões, onde a pressão de O2 é alta, a
ligação do O2 à Hb rompe as ligações
iônicas do estado T e forma o estado R,
liberando assim, os prótons de Bohr, que se
recombinam com o bicarbonato para eliminar
o CO2.

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“A hemoglobina altamente purificada
(Stripped Hb) tem uma afinidade muito maior
pelo oxigênio do que a hemoglobina no
sangue total.”
Porque?
Joseph Barcroft (1921) especulou que o sangue
conteria, além do CO2, alguma outra substância,
afetando a ligação do O2 à Hb.

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D-2,3-bisfosfoglicerato – o BPG

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D-2,3-bisfosfoglicerato – o BPG
Liga-se fortemente a desoxi-Hb e fracamente a oxi-

Hb.
Assim, a presença do BPG nos eritrócitos reduz a

afinidade da Hb pelo O2 por mantê-la na sua forma
desoxi
Onde se liga na molécula da Hb?

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O BPG liga-se à concavidade central
! Na transição T " R, as duas subunidades β

se aproximam,estreitando a concavidade
central, e expulsando o BPG
! Portanto, estabiliza a conformação T da Hb
pela ligação cruzada de suas subunidades β
! Desloca o equilíbrio R " T, reduzindo a
afinidade da Hb pelo O2.

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BPG – função fisiológica indispensável
! No sangue arterial (pO2 = 100 torr) a Hb está 95% saturada

com O2
! No sangue venoso (pO2 = 30 torr) a Hb está 55% saturada
Então, ao passar pelos capilares, a Hb descarrega cerca de
40% de O2
Na ausência de BPG, somente pequena parte do O2 seria
liberado, devido ao aumento da afinidade.
O BPG exerce um papel importante na adaptação às grandes
altitudes

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α2γ2) tem baixa afinidade
A Hb fetal (α
pelo BPG

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Hemoglobinas anormais
O estudo de indivíduos com deficiências

fisiológicas levou a descoberta de
aproximadamente 500 hemoglobinas
variantes
Cerca de 95% delas são resultado de
substituições de um único aminoácido na
cadeia polipeptídica da globina.

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! As mutações que desestabilizam as

estruturas terciárias e quaternárias alteram a
afinidade da Hb pelo O2 e reduzem a sua
cooperatividade.
! As Hbs instáveis são degradadas pelos
eritrócitos e seus produtos de degradação
causam lise celular – é a anemia hemolítica

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! Outras mutações favorecem a oxidação do Fe(II)

para Fe(III) – cianose
São indivíduos portadores de metahemoglobina
Essa Hb apresentam cooperatividade reduzida
! Há também mutações que aumentam a afinidade da

Hb pelo O2, levando ao aumento do número de
eritrócitos para compensar a quantidade reduzida de
O2 que chega aos tecidos - policitemia

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A anemia falciforme
! Os indivíduos que apresentam os dois alelos

(homozigotos) do gene da hemoglobina S
sofrem de anemia falciforme, na qual a
desoxi-Hb S forma filamentos insolúveis que
deformam os eritrócitos

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Micrografia eletrônica de
eritrócitos humanos

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A anemia falciforme
! As células rígidas e em forma de foice não

conseguem passar com facilidade pelos
capilares.
! Em 1956, V. Ingram mostrou que a Hb S
continha uma Val na posição 6 das cadeias
β, ao invés de Glu.
Doença congênita originada pela troca de um
aminoácido específico de uma proteína

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Hemoglobina S
! A estrutura cristalográfica da desoxi-Hb S mostrou que a

cadeia lateral da Val de cada molécula mutante encaixa-
se em uma concavidade hidrofóbica na superfície da
subunidade β de outra molécula de hemoglobina
! Esse contato intermolecular permite a formação de

polímeros lineares entre as moléculas da Hb S – formam
agregados de 14 cadeias que enrolam-se e formam
fibras de cerca de 220Å de diâmetro

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Anemia falciforme
Nem a Hb normal, e nem a oxi-Hb S podem polimerizar
A concavidade hidrofóbica não acomoda a cadeia lateral

do Glu de uma cadeia normal, e essa concavidade não
existe na oxi-Hb
Muitos homozigotos para Hb S apresentam somente

uma forma leve de anemia falciforme, pois apresentam
níveis relativamente altos de Hb fetal (α2γ2)

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Função das Proteínas

Dra. Fernanda Canduri

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

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! Primeira proteína a ter sua estrutura

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! O heme está encaixado em uma concavidade

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! O átomo de Fe(II) do grupo heme, quando

! Além do O2, outras moléculas podem se ligar

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

Somente uma proteína armazenadora de O2?

Sua principal função fisiológica consiste em facilitar o

A mioglobina aumenta a solubilidade efetiva do O2 no

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! Função de armazenar O2:

Nesses animais, a concentração de mioglobina

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A ligação reversível do O2 à mioglobina (Mb) é

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

YO2 = [MbO2] / [Mb] + [MbO2] = [O2] / K +[O2]

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! Numa pO2 baixa, pouco O2 se liga à

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! A inclinação da hipérbole aumenta à medida que

! É conveniente definir K como p50, ou seja, a pressão

A Mb é um modelo útil para o estudo de outras

! Tem função fisiologicamente específica – o

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! É uma proteína tetramérica, com a estrutura

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

Apenas cerca de 18% dos resíduos de

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! A ligação do O2 altera toda a estrutura do tetrâmero, de

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

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! Os pares das subunidades α1−α2 e β1−β2 estão

! A hemoglobina tem uma p50 total de 26 torr

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! A hemoglobina pode transferir mais O2 para

! Em qualquer sistema de ligação, uma curva

A ocupação de um sítio pelo ligante afeta a

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! Tentativa inicial de analisar a curva sigmóide

! A quantidade n, a constante de Hill, aumenta com o

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

YO2 / 1 - YO2 = (pO2)n / (p50)n

log (YO2 / 1 - YO2) = n log pO2 – n log p50

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

A curva linear do log

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

A cooperatividade da ligação do O2 à Hb é um modelo

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

1. Modelo de simetria do alosterismo (proposto

! A principal objeção ao modelo de simetria consiste

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! É uma alternativa ao modelo de simetria.

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

! Se o acoplamento mecânico entre as subunidades for

Laboratório de Sistemas BioMoleculares.

Como a ligação de um O2 num grupo heme afeta a