Abril 30 del 2019

DIAGNÓSTICO POR ADN

Técnicas para análisis de ADN

 Southern blot

1. Método

Esta técnica combina electroforesis en gel (separar

por carga y tamaño el ADN) con el uso de sondas
específicas.

• Obtención de ADN

Usualmente se obtiene ADN a partir de linfocitos.

Aproximadamente 5-10 ug se tratan con una enzima
de restricción (obtenidas de bacterias, son nucleasas
que rompen el ADN, cortan el esqueleto azúcar
fosfato) que hace cortes secuencia específicos. Los
fragmentos de ADN resultantes se separan por
electroforesis en un gel.

• Desnaturalización del ADN

El ADN se desnaturaliza para separar las cadenas, que luego

se transfieren a una membrana.

• Marcación del ADN

Una sonda de ADN o ARN se radiomarca y se adiciona al ADN

que está sobre la membrana. La sonda reconoce e hibrida con
la secuencia de ADN complementaria, permitiendo detectar el
fragmento especifico de interés.

2. Aplicaciones

El Southern blot es una aproximación muy común para

diagnosticar ADN.

Este método aprovecha el hecho de que las secuencias dentro

de una sonda de ADN reconocen secuencias similares en el
ADN digerido (principio de hibridación molecular).

Muchas enfermedades genéticas se diagnostican a través de

esta técnica.

3. Limitaciones.

Se requieren cantidades significativas de ADN.

La técnica demanda bastante trabajo y puede tomar 7-14 días entregar un resultado.

Generalmente involucra el uso de material radiactivo, lo que requiere un entrenamiento especial y precauciones
de seguridad para el personal del laboratorio.
  Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Es una técnica poderosa para amplificar en forma selectiva

y rápida secuencias blanco de ADN o ARN.

1. Método

La técnica se basa en la amplificación enzimática de un

fragmento de ADN que está flanqueado por dos segmentos
de cebadores (“primers”) de nucleótidos, que hibridan con
cadenas opuestas de la secuencia a investigar (figura).

El método consiste de los siguientes pasos:

 Separación por calor de las cadenas e hibridación de

los cebadores

La técnica trabaja usando calor para separar las dos cadenas de

ADN, lo que permite que los cebadores se unan a sus secuencias
complementarias.

 Amplificación

El segmento entre los cebadores se amplifica en presencia de la Taq

polimerasa y desoxinucleótidos.

 Cambios cíclicos de temperatura

Incremento de la temperatura detiene la reacción, y vuelve a

comenzar cuando la temperatura se disminuye. La cantidad de ADN
incrementa rápidamente cada vez que el ciclo ocurre.

2. Aplicaciones.

Es extremadamente importante debido a su sensibilidad,

especificidad, y velocidad.

Ha revolucionado el análisis genético y la detección de

patógenos de enfermedad.

Se utiliza para identificar mutaciones específicas causantes

de enfermedad.

Para tipificar marcadores de ADN en estudios de ligamiento.

Como un test rápido para identificar micobacterias atípicas.

3. Ventajas y limitaciones.

• Una ventaja es que únicamente se requieren cantidades pequeñas de ADN (1 ug o menos, o únicamente
una sola célula).

• Una limitación es que se debe conocer la información de la secuencia para sintetizar los cebadores
oligonucleótidos que son esenciales para la PCR.

 Secuenciación de ADN

La manera más precisa de caracterizar un segmento de ADN es obtener la secuencia de ADN exacta y de ésta
manera identificar variantes anormales.

1. Método.

Se utilizan dos métodos para determinar la secuencia de ADN, los cuales se basan en la separación de fragmentos
que varían en longitud por un solo nucleótido.

Los métodos establecidos (método de Sanger y método de Maxam-Gilbert).

2. Aplicaciones.

Se pueden utilizar para secuenciar rápidamente los fragmentos que resultan de una reacción de PCR.

No se utiliza en forma rutinaria para el diagnóstico de ADN, pero su importancia se incrementa en la medida en
que la tecnología mejore y los costos disminuyan.

3. Ventajas y limitaciones.

Permite detectar directamente si el gen de un paciente tiene cualquier cambio en la secuencia cuando se
compara con un control normal y además determinar si es una variante polimórfica o una mutación deletérea.

 Análisis por sondas oligonucleótidas alelo-específicas (ASO).

1. Método.

• Utiliza dos sondas oligonucleótidas sintéticas: una sonda específica para el gen normal y otra sonda
específica para una mutación genética conocida.
 • Las sondas ASO para el gen normal y el mutante se utilizan como sondas de hibridación para determinar
si un paciente tiene dos copias de un gen normal o de una mutación responsable de una enfermedad
particular.

2. Aplicaciones.

Es de mayor utilidad para diagnosticar enfermedades genéticas que típicamente surgen por una sola mutación
predominante (ejemplo, anemia falciforme, deficiencia de alfa-1 antitripsina).

3. Ventajas y limitaciones.

Se puede utilizar sobre ADN que se ha amplificado selectivamente por PCR, y generar un diagnóstico por ADN
rápido y seguro.

Se requiere un conocimiento preciso de la estructura del gen normal y la base molecular de la mutación.

Muchas enfermedades presentan mutaciones específicas y separadas en cada familia.

 SSCP (Polimorfismo Conformacional de Cadena Única).

1. Método.

Bajo condiciones apropiadas está técnica permite la identificación de diferencias entre secuencias de ADN de un
paciente con una enfermedad particular y de un control normal.

Estas diferencias se detectan por cambios en el patrón de bandas que se genera.

2. Aplicaciones.

Detecta tanto polimorfismos o variantes normales de ADN como las variantes en secuencia que generan
enfermedad por lo que se debe complementar con secuenciación del fragmento alterado.

3. Ventajas y limitaciones.

Permite un rápido barrido de posibles mutaciones para un

gen particular.

Es muy útil para hacerle un barrido a fragmentos de ADN

de genes con sospecha de mutaciones que se han
amplificado por PCR.

Como detecta, pero no distingue variantes de ADN

polimórficas de las variantes que causan enfermedad,
requiere secuenciar los fragmentos alterados.

DETECCIÓN DE MUTACIONES CONOCIDAS: DIAGNÓSTICO DIRECTO DE ADN

Las mutaciones que se pueden detectar directamente son reordenamientos grandes de genes (delecciones,
inserciones, duplicaciones) y mutaciones de punto (sustituciones de un solo nucleótido).

Reordenamientos grandes de genes:

- Importancia en genética clínica

Son causas poco comunes de mutaciones en el genoma humano.

Por ejemplo, generan menos del 10% de las mutaciones que causan hipercolesterolemia familiar (HF) y
hemofilia.

Sin embargo, el 50% de los casos de alfa-talasemia, distrofia muscular de Duchenne (DMD), y distrofia
muscular de Becker (DMB) son generados por delecciones de los genes alfa-globina y distrofina,
respectivamente.

- Estrategia para detección

E gen normal debe estar clonado y en disposición de usarlo como una sonda.

Si los reordenamientos son suficientemente grandes, y se conoce la secuencia genética que los rodea, estos
reordenamientos se pueden detectar fácilmente por Southern blot o PCR.

- Ejemplos de desórdenes causados por reordenamientos genéticos grandes

Distrofia muscular de Duchenne (DMD)

Características clínicas:

Es un desorden heredado ligado al X que se presenta temprano en la niñez

con retardo para caminar y en el desarrollo general. Lleva a debilidad
generalizada con pseudohipertrofia de las pantorrillas.

Viven aproximadamente 16-18 años. La muerte ocurre por problemas

cardiorrespiratorios.

Ocurre en ~ 1/4000 varones nacidos.

Bases genéticas:

Es causada por múltiples defectos diferentes en

el gen de la distrofina, que mapea en Xp.

Una mutación de corrimiento del marco de

lectura, que interrumpe la codificación de la
proteína, genera con mayor probabilidad DMD
que DMB.

Diagnóstico:

Se puede diagnosticar utilizando la tecnología de ADN bien sea detectando la alta frecuencia de delecciones en
el desorden o usando marcadores polimórficos dentro y alrededor del gen.

Ejemplo clínico de diagnóstico directo de ADN en la DMD:

A un niño de 6 años se le diagnóstico DMD. La tía materna del niño

planea un embarazo y desea saber su riesgo de tener un niño con
DMD (Figura). No hay otros miembros familiares con DMD.

En este caso, el análisis de ADN por Southern blot reveló que el niño
tiene una delección grande en su gen distrofina. Su mamá tiene una
delección similar y es portadora de DMD. El análisis de ADN de la tía
del niño mostró que ella no tiene la delección en el gen DMD. Por lo
tanto, su descendencia no tiene un riesgo aumentado de tener DMD.
Distrofia muscular de Becker (DMB)

Características clínicas:

Similares a las de DMD, pero más leves.

Bases genéticas:

Se ha demostrado que es alélica a DMD, también con defectos en el gen distrofina que genera una presentación
de los síntomas más leve.

Diagnóstico:

Se puede diagnosticar detectando la alta frecuencia de delecciones en el desorden.

Hipercolesterolemia familiar

Características clínicas:

En personas con HF, el colesterol LDL no se elimina apropiadamente de la circulación debido a mutaciones en
el receptor LDL de tal manera que los niveles aumentados de LDL generan daño en las paredes de los vasos
sanguíneos y arterosclerosis prematura.

Ocurre en la población general en ~ 1/500 personas, pero en ciertas partes del mundo (Quebec, Canadá;
Sudáfrica) en ~ 1/100 personas.

Es importante el barrido de HF debido a que genera una alta frecuencia de ataques cardiacos prematuros y
muerte temprana.

El tratamiento se enfoca en disminuir los niveles de colesterol, para posteriormente disminuir el riesgo de eventos
arterioscleróticos.

Bases genéticas:

Condición heredada como característica

autosómica dominante que ocurre
frecuentemente por defectos en el gen para el
receptor LDL.

Se reportan mutaciones diferentes en la

mayoría de las familias (la misma mutación no
causa HF en todas las familias afectadas por
HF).

Los reordenamientos grandes no son la causa

del número muy grande de mutaciones que
responden por HF, excepto en la población
Franco Canadiense en la que una delección
grande responde por el 65% de los pacientes con HF.

Mutaciones de Punto

1. Importancia en genética clínica:

Las mutaciones de punto representan el tipo más común de mutaciones en las enfermedades genéticas.

Algunas mutaciones de punto son de cambio de sentido (“missense”) y otras son sin sentido.
2. Estrategia de detección.

El diagnóstico directo del ADN requiere que el gen normal este clonado y disponible para usar como sonda.

El análisis Southern blot o la amplificación por PCR y digestión con la enzima apropiada puede revelar un patrón
alterado de fragmentos de restricción entre las personas normales y afectadas.

 Ejemplos de desórdenes causados por mutaciones de punto que alteran frecuentemente

sitios de restricción

Enfermedad de Tay-Sachs

Características clínicas:

Es un defecto en la degradación lisosomal de gangliosidos que terminan

acumulándose en las neuronas de los pacientes.

La enfermedad infantil ocurre con la más alta frecuencia en la población

judía Ashkenazi (tasa de portadores de ~ 1/25).

Niños con la enfermedad presentan debilidad motora

aproximadamente a los 5 meses de edad; deterioro mental y motor
progresivo. Termina en la muerte entre el segundo y cuarto año de
vida.

Bases genéticas:

Se reportan muchas mutaciones diferentes que causan la enfermedad de Tay-Sachs.

Aun en la población Judío-Ashkenazi ocurre la heterogeneidad molecular, pero hay una mutación predominante
que altera un sitio de restricción.

Anemia falciforme

Las mutaciones de punto similares que alteran sitios de restricción pueden ayudar en el diagnóstico de la anemia
falciforme.

En esta enfermedad hereditaria común en ancestros africanos, la mutación en la beta-globina cambia el

aminoácido glutamina por valina debido a un cambio en el codón GAG por GTG. Este cambio también elimina
un sitio de restricción particular.

Las personas con anemia falciforme tienen un fragmento de ADN anormalmente largo que se detecta después
de hibridación con ADN beta-globina digerido con la enzima apropiada.
Hay mutaciones de punto que no alteran directamente sitios de restricción.

Un ejemplo de una enfermedad con una mutación

predominante en esta categoría es la fibrosis quística
(FQ).

Características clínicas

Obstrucción intestinal e infección son las manifestaciones

más amenazadoras.

En poblaciones blancas tiene una incidencia de ~ 1/2500

nacimientos y de portadores de ~ 1/20 personas.

La esperanza de vida es de 20 años.

Bases genéticas

Es una enfermedad autosómica recesiva.

El gen ya está clonado y se han definido más de 250 mutaciones.

Aproximadamente en el 70% de pacientes blancos con FQ se ha demostrado una delección de 3 pares de bases
(3 pb) que no altera un sitio de restricción.

El análisis por sondas ASO es una manera simple y rápida de hacer un barrido de las mutaciones más comunes
en la población general.

En base al conocimiento de la frecuencia de mutaciones especificas responsables de FQ en la población blanca

de descendientes de Europa Occidental, es posible detectar ~ 90% de los portadores de FQ.

DETECCIÓN DE MUTACIONES DESCONOCIDAS: DIAGNÓSTICO DE ADN INDIRECTO

En muchas enfermedades heredadas las mutaciones causantes no se conocen.

En algunos casos, estos desordenes se pueden diagnosticar indirectamente, usando marcadores para el gen
mutante.

Estas etiquetas (“tags”) son variaciones en el ADN que no causan la enfermedad pero que están muy cerca o
ligados al gen o mutación de interés.

1. Limitaciones del diagnóstico de ADN indirecto.

A. Se necesita un gran número de familiares para determinar la forma en que el marcador segrega con el gen
mutante en la familia.

B. La distancia entre el marcador y el alelo mutante limita la seguridad del diagnóstico.

• Por cada distancia de 1 millón de pb entre el marcador y el gen, hay un 1% de probabilidad de

recombinación durante cada meiosis, que puede generar resultados incorrectos .
• Por ejemplo, se ha demostrado que en una familia particular una enfermedad autosómica dominante
segrega con el marcador A, cualquier descendiente que herede el marcador A de una persona afectada
cuyo ADN tiene marcadores AB tiene también una alta probabilidad de haber heredado el gen mutante.

• La seguridad de la prueba depende grandemente de la distancia entre el marcador y el gen mutante.

C. Heterogeneidad genética.

Cuando se utiliza la aproximación indirecta al diagnóstico del ADN, es importante conocer la probabilidad de
heterogeneidad genética (si hay mutaciones en diferentes loci que responden por una enfermedad particular en
diferentes familias).

La enfermedad riñón poliquístico (ERP) y la enfermedad de Alzheimer son ejemplos de enfermedades

que presentan heterogeneidad genética.

El gen responsable de ERP ya se identificó. Se ha encontrado que ERP lo causan mutaciones en un gen sobre el
cromosoma 16 en la mayoría de las familias. Sin embargo, algunas personas con ERP tienen una mutación
causante sobre otro cromosoma.

Si se utiliza en todas las instancias para determinar el riesgo de alguien de tener el gen mutante un marcador
de ADN cerca del gen sobre el cromosoma 16, el resultado de la prueba de ADN probablemente será incorrecto
en las familias donde el gen causante esta sobre otro cromosoma.

El descubrimiento de la heterogeneidad genética ha hecho que el diagnóstico por ADN de ERP sea
difícil.

En cada caso, la probabilidad de que el gen mutante en ese paciente este sobre el cromosoma 16 se debe
determinar antes de que se utilice el análisis adicional de ADN para estimar el riesgo de la enfermedad.

2. Aplicaciones especiales para el diagnóstico de ADN indirecto: enfermedades debido a un gen

conocido.

A. Cuando el gen causante de enfermedad está identificado pero la mutación específica en una familia particular
no se conoce.

• Las variaciones en la región no codificadora dentro del gen que puede ser un STR o que alteren un sitio
de restricción pueden ayudar a marcar el gen anormal y trazar su herencia.

• En este caso, se necesitan muestras de ADN de miembros de la familia.

• La seguridad de la prueba será muy alta, debido a que la distancia entre la variación de ADN no dañina
que altera un sitio de restricción y la variación del ADN que causa la mutación probablemente es pequeña.
Ejemplos clínicos de diagnóstico de ADN indirecto.

1. Aproximación general de diagnóstico de ADN indirecto.

A. Presentación del paciente

El probando es un hombre de 30 años

de edad (III-1) que necesita una prueba
predictora para neoplasia endocrina
múltiple tipo 1 (MEN1), desorden
genético autosómico dominante con
variabilidad en la expresión y en la edad
de la manifestación. Su padre (II-1)
murió de la enfermedad, que fue
confirmada por autopsia, y el probando
(III-1) quiere saber si ha heredado el
gen anormal. Además, él está
considerando tener hijos y quiere
conocer su estatus antes de intentar
reproducirse.

B. Prueba

Se han identificado marcadores de ADN cercanamente ligados al gen anormal.

Después del consejo inicial, se colecta sangre de diversos y apropiados miembros de la familia afectados y no
afectados para análisis de ADN.

El análisis revela que el probando (III-1) heredó el marcador que estaba segregando con el gen.

C. Resultados

El probando tiene un riesgo del 98% de haber heredado el gen de la enfermedad.

D. Discusión

En este caso se necesitó sangre de diversos parientes para realizar el análisis.

Se pudo estimar el riesgo debido a que numerosos marcadores de ADN estaban disponibles y a que esta
enfermedad tiene un riesgo muy bajo de heterogeneidad genética.

El primo de 1er grado del probando (III-2) también solicitó una prueba predictora y se encontró dos marcadores
AA. Debido a que el marcador A no se hereda con la enfermedad, el primo del probando tiene un riesgo muy
bajo de haber heredado la enfermedad.

2. Aproximación de ADN indirecto: diagnóstico de fenilcetonuria (PKU)

A. Presentación

Una pareja joven (25 años) tienen una niña de 5 años con PKU, desorden autosómico recesivo causado por un
defecto del gen de la fenilalanina hidroxilasa.

La niña afectada está bajo una dieta especial y presenta un retraso leve del desarrollo.

Recientemente la pareja se dio cuenta de que estaban esperando otro bebé, y anhelan saber si este bebé tendrá
PKU.
B. Prueba de ADN

El gen para la fenilalanina hidroxilasa está

clonado, pero la mutación específica responsable
de PKU del niño de 5 años no se conoce.

Sin embargo, variaciones en las regiones no

codificadoras del gen PKU se pueden utilizar para
determinar si el feto este afectado
probablemente de PKU, o sea portador de PKU o
tenga los dos genes fenilalanina hidroxilasa
normales.

Tanto el padre como la madre tienen marcadores

AB.

C. Resultados

El análisis de ADN reveló que el niño afectado heredó un marcador B de la madre y un marcador B del padre
(Figura).

En ambos padres la mutación debe haber ocurrido en el gen PKU que tenía un marcador B.

A la mamá se le realizó biopsia de vellosidades coriónicas a las 10 semanas de gestación, y el análisis de ADN
reveló un patrón AB (el feto es portador de PKU, pero no estará afectado).

D. Discusión

La seguridad de esta predicción es de cerca del 100% debido a la distancia muy pequeña entre la variante de
ADN usada como etiqueta para el gen de PKU y el sitio actual de la mutación en el gen PKU.

BANCOS DE ADN

Frecuentemente, cuando se desconoce la mutación especifica responsable de una enfermedad, se requiere ADN
de los parientes afectados y no afectados para realizar un análisis de ADN y determinar cuál forma del marcador
se está heredando con el gen de la enfermedad y con el gen normal.

Las fuentes de ADN más importantes para estos análisis son las de las personas afectadas por la enfermedad y
sus padres.

Los bancos de ADN almacenan ADN de parientes cruciales en un esfuerzo por asegurar que a ningún
miembro de la familia se le niegue la prueba de ADN debido a que no hay ADN informativo.

El ADN se puede obtener a partir de cualquier tejido.

Sin embargo, por conveniencia, usualmente se obtiene de linfocitos.

En situaciones que se necesite gran cantidad de ADN para análisis, los linfocitos se pueden inmortalizar después
de exponerlos al virus Epstein-Barr o recientemente por métodos de amplificación completa del genoma (“Whole
Genome Amplification”).