UNIVERSIDAD NACIONAL DE

FRONTERA DE SULLANA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE
INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

GUÍA DE PRÁCTICAS

V CICLO

DOCENTE: BLGO. OSCAR JULIAN BERRIOS

TAUCCAYA

SULLANA – PERÚ

2019
 PRÁCTICA N° 03

ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN EN EL LABORATORIO

I. INTRODUCCIÓN

Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con material y
medios de cultivo estériles. En Microbiología la esterilización se define como “el proceso
mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un
objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de microorganismos en el
material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos métodos de esterilización, entre
ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias termolábiles y aire), radiaciones y
aplicación de gas de óxido de etileno (para jeringas y cajas de plástico).

En microbiología, como en cualquier otra ciencia es indispensable el uso del método científico,
por lo cual es necesario manejar para su práctica el menor número de variables posibles, entre las
variables que se pueden controlar se encuentra el material utilizado dentro del laboratorio de
microbiología.

En primer lugar, el material de vidrio que comúnmente se usa en el laboratorio de control

microbiológico debe estar limpio, seco y libre de cualquier tipo de contaminantes, ya que la
presencia de éstos aún en pequeñas concentraciones puede afectar los resultados analíticos. Otro
paso importante es el enjuague del material, éste debe ser suficiente y adecuado usando para ello
agua destilada con la finalidad de eliminar residuos de las soluciones detergentes, las cuales se ha
demostrado que pueden inhibir el crecimiento de los microorganismos o bien alterar el pH de
algunas reacciones.

Finalmente, para poder estudiar el comportamiento de los microorganismos en el laboratorio, el

microbiólogo deberá contar, entre otras cosas, con material y medio de cultivo estériles que eviten
la presencia de microorganismos indeseables que pudieran en un momento dado alterar los
resultados obtenidos de un análisis microbiológico.

II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo General

´Conocer y aplicar las técnicas de esterilización y desinfección en el laboratorio de

Microbiología

2.2. Objetivos Específicos

 Explicar el concepto de esterilización y asepsia y su aplicación en microbiología.

 Preparar correctamente el material que se someterá a esterilización.
 Aplicar algunas metodologías para esterilizar material
 Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.
 Eliminar adecuadamente los desechos biológicos.
 III. FUNDAMENTO TEÓRICO

El laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado para trabajar con

microorganismos. Se requiere un ambiente limpio y ordenado, así como una técnica aséptica.
Cuando manejamos cualquier tipo de muestra debemos evitar que microorganismos presentes en
el ambiente se introduzcan en nuestros cultivos contaminándolos, o que los microorganismos de
la muestra nos contaminen a nosotros. Por ello trabajaremos siempre en condiciones de
esterilidad. En el laboratorio de Microbiología encontraremos estas condiciones bien en cabinas
de flujo o bien en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas. Aunque los
microorganismos que se manipulen no sean considerados patógenos, todos los cultivos de todos
los microorganismos deben ser manejados con precaución por su potencial patogenicidad.

Nunca debe olvidarse la necesidad de cumplir dos requisitos básicos:

a) Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de

cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero.
b) Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa ...)
contaminen nuestras muestras.

Esterilización

La esterilización es el proceso de destruir todas las formas de vida microbiana; un objeto

esterilizado, en el sentido microbiológico, está libre de microorganismos vivos. Los términos
estéril, esterilizar y esterilización se refieren a la ausencia o destrucción completa de los
microorganismos y no se utilizan en sentido relativo, una sustancia o un objeto están estériles o
no están estériles, pero no semiestériles o casi estériles. Los métodos de esterilización son por:
calor (ya sea seco o húmedo), filtración, radiaciones y agentes químicos.

Esterilización por calor

La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los métodos más efectivos
para destruir microorganismos. Es importante distinguir entre calor húmedo y calor seco en
cualquier procedimiento de control microbiano; el calor húmedo mata a los microorganismos
porque coagula sus proteínas y es más rápido y efectivo que el seco, que los destruye al oxidar
sus constituyentes químicos. Los procedimientos prácticos se dividen convenientemente en dos
categorías:
1. El calor húmedo: que comprende los métodos de esterilización por vapor a presión
(autoclave) y la tindalización o esterilización fraccionada.
2. El calor seco: que comprende la esterilización con aire seco o caliente (horno) y la
incineración.

Esterilización por filtración

Algunos materiales, particularmente los líquidos biológicos como el suero de los animales o las
soluciones de sustancias como las enzimas y algunas vitaminas o antibióticos, son termolábiles,
o sea, se destruyen por el calor; asimismo, otros agentes físicos como las radiaciones son
perjudiciales para estos materiales e imprácticos para esterilizarlos, en consecuencia, queda la
opción de hacerlo por filtración. El material filtrante es de diferente naturaleza y puede ser de
asbesto, tierra de diatomeas o porcelana; actualmente el más usado corresponde a las membranas
de éster de celulosa. La eliminación de los microorganismos está en función de la carga eléctrica
y del tamaño de los poros del material filtrante; para su uso, en condiciones de asepsia, se coloca
el material filtrante sobre el soporte de la unidad de filtración (que debe ser previamente
esterilizada), se fija y posteriormente se hace pasar el líquido a través de la membrana o material
filtrante, recolectándose el filtrado en un matraz. Los filtros también se utilizan para esterilizar
aire, y un ejemplo cotidiano en el laboratorio de microbiología corresponde al uso de las torundas
de algodón que se emplean para tapar frascos, matraces, tubos y pipetas; el aire circula a través
del algodón y los microorganismos que están suspendidos en el aire quedan atrapados en el
algodón y no pasan al interior del material (ni tampoco salen del cultivo al exterior) a menos que
el algodón este húmedo.

Esterilización por radiaciones

Las radiaciones más comunes que se usan para destruir a los microorganismos son:
1. La luz ultravioleta. Se utiliza principalmente para la esterilización de áreas y superficies,
y cuya principal limitación es que debe ser absorbida para ser efectiva, no pasa a través
del vidrio transparente u objetos opacos e irrita los ojos y la piel.
2. La luz infrarroja. Se emplea para reducir la contaminación de ciertos alimentos y se
aplica durante la preparación de los mismos; el efecto esterilizante de este tipo de
radiaciones se debe a la energía térmica que imparte de manera rápida, y por ello oxidan
los componentes celulares de los microorganismos.
3. Radiaciones ionizantes. Se utilizan para la esterilización de material quirúrgico sensible
al calor y otros materiales usados en medicina.

Esterilización gaseosa

Algunos gases ejercen una poderosa acción letal sobre los microorganismos, ya que destruyen
varias enzimas y estructuras que son vitales para la duplicación de los mismos. El óxido de etileno
es un gas que se difunde a través de los materiales porosos y penetra fácilmente la mayoría de los
plásticos, tiene gran utilidad en la esterilización de artículos desechables, como las jeringas de
plástico, así como los instrumentos voluminosos, tales como las máquinas cardiopulmonares. La
esterilización se lleva a cabo a una temperatura de 50 +/- 2 °C, con una humedad relativa de 33%
durante tres horas; los productos que han sido sometidos a este tratamiento pueden usarse hasta
después de 24 horas de haber sido esterilizados, debido a que este gas es muy tóxico,
especialmente para los tejidos.

Finalmente, se debe recordar, además, que el material biológico utilizado en microbiología

(bacterias, hongos, etc.) NO debe ser desechado del laboratorio sin previa esterilización, pues este
material ya sea patógeno o no, está contribuyendo a un desequilibrio ecológico cuyas
consecuencias no se pueden determinar.

Terminología:

1) Esterilización. Es el proceso que destruye todas las formas viables de cualquier tipo de
vida microbiana. Por tanto, la esterilización es siempre total e incluye la destrucción de
las esporas y formas vegetativas, los virus, etc.

2) Desinfección. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los

microorganismos más comunes, pero no necesariamente las esporas. Reduce la carga
microbiana. Generalmente el desinfectante es un producto químico excesivamente tóxico
para ser usado directamente sobre tejidos vivos.

3) Asepsia. Se refiere a la ausencia de microorganismos de un objeto o área. Por ejemplo,

las técnicas asépticas son las que evitan la contaminación de los manipuladores o de los
materiales usados durante el trabajo.
 4) Antisepsia. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los
microorganismos más comunes, pero no necesariamente esporas, presentes sobre el
cuerpo, la piel, las mucosas, los tejidos vivos, etc. El agente empleado se denomina
antiséptico.

IV. MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRAS

a. Materiales

1) Gradilla.
2) Varilla de vidrio o agitador de vidrio.
3) Piseta.
4) Escobilla para tubos de ensayo.
5) Pipetas de 1 ml, 10 ml
6) Matraz.
7) Tubos de ensayo.
8) Placas de Petri
9) Papel kraft o papel de despacho (2 pliegos) (Estudiante)
10) Gasa. (Estudiante)
11) Cinta adhesiva. (Estudiante)
12) Tijeras. (Estudiante)
13) Algodón. (Estudiante)
14) Fósforos. . (Estudiante)
15) Papilo o cordón de cáñamo. (Estudiante)
16) Papel de aluminio. (Estudiante)
17) Clip (de escritorio). (Estudiante)
18) Plumón de tinta indeleble de punta gruesa. (Estudiante)
19) Hisopos (palitos de madera con algodón) (Estudiante)
20) Bolsas para descarte de basura. (Estudiante)
21) Toalla o tela de secado (que no desprenda pelusas) (Estudiante)
22) Detergente. (Estudiante)

b. Reactivos

1) Cloro al 5 %.
2) Alcohol al 70%
3) Tiras indicadores de esterilización (o viales de Bacillus stearothermophilus)

V. PROCEDIMIENTO

5.1. Limpieza general u ordinaria

1. Colocar el material en recipientes que contengan soluciones detergentes

apropiadas, procurando que el material quede totalmente sumergido; para
eliminar materia orgánica, dejar actuar durante 24 horas, si el material tiene
sales someterlo a un ligero calentamiento con HCl concentrado por espacio de
30 minutos.
2. Lavar el material con la solución detergente, auxiliándose de escobillones en
buen estado y de esponjas de celulosa o estropajos. No usar limpiadores
abrasivos.
 3. Enjuagar con abundante agua de la llave y al final con agua destilada por lo
menos tres veces.

Tratamiento severo

Si después del lavado ordinario en el material de vidrio permanecieran algunos

contaminantes que se manifiesten por la presencia de residuos o porque la superficie
del mismo no se humecta uniformemente, se recomienda sumergir el material en
mezcla crómica o en ácido sulfúrico como a continuación se indica.
1) Observando las medidas de seguridad adecuadas, sumergir el material en
mezcla crómica o en ácido sulfúrico durante 10-15 minutos.
2) Sacar el material y aplicarle el lavado ordinario como se indicó
anteriormente.

5.2. Preparación y esterilización de material de vidrio

Una vez tenido el material limpio y seco, se procede a acondicionarlo para su esterilización.

1) Elaborar torundas para matraz y tubos de ensayos:

a) Para el matraz: se necesita una porción de algodón de 8x16 cm. Doblarlo los
dados y luego se enrolla firmemente el algodón, formando la torunda y se
introduce con movimiento giratorio por la boca del matraz.
b) Para tubos de ensayo, se prepara de la misma manera que del matraz.
2) Cortar tirar de papel kraft de aproximadamente 2x45 cm aprox. Para pipetas.
3) Cortar un rectángulo de papel kraft de aproximadamente 22x32 cm o 2 por tres
diámetros de la caja de Petri de ancho por cuatro diámetros de la caja Petri.
4) En las pipetas colocar (con un clip) un filtro de algodón en la boquilla.
5) Envolver las cajas de Petri y pipetas con papel kraft de acuerdo a las
indicaciones del docente.
6) Introducir los hisopos con pajilla de madera en un tubo de 22x175 y tapar con
algodón.
7) En el papel de la envoltura identificar con nombre y marcar el volumen de las
pipetas.

5.3. Esterilización por calor húmedo (15 lb, 121 °c x 15-20 min)

1) Este proceso se aplica al material que no resiste temperaturas arriba de135° C (material
de vidrio con torunda de algodón, jeringas desarmadas –no agujas-, recipientes con
tapón de rosca –no cerrados fuertemente-, tapones de hule envueltos en papel).
2) Todo material a tratar en forma individual o conjunta debe cubrirse perfectamente con
material permeable, resistente al calor, no debe usarse papel aluminio o celofán.
3) Operar el esterilizador (autoclave) de acuerdo a las instrucciones del equipo. De manera
general el procedimiento es el que se indica a continuación: meter el material en la
autoclave, cerrarla, dejar calentar con la válvula abierta y esperar a que el aire del
interior de la autoclave sea desplazado totalmente por el vapor de agua, lo que se habrá
conseguido cuando a través de la válvula salga una columna continua de vapor de agua.
Cerrar la válvula y esperar a que la presión suba hasta 15 lb/in2 (15 psi) y una
temperatura de 121 °C. Mantener estas condiciones de 15 a 20 minutos (condiciones
generales requeridas para esterilizar el material).

5.4. Esterilización por calor seco (180 °c durante una hora).

1) Este proceso se aplica a todo material cuya resistencia térmica sea superior a los 150
°C (material de vidrio o metal con cierre hermético, cera, vaselina, aceite, talco).
 2) Todo material a tratar de forma individual o conjunta debe cubrirse perfectamente con
papel aluminio o colocarse en recipientes de acero inoxidable. No usar fibras sintéticas
o de algodón.
3) Al final del proceso dejar enfriar el material dentro del horno.

5.5. Prueba de esterilidad

Pueden utilizarse bioindicadores (por ejemplo, esporas de Bacillus stearothermophilus) o

tiras indicadoras.

VI. FORMATO DE PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

q. Esquematice los procedimientos de la práctica.

r. Responda el cuestionario.

VII. CUESTIONAMIENTOS

1) ¿Cuál material se puede esterilizar por calor seco y cual no? ¿Por qué?
2) ¿Qué tipo de material se puede esterilizar por calor húmedo?
3) ¿A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen todas las formas vegetativas?
4) ¿A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen las esporas?
5) ¿Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor seco?
6) ¿Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor
húmedo?
7) ¿Cómo actúa la esterilización por calor seco en los microorganismos?
8) ¿Cómo actúa la esterilización por calor húmedo en los microorganismos?
9) ¿Qué tipo de esterilización es más recomendable y por qué?
10) ¿Por qué antes de una esterilización es necesario lavar y desinfectar el material?
11) ¿Es necesario un secado del material en el horno antes del empacado con papel kraft? ¿Por
qué?
12) ¿Qué finalidad tiene el empacado antes de la esterilización?
13) ¿Puede ser utilizado otro tipo de papel que el de Kraft? ¿Por qué?
14) ¿Qué finalidad tienen los tapones de algodón que se colocan en los extremos de las pipetas y
de los matraces Erlenmeyer?
15) ¿Qué desventaja tiene utilizar la esterilización por calor seco en este laboratorio?