Istoricul Enzimologiei

2100 I.C.- procedeul de fabricare a vinului in vechiul Babilon.

7000 de ani I.C- microorganismele -surse enzimatice –utilizate pentru obtinerea otetului si a produselor
lactate branza era preparata prin inchegarea laptelui prin actiunea unor enzime proteolitice numit ficina
(obtinuta dintr-un extract de smochin) si renina (obtinuta sub forma unui precursor din stomacul
bovinelor, oilor sau caprelor tinere).
- Dospirea aluatului (in cazul producerii painii) este de fapt datorat producerii dioxidului de carbon pe
cale enzimatica.
- Fragezirea carnii prin utilizarea papainei din sucul de papaia (folosit de locuitorii din insulele
Pacificului).
- Primele ipoteze despre natura proceselor fermentative au fost emise de elvetianul Theophanus
Bombastus von Hohenheim (denumit Paracelsius) inca din secolul XV.
- Secolul XVII- Francois Dubois de la Boe -fermentatia -proces pur chimic datorita sucurilor digestive.
- Secolul XIX –Theodor Schwann (1838) -fermentatia este un proces biochimic, a descoperit pepsina, a
introdus termenul de metabolism.
- Louis Pasteur - 1857-“Cercetari asupra fermentatiei” fermentatia este cauzata de microorganisme
(fermenti) si nu este de natura chimica.
- descopera bacteria Acetobacter aceti –
fermentatia acetica a vinului
Fiziologul rus, I. P. Pavlov (1849-1936) fundamenteaza biochimia digestiei.
Secolul XIX- descoperirea unor enzime: invertaza, tripsina, amilaza, peroxidaza.
- progrese in caracterizarea si purificarea enzimelor
1894- E. Fischer a formulat ipoteza specificitatii enzimelor pentru substrat.
Secolul XX:
• Descoperirea unor coenzime: NAD+, ATP, coenzima A, etc
• Inceputul biotehnologiilor enzimatice (Burnus- enzime pacreatice de porc –crearea de
detergent).
• Dezvoltarea enzimologiei mecanistice.
• Cinetica enzimatica -Michaelis si Menten (1913)
• Interactiunile de tip alosteric- Monod, Wyman si Changeux (1965 )
In 1971 D. Nathans si H. Smith au obtinut diferite enzime de restrictie –(premiul Nobel pentru fiziologie
si medicina)- revolutionarea domeniului biologiei moleculare si a biotehnologiilor enzimatice.

Studiul structurii enzimelor: Cristalografia cu raze X sau rezonanta magnetica nucleara (RMN) au pus in
evidenta structurile tridimensionale (3D).
Prima enzima care a fost cristalizata si studiata de J. Sumner cu ajutorul difractiei de raze X -ureaza din
fasole in 1926.
John Desmond Bernal - prima fotografie de difractie cu raze X a unui cristal proteic (pepsina) in 1934.
1962 - Premiul Nobel in Chimie - John Kendrew si Max Perutz – pentru caracterizarea structurii 3D a
unor globuline (hemoglobina)
Aceste tehnici: sunt frecvent utilizate pentru elucidarea unor mecanisme de cataliza enzimatica si
interactiuni ale enzimelor cu diferiti liganzi.
Enzimologia moderna-Utilizarea practica a enzimelor:
 Industria alimentara, textila, chimica, etc)
 Epurarea apelor reziduale (epurare biologica)
 Agricultura (fertilizatori, pesticide, epurare)
 Producerea de biocombustibili (producerea enzimatica de biocombustibili din uleiuri sau
polizaharide)
 Industria farmaceutica
 Medicina umana si veterinara etc.

Enzimele sunt catalizatori biologici (fermenti).

Enzimele sunt in general proteine cu rol biocatalitic.
>100 aminoacizi, >10kDa
Au structura primara, secundara, tertiara, cuaternara.
Tehnici: cercetare cristalografica cu raze X, spectrometrie de masa, fluorescenta, tehnici imunologice,
etc.
Exista specii de ARNr cu rol catalitic .
 ARNr 23 S (din subunitatea mare 50S a ribozomilor de la procariote) = Peptidil-transferaza
catalizeaza, formarea legaturii peptidice intre aminoacizi in timpul sintezei proteice.
Caracteristici generale ale enzimelor
Diferente dintre enzime si catalizatori chimici:
 Enzimele sunt in general proteine
 Enzimele au specificitate pentru un substrat
 Specificitatea poate fi “ingusta” pentru un singur fel de substrat (ex. D-Glucoza) sau poate fi
“larga” pentru o multitudine de substrate (ex. Hexoze).
 Enzimele au afinitate pentru substrat.
 Putere catalitica
 Capacitatea de a lega liganzi
 Au o ToC si pH optim de functionare
 Nu sunt produse sau consumate in timpul unei reactii chimice
 Nu declanseaza o reactie chimica ci intensifica viteza reactiei chimice
 Enzimele modifica viteza reactiei dar nu constanta de echilibru a reactiei catalizate.
Cat timp decurge o reactie catalizata enzimatic?
Dupa solubilitatea (localizarea) enzimelor:
Enzime hidrosolubile –majoritatea enzimelor (ex. Enzimele cu localizare citosolica, lumenala sau
matriceala)
Enzime partial hidrosolubile sau insolubile in apa (ex. cu localizare membranara, periferica sau
transmembranara)
Dupa criteriul structural:
2 categorii de enzime:
 Enzime numai de natura proteica sau ARN:
Ex: enzime de natura proteica, ribonucleaze, hidrolaze, sau de natura ribonucleica, ARNr 23S (peptidil
transferaza) etc.
 Enzime alcatuite dintr-o parte proteica sau ARN si una micromoleculara cu rol catalitic.
Nota: Majoritatea enzimelor sunt de natura proteica avand si o parte micromoleculara cu rol catalitic.
Structura majoritatii enzimelor

Componenta proteica sau ribonucleica a enzimei

- determina caracterul de izoenzima,
- determina specificitatea de substrat
- dirijeaza specificitatea de actiune.
Componenta micromoleculara
- termostabila
- joaca rolul de coenzima sau grupare prostetica si este implicata in mecanismul catalitic.
Structura spatiala a apoenzimelor de natura proteica
Structura spatiala a apoenzimelor de natura ribonucleica
Ribozimele sunt molecule de ARN cu rol catalitic care recunosc pe baza de complementaritate molecule
de ARN si catalizeaza clivarea legaturii fosfodiesterice dintre nucleotide. Primele studii asupra
ribozimelor au fost efectuate de catre Thomas Cech pe grupul I de introni de la protozoarul ciliat
Tetrahymena thermophila in anii ‘80, aratand capacitatea de cataliza intramoleculara a procesului de
self-splicing ( autoinadire).
In acest caz, ribozimele au nivele de organizare primara (succesiunea de nucleotide), secundara (in
anumite regiuni molecula are portiuni bicatenare) si tertiara (structura in spatiu , tridimensionala a
ribozimei)
Centrul activ al enzimelor
Centru activ= totalitatea gruparilor chimice din molecula enzimei care recunosc, leaga specific si
transforma molecula de substrat.
 Cuprinde un numar mic de aminoacizi: catalitici sau de specificitate.
 Confera specificitate enzimelor pentru substrat.
 Are un caracter hidrofob.
Interactiunea centru activ - substrat
2 modele:
Mecanismul cheie-broasca - Emil Fischer, 1890

Mecanismul potrivirii induse - Daniel E. Koshland,Jr., 1958

Centrul reglator al enzimelor

Este diferit de centrul activ (catalitic) al enzimelor.
 Este caracteristic enzimelor cu cinetica de tip alosteric.
Leaga moleculele de liganzi (efectori) (nu sunt substrate ale enzimelor).
Efectorii legati de enzima modifica proprietatile catalitice ale acesteia.
Cofactori: 2 categorii
 Coenzime
 Grupari prostetice
Coenzime (cofermenti) = cosubstrate: gruparile usor disociabile cu apoenzima.
Exemple: nicotinamid – nucleotidele (NAD, NADP), glutationul, nucleozid-coenzimele (ATP, UTP, CTP),
adenozilmetionina, coenzima A, acidul di- si tetrahidrofolic.
 Importanta coenzimelor in cadrul metabolismului intermediar consta in faptul ca fac legatura
intre diversele enzime; de aceea Bücher a denumit coenzimele “metaboliti de transport”.
 Specificitatea de actiune a enzimei este atribuita apoenzimei din enzima. Exemplu
piridoxalfosfatul, care reprezinta gruparea activa a transaminazelor, decarboxilazelor, liazelor si
sintetazelor.
Coenzime (cofermenti) = cosubstrate: gruparile usor disociabile cu enzima.

Ele preiau rolul de donor si acceptor de grupari reactive. Coenzimele actioneaza ca un al doilea substrat,
care este substituit substratului propriu-zis in mod stoichiometric (mol la mol) si nu catalitic.

Grupari prostetice =acele grupari micromoleculare, strans legate de apoenzima prin legaturi covalente
stabile – grupari ce nu pot fi separate prin dializa
´
Exemple: tiaminpirofosfatul, flavin mono- si dinucleotidul, piridoxalfosfatul, acidul lipoic, biotina, hemul
etc.
 In cazul sistemelor enzimatice in care gruparile active prostetice sunt strans legate de proteina
enzimatica, actiunea catalitica a enzimei devine posibila prin reactia ei la scurt interval cu doua
substrate diferite.
VITAMINE
  =“amina vitala” sau amina necesara vietii. Originea cuvantului se datoreaza primului compus
din aceasta grupa, vitamina B1 (tiamina), izolat de Funk in 1911 si utilizat la tratarea bolii “beri-
beri”.
 sunt compusi organici esentiali care, in cantitati extrem de mici, sunt indispensabili desfasurarii
normale a proceselor vitale.
Sinteza vitaminelor
Vitaminele sunt esentiale pentru desfasurarea normala a proceselor metabolice.
Capacitatea de sinteza a vitaminelor: in special organismele autotrofe.
Organismele heterotrofe au pierdut partial sau total capacitatea de sinteza a vitaminelor.
Exemple:
 pentru om: exista cel putin 12 compusi exogeni cu rol de vitamina
 vitamina C este necesara numai pentru primate si cobai
 carenta in acid para-aminobenzoic determina incetarea cresterii la pasari si decolorarea parului
la sobolani (acromotrichie), dar nu este necesar pentru om.

 Vitaminele sunt produse din precursori (provitamine)

Acidul nicotinic este sintetizat din triptofan.
Vitamina A este produsa din carotenoizi.
Numeroase vitamine sunt produse, prelucrate sau consumate de flora microbiana din intestinul
organismelor animale.

Vitaminele sunt necesare in cantitati mici

ex: 5 g /zi Vit D
400 g / zi acidul folic
14 g / zi biotina
90 mg/zi Vit C
Provitamine, vitamere, vitagene
Provitamina = precursori de natura exogena, inactivi biologic, care se pot transforma in organism in
vitamine active.
Exemplu: carotenozii pentru vitamina A
Vitamerele = analogi ai vitaminelor cu structura apropiata si actiune similara. Vitamerele pot fi
sintetizate chimic, iar actiunea lor poate uneori depasi de multe ori actiunea vitaminei propriu-zise.
Vitagenele sunt factori esentiali care se comporta similar vitaminelor, dar care intra in structura
celulara sau servesc ca sursa de energie pentru celula vie.
Exemplu: acizii grasi nesaturati esentiali ca acidul linoleic si linolenic (vitamine F), sau aminoacizii
esentiali.
Dezechilibrul in aportul de vitamine: hipovitaminoze, avitaminoze si hipervitaminoze.
Functiile vitaminelor
 Functioneaza ca unitati individuale (nu sunt condensate in polimeri).
 Nu sunt utilizate ca surse de energie si nu au rol structural!!!
 Intretin procese vitale: cresterea, reproducerea, vederea, formarea sistemului osos, rol de
protectie impotriva speciilor reactive de oxigen, in coagulare.
 Vitaminele participa la realizarea unor procese biochimice importante. In 1932, Warburg si
Christian: multe vitamine functioneaza ca parti active ale unor enzime, in calitate de coenzime.
Vitamine cu rol de cofactori
Actioneaza, in general, drept “carausi” pentru anumite grupari functionale (grupari metil, grupari acil)
Toate vitaminele hidrosolubile sunt cofactori
Dintre vitaminele liposolubile numai vitamina K este transformata in cofactor in organism.

Vitamina B3 (Nicotinamida (niacinamida, PP, vitamina pelagropreventiva))

Nicotinamida este o piridin-3-carbonamida, avand un nucleu piridinic substituit.
Acidul nicotinic (acid piridin-3-carboxilic) = provitamina PP (vit. B3 sau niacina).
Nicotinamida isi exercita actiunea dupa prealabila incorporare in structura coenzimelor nicotinamidice.
Surse bogate de vitamina B3
Carnea de pasare, ficatul si rinichii, drojdia de bere si de paine, faina de grau integrala, fructe uscate,
nuci.
Acidul nicotinic poate fi sintetizat din triptofan, cu viteze diferite in organismul animal, dar viteza sa de
sinteza este insuficienta pentru a asigura necesarul de vitamina pentru organism.
Triptofanul poate substitui acidul nicotinic. 60 mg de triptofan sunt echivalente cu 1 mg de vit. B3; 60 g
de proteina contin 600 mg de triptofan = 10 mg vit.B3
Functia de coenzima a vitaminei B3
Nicotinamida intra in structura a doua coenzime nicotinamidadenindinucleotidul (NAD) si
nicotinamidadenindinucleotid-fosfat (NADP), coenzime ale transferului de hidrogen.

Functia nicotinamid-nucleotidelor
preluarea reversibila a unui atom de hidrogen de pe substrat sub forma de ion de hidrura (1H+ + 2e-),
inelul piridinic se reduce, inelul heterociclului devenind dihidropiridinic. Pe inelul piridinic se fixeaza un
singur atom de H, cel de al doilea hidrogen scos de la substrat ramanand ca proton in faza apoasa, in
imediata vecinatate a inelului dihidropiridinic.

Aceste coenzime intra in constitutia enzimelor numite dehidrogenaze NAD(P) dependente implicate in
metabolismul intermediar al principalilor compusi organici din celula.
Proprietatile spectrale ale nicotinamid-nucleotidelor reduse/oxidate
Importanta in determinarea activitatii enzimatice a enzimelor NAD/NADP dependente
Carenta de vitamina B3
La om, carenta vitaminica produce boala “pelagra” ce se manifesta prin simptome cutanate, digestive si
nervoase caracteristice, reunite sub denumirea “sindromul celor 3D” (dermatita, diaree, dementa).
Apare in special la populatiile a caror aliment de baza este faina de porumb, ce contine cantitati mici de
triptofan.
Pelagra poate aparea si datorita tulburarilor de metabolizare a triptofanului, ca si in unele fenomene
carentiale consecutive alcoolismului cronic.
Vitamina B2 (riboflavina, lactoflavina)
Riboflavina (7,8-dimetil-10-(1'-D-ribitil)-izoaloxazina).
Este un derivat al pentaalcoolului ribitol legat de un nucleu izoaloxazinic.
Face parte din categoria pigmentilor galbeni denumiti flavine.
Este rezistenta la actiunea oxidantilor si sensibila la actiunea substantelor reducatoare.
Surse de vitamina B2
Riboflavina este sintetizata de unele microorganisme (flora bacteriana intestinala) si plante.
Se gaseste in forma libera numai in lapte (lactoflavina).
Surse de vit. B2: drojdii, (drojdia de bere si drojdia de paine), produse alimentare de origine vegetala
(legume, fructe), ca si de origine animala (carne, lapte, oua).
Vitamina B2 cu rol de cofactor
Primele observatii - Warburg si Christian (1932), care au descoperit ca “fermentul galben” este o enzima
flavoproteica, Kuhn (1935) - riboflavina = o parte componenta a “fermentului galben”.
Riboflavina este gruparea prostetica a enzimelor oxidoreducatoare flavoproteice, sub forma de
flavinmononucleotid (FMN) si flavinadenindinucleotid (FAD).
Preia 2H fie direct de pe substrate (aminoacizi, amine alifatice sau aromatice), fie de la formele reduse
ale coenzimelor piridinice (NADH) (din cadrul lantului respirator mitocondrial).
Functia dehidrogenazica este realizata de nucleul izoaloxazinic, care actioneaza ca un sistem
oxidoreducator reversibil. Hidrogenii se fixeaza pe atomii de azot din pozitiile 1 si 5 ale nucleului
izoaloxazinic fiind ulterior cedati.

Exemple de reactii dependente de FMN sau FAD

1) Hidrogenii sunt transferati de o flavoprotein dehidrogenaza pe O2 cu formarea peroxid de hidrogen
(H2O2) (in decursul β-oxidarii peroxizomale a acizilor grasi cu >20C).

2) FAD/FMN transfera hidrogenii altor compusi redox (intermediari in lantul respirator mitocondrial).
Exemplu de enzime care au grupare prostetica FMN / FAD
Enzima Gruparea prostetică
NADH-dehidrogenaza FMN
Succinat dehidrogenaza FAD
Monoaminoxidaza (MAO) FAD
Acil-CoA-dehidrogenaza FAD
L-aminoacidoxidaza FAD
Xantinoxidaza 2 FAD
Glucozoxidaza 2 FAD

Riboflavina are rol fundamental in metabolismul intermediar al compusilor organici fundamentali ai

celulei.
Carenta de vitamina B2
La om, carenta riboflavinica: modificari degenerative nervoase, disfunctii endocrine, modificari cutanate
(dermatite, leziuni umede ale pielii la colturile gurii si la nas), conjunctivita, dermatita, in cazuri grave
apar si tulburari nervoase ca pareze, tulburari ale reflexelor.
La animalele de experienta: incetarea cresterii, tulburari auditive si de reproducere, tulburari de vedere.
Hemul-ca si grupare prostetica a enzimelor
Porfirina = structura chimica este formata din patru inele pirolice legate intre ele prin punti metinice
(=CH–), alcatuind un inel porfirinic ce constituie structura de baza a hemoproteinelor (hemoglobina,
mioglobina), a enzimelor heminice (citocromi, peroxidaze, catalaze) si a clorofilelor.
Inelul porfirinic constituie gruparea prostetica a enzimelor heminice (citocromii, catalazele si
peroxidazele).
-substituentii nucleului porfirinic prezinta o importanta pentru potentialul de oxidoreducere.
-componenta proteica a enzimei este cea care dicteaza proprietatile biologice propriu-zise ale enzimei.
De ex. catalazele si peroxidazele functioneaza ca enzime de descompunere a apei oxigenate, pastrand
valenta fierului constanta in timpul procesului catalitic.
-substituentii nucleului porfirinic prezinta o importanta pentru potentialul de oxidoreducere,
-componenta proteica a enzimei este cea care dicteaza proprietatile biologice propriu-zise ale enzimei.
De ex. citocromii, cu functie de transport de electroni, au valenta fierului variabila.
Acidul lipoic (acidul tioctic sau tiooctanoic)
- reprezinta un factor de crestere pentru unele microorganisme.
Are rol de coenzima in reactiile de decarboxilare oxidativa a piruvatului si a α-cetoglutaratului.
Trece reversibil din forma oxidata (acid lipoic) in forma redusa (acid dihidrolipoic).
Acidul lipoic, numit si acidul tioctic sau tiooctanoic, este legat de proteina enzimatica prin legatura
amidica stabilita intre carboxilul acidului lipoic si gruparea -amino a lizinei din apoenzima. Legat de
enzima, acidul lipoic este numit si liponoamida.
Acidul lipoic intervine intr-un complex de reactii de decarboxilare oxidativa, unde are rolul de a prelua
reversibil echivalenti reducatori si de a transfera grupari chimice (cum este gruparea acetil sau succinil,
in decarboxilarea oxidativa a piruvatului, respectiv a -cetoglutaratului) spre coenzima A.

Mecanismul de actiune al complexului multienzimatic piruvat-dehidrogenazic

ATP (acidul adenozintrifosforic)
ATP se poate scinda in:
1) ADP + Pi; 2) AMP + PPi; 3) adenozina + PPi + Pi.

1) ATP ADP + Pi
a) Adenozintrifosfataza (ATP-aza), in care radicalul fosforic este transferat pe molecula de apa, cu
formare de acid fosforic Energia libera a acestei hidrolize ∆G°' = –7,3 kcal/mol (–30,5 kJ/mol).
Rol in contractia musculara, transportul activ al unor metaboliti prin membrana etc.
b) Reactia de scindare a ATP cu eliberare de ADP si transfer de Pi pe un compus organic este catalizata in
celula vie de fosfotransferaze = kinaze;
Rol in activarea unor compusi: monoglucide, sau alti compusi (vitamine etc.).
Hexokinaza
Glucoza + ATP --------------------------------Glucozo-6-fosfat + ADP
2) ATP AMP + PPi

Energia libera a acestei hidrolize ∆G°' = −10.9 kcal/mol (−45.6 kJ/mol ).

Sinteza acidului condroitinsulfuric. De asemenea, conjugarea “sulfatului activat” cu diferiti compusi,
reprezinta o forma importanta de detoxifiere si excretie a unor substante cum sunt fenolii, indolii, unii
hormoni steroizi etc.

3) ATP adenozina + PPi + Pi

Reactia de scindare a ATP in adenozina, pirofosfat si fosfat, are loc cu transferarea adenozinei pe un
acceptor cum este metionina si cu eliberare de PPi si Pi. Reactia este intalnita in cazul formarii gruparilor
“metilice activate” (a adenozilmetioninei):

Coenzimele metabolismului gruparilor - cu un atom de carbon

S-Adenozilmetionina Transfer de grupari metil Coenzima a metiltransferazelor
Biosinteza lecitinei

Biotina (bios II, vitamina H, vitamina B7)

Biotina este formata dintr-un nucleu tetrahidroimidazolic condensat cu un nucleu tetrahidrotiofenic,
substituit cu un lant de acid valerianic.
Surse de biotina
O constituie microflora intestinala.
Biotina este un factor de crestere pentru drojdii.
Se gaseste in cantitate mare in galbenusul de ou, in ficat si rinichi, precum si in drojdii.
Functia de cofactor a biotinei
Biotina se gaseste in produsele naturale sub forma de biocitina (ε-N-biotinil-L-lizina) (biotina este legata
covalent de gruparea ε-amino a lizinei partii proteice a enzimei).
Principalul rol metabolic al biotinei este acela de transportor de grupari CO2 pentru diferite procese de
biosinteza.
Biotina este coenzima carboxilazelor. In timpul acestor reactii, biotina fixeaza CO2 sub forma de
carboxibiotina (in metabolismul glucidelor si lipidelor).
Carenta de biotina
Avitaminoza biotinica la om – foarte rar intalnita.
Exemplu: consumul in cantitate mare de albus de ou crud determina hipovitaminoza biotinica. Avidina, o
glicoproteina specifica albusului de ou, leaga puternic biotina inactivand-o.
Simptome: anorexie, dureri musculare, descuamarea pielii
La animalele de experienta, avitaminoza se poate realiza prin:
a) sterilizarea tractului digestiv, ceea ce are ca efect distrugerea microorganismelor ce sintetizeaza
biotina;
b) administrare de avidina.
Acidul folic (vitamina B9)
Acidul folic este alcatuit dintr-un nucleu pteridinic substituit, legat de acidul para-aminobenzoic (PABA)
si unul sau mai multe resturi de acid glutamic.
Rol in sinteza ADN in celulele care au capacitatea de proliferare.
Rol in dezvoltarea embrionara, a tubului neural si ulterioara a fetusului.

Surse de acid folic:

Ficatul de vita si de porc, sparanghelul, nucile, alunele, spanacul.
In timpul prelucrarii termice a alimentelor, o mare cantitate de acid folic se distruge; astfel, prin
fierberea legumelor si a carnii, se pierd 70-90% din concentratia initiala. In carnea fripta 95% din acidul
folic se distruge.
La om, deficitul de acid folic se manifesta prin tulburari sanguine (anemie, trombopenie).
Functia de cofactor a acidului folic
Forma activa a acestei vitamine este acidul tetrahidrofolic, in care ciclul B al nucleului pteridinic este
hidrogenat.
Acidul tetrahidrofolic este cofactor al enzimelor metabolismului fragmentelor cu un atom de carbon
(metil, metilen, metenil, formil).
Rol: in metabolismul proteinelor si in sinteza bazelor purinice dar si a timinei

Vitamina B12 (cobalamina, ciancobalamina)

Constituie un grup de substante cu actiune antianemica.
Au structura foarte complicata: un nucleu corrinic substituit, avand ca metal coordinator un atom de
cobalt si un nucleotid (format din riboza, 5,6-dimetilbenzimidazol si acid fosforic) ancorat la nucleul
corrinic.
Cobalamina, denumita si “factor extrinsec”, poate fi absorbita in intestinul uman numai in prezenta
“factorului intrinsec” produs la nivelul mucoasei gastrice. Vitamina B12 si factorul intrinsec formeaza un
complex ce asigura absorbtia intestinala a vitaminei B12 prin endocitoza mediata de receptor.

Surse de vitamina B12

Vitamina B12 poate fi sintetizata numai de microorganisme (la om de catre microflora intestinala).
Pentru unele bacterii, cobalamina constituie un factor de crestere necesar.
Surse de vitamina B12: ficat si rinichi, galbenusul de ou, drojdii.
Functia de cofactor a vitaminei B12
Este cofactor al metiltransferazelor si mutazelor.
Vit. B12 ca si coenzima a metiltransferazelor, participa la transportul gruparilor metil, de regula de la
acidul metiltetrahidrofolic spre un acceptor, intervenind in biosinteza acizilor nucleici.
In metabolismul lipidic, vit.B12 este coenzima a mutazelor.
Vitamina B12 participa in reactii de tipul conversiei metilmalonil-CoA in succinil–CoA.
Rol in eritropoieza, favorizand procesele de maturatie si eliberare a eritrocitelor in circulatia sanguina

Carenta de vitamina B12

Deficitul de vit. B12 la om duce la boala numita “anemia pernicioasa”, caracterizata printr-o scadere
pronuntata a numarului hematiilor, ca urmare a tulburarilor de maturatie a seriei eritroblastice. Aceasta
s-ar datora nu atat absentei vitaminei B12 din hrana, cat tulburarii absorbtiei vitaminei datorita lipsei
factorului gastric intrinsec.
Coenzima A
Coenzima A asigura activarea radicalului acetil care, legat de coenzima A (CoA-SH), devine “acid acetic
activat”. (H3C-CO~SCoA si a acizilor grasi liberi, jucand un rol deosebit de important in majoritatea
reactiilor care implica transfer de grupari acil in celula vie.
Acizii grasi legati de CoA prin legatura tioesterica au un potential de transfer ridicat, hidroliza acestor
compusi fiind un proces exergonic ce elibereaza circa 8,5 kcal/mol (respectiv 34,7 kJ/mol).
Coenzima A rezulta din legarea pantetein-fosfatului de adenozin-3',5'-difosfat. In prescurtarea denumirii
coenzimei A: CoA-SH, SH reprezinta gruparea sulfhidril terminala, apartinand cisteaminei, prin
intermediul careia radicalii acil sau acetil se leaga prin legatura tioesterica, macroergica, de coenzima A.
Astfel, radicalul acid sau acetil legat de CoA formeaza un tioester, compus cu un inalt grad de
reactivitate.
Pentru fixarea acidului acetic sau a unui acid gras pe molecula de CoA este necesara investirea unei
anumite cantitati de energie, ce se obtine fie pe seama ATP, fie pe baza altei reactii exergonice, cum
este reactia de decarboxilare oxidativa.
Rol in metabolismul glucidelor, lipidelor si in mica masura a metabolismului proteinelor

Acidul pantotenic (vitamina B5)

Este un produs de condensare a β-alaninei cu acidul α, -dihidroxi-β-dimetil-butiric (“acid pantoic”).
Panteteina, rezultata din condensarea acidului pantotenic cu o molecula de cisteamina, reprezinta un
factor de crestere pentru unele microorganisme, dar si o parte componenta a Coenzimei A.

Surse de acid pantotenic

drojdia, ficatul si rinichii, galbenusul de ou, ciupercile.
Carenta de acid pantothenic
Aparitia diverselor tulburari ca: pelagra puilor de gaina, intarzierea cresterii la sobolan, alterari ale
functiei de reproducere, necroze hemoragice ale corticosuprarenalelor.
Nu se cunosc carente ale acidului pantotenic la om.
Vitamina B1 (tiamina, aneurina, anti-beri-beri).
Prima vitamina descoperita si izolata din taratele de orez (Funk, 1911).
Un compus hidrosolubil, constituit dintr-un nucleu pirimidinic legat printr-o punte metilenica de un
nucleu tiazolic formand o sare de amoniu cuaternara. Tiamina are intotdeauna o sarcina libera.
Functia vitaminica este legata de prezenta gruparii aminice a nucleului pirimidinic, de integritatea puntii
metilenice, precum si de lipsa oricarui substituent in pozitia 2-a nucleului tiazolic.
Modificari ale structurii sale duc la formarea de compusi cu actiune antivitaminica.
Surse bogate in tiamina
• Ficatul, carnea de porc, ouale, nucile, mazarea, faina de porumb, faina integrala de grau si
secara, drojdia de bere etc.
• Cu exceptia ierbivorelor, toate animalele necesita prezenta tiaminei in hrana.
Vitamina B1 cu rol de cofactor
Forma activa a tiaminei = tiaminpirofosfatul (TPP) – grupare prostetica a decarboxilazelor si
transcetolazelor.

Partea activa a TPP: nucleul tiazolic

• Aldehida acetica este atasata la carbonul din pozitia 2 a inelului tiazolic al TPP, devenind astfel
“acetaldehida activa”.
Exemple de reactii dependente de TPP
este coenzima de transfer pentru fragmente de 2C (de ex., pentru acetaldehida, glicolaldehida).
Carenta in tiamina
Aparitia unor tulburari functionale ale sistemului nervos
La om, carenta vitaminica: nevralgii, mialgii si chiar crampe musculare.
Avitaminoza acuta produce la om boala “beri-beri” – raspandita mai ales in Extremul Orient si datorata
unei alimentatii uneori exclusiva cu orez decorticat (paralizii, pierderea memoriei, urmata de edeme si
parestezia extremitatilor).
Uridintrifosfatul in calitate de coenzima
• UTP poate fixa la nivelul radicalului fosforic o molecula de hexoza (glucoza sau galactoza), printr-
o legatura macroergica interfosforica.
• Uridintrifosfatul (UTP) este coenzima de activare si transfer a glucozei care, legata de UDP,
devine “glucoza activata”.
• Glucoza activata poate fi ulterior transferata pe alte molecule. In acest fel sunt sintetizate
glicozidele, oligo- si poliglucidele.
• Glucoza activata poate fi transformata in epimerii corespunzatori la C2 sau C4 sub actiunea unor
epimeraze
UTP-ca si coenzima in sinteza oligo- si poliglucidelor

Citidintrifosfatul in calitate de coenzima

Citidintrifosfatul (CTP), nucleotid analog adenozintrifosfatului (continand citozina in loc de adenina),
intervine in biosinteza lipidelor complexe in calitate de coenzima de transfer a fosforilcolinei sau
fosforilcolaminei (fosforiletanolaminei).
Reactia de formare a “colinei activate” (CDP-colina)

Colina sau colamina activa0te sub forma de CDP-colina si respectiv CDP-colamina (CDP-etanolamina)
sunt transferate in timpul biosintezei fosfatidelor si a sfingomielinelor pe molecule acceptoare ca
digliceride, N-acilsfingozina sau glicerofosfatul.
Vitamina B6 (piridoxina, adermina)
Este o piridina substituita ce se prezinta sub trei forme: piridoxol, piridoxal si piridoxamina.
Piridoxina este distrusa la lumina si in special de radiatiile UV.

Surse de vitamina B6
drojdiile (drojdia de bere si de paine), faina de porumb, faina integrala de grau, soia, rinichii de vita,
pestele, galbenusul de ou.
Vitamina B6 cu rol de cofactor
Forma activa se prezinta ca derivat fosforilat la carbonul C5: piridoxalfosfatul si piridoxaminfosfatul,
interconvertibile.
Piridoxalfosfatul este principala grupare prostetica activa a metabolismului aminoacizilor (coenzima
transaminazelor, decarboxilazelor, liazelor, racemazelor si sintetazelor).
Intervine in:
1. Conversia triptofanului in vitamina B3
2. Conversia acidului linoleic in acid arahidonic (precursor al prostaglandinelor)
3. Producerea de sfingolipide
4. Sinteza hemului si a mediatorilor neurochimici.
Exemplu de reactie dependenta de piridoxal fosfat
Mecanismul de transaminare a aminoacizilor

Mecanismul de reactie in care este implicat piridoxalfosfatul in calitate de grupare prostetica activa a
diferitelor enzime: transaminaze, decarboxilaze, liaze si sintetaze.
Carenta de vitamina B6
Este foarte rara aparitia deficitului de vit. B6 la om. Se manifesta prin dermatita seboreica, manifestari
nervoase (depresie stari de confuzie), leziuni ale mucoaselor, anemie.
La sobolan, manifestarile carentiale sunt de natura cutanata, nervoasa si de crestere.
Nomenclatura si clasificarea enzimelor
• Clasificarea enzimelor se bazeaza pe mecanismele de reactie la care participa enzimele.
• Denumirea unei enzime cuprinde doua parti: numele substratului (sau substratelor) asupra
caruia actioneaza si tipul reactiei catalizate, terminat cu sufixul -aza.
• Sistemul de clasificare grupeaza enzimele in sase clase: oxidoreductaze, transferaze, hidrolaze,
liaze, izomeraze si ligaze; fiecare din aceste clase cuprinde 4-13 subclase.
Comisia Internationala de Enzimologie, 1961
6 clase:
 Oxidoreductaze (EC 1.)
 Transferaze (EC 2.)
 Hidrolaze (EC 3.)
  Liaze (EC 4.)
 Izomeraze (EC 5.)
 Ligaze (EC 6.)
Fiecare enzima are un numar de cod sistematic (E.C.) alcatuit din patru cifre:
 prima cifra indica criteriul mecanismului de reactie si clasa din care face parte enzima;
 a doua cifra indica subclasa din care face parte enzima si natura legaturii sau a gruparilor
molecule substratului implicate in reactie;
 a treia cifra da indicatii asupra naturii substratului sau a acceptorului;
 a patra cifra indica pozitia enzimei in subclasa din care face parte.
De ex., ATP:D-Hexozo-6-fosfotransferaza (Hexokinaza (E.C.2.7.1.1.)
2- clasa a doua de enzime--transferaze,
7-subclasa a 7-a – transfer de fosfat,
1- subsubclasa 1-a – o grupare alcoolica functioneaza ca acceptor de fosfat,
numarul particular al enzimei – in cazul nostru, al hexokinazei, enzima ce catalizeaza reactia de transfer
a fosfatului de la ATP la gruparea hidroxil a carbonului 6 al moleculei de glucoza sau hexoza.
Clasa oxidoreductazelor
Exemple de subclase
 Oxidaze
 Dehidrogenaze
 Oxigenaze
 Peroxidaze
Functia nicotinamid-nucleotidelor
preluarea reversibila a unui atom de hidrogen de pe substrat sub forma de ion de hidrura (1H+ + 2e-),
inelul piridinic se reduce, inelul heterociclului devenind dihidropiridinic. Pe inelul piridinic se fixeaza un
singur atom de H, cel de al doilea hidrogen scos de la substrat ramanand ca proton in faza apoasa, in
imediata vecinatate a inelului dihidropiridinic.
Aceste coenzime intra in constitutia enzimelor numite dehidrogenaze NAD(P) depedente implicate in
metabolismul intermediar al principalilor compusi organici din celula.

Clasa transferazelor
 Metiltransferaze
  Aminotransferaze- transfer de grupari aminice de la un aminoacid la un cetoacid
 Kinaze
 Fosforilaze
Vitamina B6 (piridoxina, adermina)-in structura gruparii prostetice a transaminazelor
Este o piridina substituita ce se prezinta sub trei forme: piridoxol, piridoxal si piridoxamina.
Piridoxina este distrusa la lumina si in special de radiatiile UV.

Clasa transferazelor - Kinazele

Reactia de scindare a ATP cu eliberare de ADP si transfer de fosfat anorganic (Pi) pe un compus organic
este catalizata in celula vie de fosfotransferaze = kinaze;
Rol in activarea unor compusi: monoglucide, sau alti compusi (vitamine etc.).
Clasa hidrolazelor
Hidrolaze A-B+H2O A-OH+BH
 Fosfataze ex. Fosfataza alcalina implicata in indepartarea gruparilor fosfat de pe nucleotide,
proteine si lipide.
 Fosfodiesteraze
 Prote(in)aze ex. Serin-proteaze sau serin-endopeptidaze, cliveaza legatura peptidica din
proteine.

Clasa liazelor
Liaze A B+C
 Decarboxilaze ex. Piruvat decarboxilaza care catalizeaza decarboxilarea acidului piruvic la
acetaldehida si CO2, in cursul fermentatiei alcoolice
 Aldolaze
Clasa izomerazelor
Izomeraze A B
 Racemaze
 Cis-Trans izomeraze
 Mutaze ex. Fosfoglucomutaza care catalizeaza G-1-P  G-6-P

 Topoizomeraze
Clasa ligazelor
Ligaze A+B+ATP AB+ADP+Pi
 Carboxilaze
 Sintetaze ex. ADN-ligaza
Biotina (bios II, vitamina H, vitamina B7)
Biotina este formata dintr-un nucleu tetrahidroimidazolic condensat cu un nucleu tetrahidrotiofenic,
substituit cu un lant de acid valerianic.

Proprietatile enzimelor
• Puterea catalitica
• Specificitatea
• Activitatea lor catalitica poate fi modulata.
Puterea catalitica a enzimelor

• Capacitatea unei enzime de a creste viteza de reactie;

• Poate creste viteza de reactie pana la 17 ordine magnitudine
• De ex. ureaza creste viteza reactiei de descompunere hidrolitica a ureii la cateva microsecunde.
• Ureea este o molecula foarte stabila, care in mod normal hidrolizeaza foarte incet obtinandu-se
acidul izocianic si amoniac. Durata reactiei necatalizate este de 3,6 ani la 38 °C. Activitatea
catalitica a enzimei determina o crestere a vitezei de reactie (in mediu acid) de aproape 14
ordine de magnitudine.

Specificitatea sau selectivitatea enzimelor

Specificitatea este capacitatea enzimelor de a cataliza anumite reactii chimice, in care este implicat un
anumit tip de compus, uneori numai un singur compus.
Selectivitatea reprezinta capacitatea enzimelor de a discrimina intre doua sau mai multe substraturi.
Specificitatea enzimelor: - de actiune
- de substrat
- absoluta.
1. Specificitate de actiune
Este determinata de partea proteica a enzimei
Ex: piridoxalfosfat- coenzima a transaminazelor, decarboxilazelor, liazelor, sintetazelor
hemul- grupare prostetica a peroxidazelor, catalazelor, citocromilor si a oxigenazelor
2. Specificitate de substrat
-specificitate de legatura: enzimele recunosc un anumit tip de legatura chimica
Ex: Esterazele recunosc legaturile de tip esteric.
Tripsina recunoaste legatura dintre Arg-Lys.
Trombina recunoaste legatura dintre Arg-Gly.
-stereospecificitate
Ex: L-aminoacid-oxidazele : catalizeaza numai dezaminarea oxidativa a L-aminoacizilor !!!
3. Specificitate absoluta: enzimele recunosc un anumit tip de legatura chimica si un anumit component
chimic.
Exemplu: Ureaza degradeaza numai ureea
Exemplu: Hexokinaza
- D-glucoza
- 2-18F-dezoxi-D-glucoza –utilizare in tehnici de imagistica
Tomografia prin emisie de positroni engl Positron emission tomography (PET)
aplicatii in diagnosticarea si tratamentul cancerului si a bolilor inflamatorii
Izoformele enzimelor
Izoenzime sau izozime
Sunt enzime localizate in aceeasi celula sau in celule diferite, care indeplinesc functii catalitice
identice, dar difera prin unele proprietati cum ar fi afinitate pentru substrat, termostabilitate,
sarcina electrica etc.
Izoformele LDH
LDH-1 (4H) - in inima
LDH-2 (3H1M) - in sistemul reticuloendotelial
LDH-3 (2H2M) - in plamani
LDH-4 (1H3M) - in rinichi
LDH-5 (4M) - in ficat si muschiul striat
=> Rol in diagnosticul medical, indicand distrugeri celulare

Modularea activitatii catalitice a enzimelor

Activitatea catalitica a enzimelor poate fi controlata de o serie de factori:
-concentratia de enzima
-concentratia de substrat
-pH
-tarie ionica
-temperatura
-ioni, diferite molecule (inhibitori, activatori).
1. Influenta [E] asupra vitezei de reactie
Viteza de transformare a substraturilor este in general proportionala cu concentratia enzimei, intre
anumite limite.
Abaterile de la regula se datoresc in general unor erori de tehnica sau prezentei unor inhibitori
in preparatul enzimatic.
Este importanta gasirea conditiilor optime pentru lucru pentru care activitatea enzimatica este
proportionala cu concentratia de substrat.
Influenta [S] asupra vitezei de reactie
 Concentratia substratului [S] este unul din cei mai importanti factori de care depinde activitatea
enzimatica.
 Trei tipuri de curbe pot reflecta dependenta activitatii enzimatice de concentratia substratului.

Cinetica reactiilor enzimatice

Reactii enzimatice cu unul sau mai multe substraturi

Reactii cu un singur substrat
A izomeraze B
A liaze B+ C
A-B + H2O hidrolaze A-OH + BH
Reactii cu doua sau mai multe tipuri de substrate

Ared + Box oxidoreductaze Aox + Bred

A-x +B transferaze A+ B-x
X+Y+ ATP ligaze XY+ ADP+ Pi

Exprimarea activitatii catalitice

Conform IUB (International Union of Biochemistry)
1. Unitatea internationala de activitate enzimatica (UI)
2. Unitatea catalitica (1 “Katal”, 1 Kat)
3. Activitatea specifica
4. Numarul de turn-over
1. O unitate internationala de activitate enzimatica (U) reprezinta cantitatea de enzima care
catalizeaza transformarea unui micromol (1 µmol) de substrat in timp de un minut, in conditii
optime de pH si de concentratie de substrat, la temperatura de 25°C.
2. O unitate catalitica (1 “Katal”, 1 Kat) este cantitatea de enzima care catalizeaza transformarea unui
mol de substrat in interval de o secunda, in conditii optime de pH si de substrat si la temperatura de
25°C.
3. Activitatea specifica reprezinta numarul de unitati de activitate enzimatica per miligram de
proteina si este o expresie a gradului de puritate a unei enzime. Se exprima ca U/mg sau U/ml

4. Numarul de turn-over reprezinta numarul de molecule de substrat transformate sub actiunea

enzimei intr-o unitate de timp atunci cand enzima este saturata cu substrat . Se mai numeste si
numar de transfer si variaza intre 1 000 – 1 000 000.

Factorii care influenteaza viteza reactiilor catalizate de enzime

5 factori importanti:
1. Concentratia de enzima
2. Concentratia de substrat
3. pH-ul
4. Temperatura
5. Inhibitorii si activatorii
Cinetica de tip Michaelis-Menten

Cinetica reactiilor enzimatice cu un singur substrat (T. Michaelis – Menten, 1913)

Dupa Michaelis-Menten, viteza de reactie este data de formula:

Km sau KM este concentratia de substrat la care se atinge viteza semimaxima

Valoarea Km este in mod normal cuprinsa intre 10-2 M (10 mM) si 10-5 M (10µM).
Daca concentratia de S [S] este constanta, viteza de reactie (v) creste proprortional cu concentratia de
enzima [E]
Daca [S] ↓ atunci v este direct proportionala cu [S]
Daca [S] ↑ reactia decurge independent de [S]

Teoria Michaelis-Menten privind actiunea enzimelor:

 Enzimele formeaza cu substratul (S) un intermediar ES care apoi elibereaza E si produsul de
reactie (P)
 Daca concentratia de S [S] este constanta, viteza de reactie (v) creste proprortional cu
concentratia de enzima [E]
 Daca [S] ↓ atunci v este direct proportionala cu [S]
 Daca [S] ↑ reactia decurge independent de [S]

Teoria Michaelis – Menten se bazeaza pe 2 ipoteze

 Ipoteza etapei limitante de viteza
 Ipoteza starii stationare
Ipoteza etapei limitante de viteza a reactiei este v2, deci viteza totala a reactiei este:
V = v2 = k2 x [ES]
La [S] foarte mari, v2 este viteza limitanta pentru reactie !
Ipoteza starii stationare: concentratia complexului ES ramane constanta deoarece pe masura ce ES se
descompune in P + E, in aceeasi masura se formeaza alt complex ES din E + S. Deci: v1 = v-1 + v2.
Reprezentare dublu-reciproca Lineweaver-Burk
Pentru realizarea grafica a dependentei v de [S] in reprezentarea Michaelis-Menten, sunt necesare o
multitudine de puncte experimentale care, puse una langa alta, sa redea curba
Operatia este mult simplificata daca se foloseste expresia reciproca a vitezei de reactie, dupa
Lineweaver-Burk:

Daca notam:

Expresia devine astfel: y = ax + b, care reprezinta forma liniarizata a ecuatiei.

Daca se reprezinta grafic 1/v in functie de 1/[S] (“reprezentare dublu-reciproca Lineweaver-Burk”), se
obtine o dreapta a carei panta (tg ) este Km/Vmax; ordonata la origine este 1/Vmax, iar intersectia abscisei
reprezinta -1/Km.

Determinarea Km in reprezentarea dublu-reciproca necesita doar cateva puncte experimentale

(minimum trei puncte).
Concluzii la cinetica de tip Michaelian
 Este un model cinetic intalnit la majoritatea (nu toate) enzimelor
 Determinarea parametrilor cinetici (Vmax si Km) este importanta in caracterizarea (activitatii) unei
enzime
Cinetica Michaelis-Menten a reactiilor enzimatice cu doua substraturi
Majoritatea reactiilor chimice catalizate enzimatic:
E
S1 + S2 ----- P1 + P2
Reactiile enzimatice la care participa mai multe substraturi implica formarea unor complexe enzima-
substrat (ES), asemanatoare reactiilor cu un singur substrat, iar cinetica lor poate fi examinata pentru
aflarea KM pentru fiecare substrat in parte si a Vmax.
Valoarea KM pentru fiecare substrat este determinata prin analiza grafica a vitezei initiale obtinute prin
variatia concentratiei unui substrat fata de o concentratie fixa, de saturare, a celuilalt sau a celorlalte
substrate.
Mecanismele reactiilor catalizate enzimatic cu doua substrate:
 mecanismul cu deplasare dubla
 mecanismul secvential.
Mecanismul cu deplasare dubla sau mecanismul “ping-pong”
A + B ---- C+D

A si B sunt reactanti; C si D sunt produsii de reactie; E este enzima; F este un intermediar enzimatic
stabil, iar literele din paranteze sunt complexe intermediare prezumptive. Linia orizontala arata formele
enzimatice in timpul reactiei, iar sagetile indica combinarea sau disocierea substratelor si a produsilor.
Ex. reactia de transaminare a aminoacizilor
Mecanismul secvential
in mecanismele secventiale toate substratele trebuie sa se combine impreuna pentru a forma un
complex ternar, inainte de a se forma produsul de reactie.
2 subtipuri:
-ordonat
-la intamplare
Mecanismul secvential ordonat
Ex. reactiile catalizate de enzima fosfofructokinaza sau de gliceraldehid-3-fosfat-dehidrogenaza

Mecanismul secvential la intamplare

Ex. UDP-galactozo: N-acetilglucozamin-galactozil-transferaza
Cinetica enzimelor alosterice
 Cinetica de tip sigmoidal
 Viteza reactiei enzimatice evolueaza ca si cum, odata cu cresterea concentratiei de substrat s-ar
supraadauga sau s-ar substrage la un moment dat o oarecare cantitate de enzima
=> Accelerarea sau decelerarea reactiei enzimatice

Cinetica de tip alosteric

Acest comportament cinetic nu poate fi explicat prin termenii cineticii clasice de tip michaelian, ci prin
fenomenul de alosterism in cataliza enzimatica.
Comportamentul cinetic de tip sigmoidal este caracteristic enzimelor reglatoare (alosterice), a caror
structura este alcatuita din mai multe subunitati. In astfel de situatii, un compus denumit ligand, altul
decat substratul, poate modifica activitatea unei enzime in sensul accelerarii sau decelerarii vitezei de
reactie, fara ca acesta sa aiba vreo asemanare sterica cu substratul.
Prin ligand se intelege orice compus care este recunoscut si legat in mod specific de enzima.
Viteza enzimelor reglatoare (enzime limitante) controleaza in general viteza de desfasurare a intregului
flux metabolic.
Enzimele reglatoare sunt in general situate la inceputul cailor metabolice.
Subunitatile unei enzime alosterice interactioneaza in asa fel incat legarea la o subunitate a unei
molecule de ligand, modifica implicit afinitatea celorlalte subunitati fata de acelasi ligand, sau fata de
altul.
Expresia vitezei de reactie in functie de concentratia substratului pentru enzimele alosterice -Monod,
Changeux si Wyman.
In scopuri practice, ecuatia lui Hill:

n = numarul lui Hill =gradul de cooperativitate (de interactiune) a subunitatilor din care este alcatuita
enzima alosterica.
Fenomenul de cooperativitate presupune ca substratul S nu este legat de enzima decat atunci cand
concentratia sa este suficient de mare incat sa se poata lega simultan de toate centrele din proteina
enzimatica.
Reprezentand grafic pe ordonata: log V/Vmax-V; iar pe abscisa: log[S]; vom obtine o dreapta a carei panta
este n (numarul lui Hill).

Cand valoarea lui n scade, gradul de cooperativitate dintre subunitati scade de asemenea, si invers.
Atunci cand n = 1, situsurile de legare actioneaza independent unul de altul, iar enzima are un
comportament de tip michaelian. Cand n > 1, situsurile sunt cooperative. Astfel, cu cat n este mai mare,
cu atat gradul de cooperativitate este mai mare, iar curba de saturare cu substrat are un aspect sigmoid
mai accentuat.

Interactiunile dintre enzima si ligand pot fi: interactiuni homotrope si interactiuni heterotrope.
– Actiunile homotrope descriu efectul pe care un ligand il are asupra afinitatii enzimei fata de aceeasi
specie de ligand. Actiunile homotrope pot fi pozitive sau negative, dupa cum legarea primei molecule de
ligand de prima subunitate atrage dupa sine modificarea afinitatii, in sensul cresterii (pozitive) sau
descresterii (negative) afinitatii fata de acelasi ligand.
– Actiunile heterotrope descriu efectul pe care legarea unei specii de ligand il are asupra afinitatii
enzimei fata de alte specii de ligand. Actiunile heterotrope pot fi, de asemenea, pozitive sau negative.
Un exemplu de efect heterotrop pozitiv este activarea specifica pe care acetil-CoA il are fata de piruvat-
carboxilaza. Astfel, pe masura ce subunitatile enzimei leaga cate o molecula de acetil-CoA, in aceeasi
masura afinitatea enzimei fata de piruvat creste.
Un efect heterotrop negativ este efectul inhibitor al citratului fata de fosfofructokinaza; citratul
micsoreaza afinitatea enzimei atat fata de fructozo-6-fosfat, cat si fata de ATP.
Mecanismul alosterismului
- doua modele de interactiuni intre subunitatile enzimei: a) modelul secvential si b) modelul simetriei.

a) Modelul secvential admite ca legarea ligandului L de subunitatile enzimei, determina modificarea

conformatiei spatiale – tertiare si cuaternare – a enzimei in mod succesiv (secvential), pe masura ce
acesta se leaga de subunitati.
b) Modelul simetriei admite ca legarea ligandului L de prima subunitate a enzimei determina modificarea
simultana a structurii spatiale si a celorlalte subunitati, cu mentinerea cel putin a unei axe de simetrie a
intregului complex. Modelul simetriei pare a fi un caz particular al modelului secvential.
Caracteristicile enzimelor cu cinetica alosterica
Sunt formate din mai multe subunitati identice sau diferite. In cazul in care subunitatile sunt diferite,
acestea pot fi: subunitati catalitice (implicate in cataliza enzimatica) si subunitati reglatoare
(responsabile de sensibilitatea enzimei fata de liganzi (activatori sau inhibitori)).
Enzime alosterice- conformatii
Enzimele alosterice prezinta 2 tipuri de conformatii:
- activa -R (engl., relaxed), stabilizata de activatori si de prezenta substratului
- mai putin activa- T (engl., tense), stabilizata de inhibitori
Subunitatile se gasesc in starea R
Legarea ligandului la prima subunitate a enzimei aflata in stare T, determina trecerea celorlalte
subunitati in starea R
Cooperativitate intre subunitatile enzimei alosterice
Fenomenul de cooperativitate presupune ca substratul nu se leaga de enzima decat atunci cand
concentratia sa este suficient de mare incat sa se lege simultan la toate centrele din proteina
enzimatica.
Caracteristicile enzimelor cu cinetica alosterica

Sunt supuse retroinhibitiei negative (“feed back” negativ) de catre produsul final al caii metabolice,
aceasta inhibitie nefiind de tip competitiv.
Ex. Calea de sinteza a L-Izoleucinei din L-Treonina la bacterii. Enzima cu cinetica de tip alosteric (Treonin
deshidrataza) este inhibata prin feed back negativ de produsul final,L-izoleucina.
Inhibitia prin exces de substrat sau produs
Inhibitia prin exces de produs final (vezi sinteza L-izoleucinei din L-treonina la bacterii)
Inhibitia prin exces de substrat (substratul ajunge sa ocupe in mod anormal regiuni din centrul activ al
enzimei, formandu-se probabil, complexe inactive, din care nu se mai elibereaza produsul si enzima
libera)

Modularea activitatii catalitice a enzimelor

Activitatea catalitica a enzimelor poate fi controlata de o serie de factori:
-concentratia de enzima
-concentratia de substrat (tipuri de cinetica enzimatica)
-pH
-tarie ionica
-temperatura
-ioni, diferite molecule (inhibitori, activatori).
Influenta pH-ului asupra vitezei reactiilor enzimatice
Efectul pH-ului se poate exercita asupra activitatii enzimatice in diferite moduri:
 modificarea Vmax , adica a capacitatii catalitice maxime a enzimei;
 modificarea afinitatii enzimei pentru substratul pe care il catalizeaza;
 modificarea stabilitatii enzimei si denaturarea ei la valori extreme de pH.
De cele mai multe ori, aceste efecte se manifesta asociat.

Studiul activitatii enzimatice in functie de pH constituie o metoda de investigare a centrului activ al

enzimelor.
Astfel, informatii asupra pKa a gruparilor din centrul activ al unei enzime pot fi obtinute masurand Vmax si
Km la diferite valori de pH, mentinand toti ceilalti parametri constanti. Reprezentand grafic logaritmul
constantelor cinetice (log Vmax’ – log Km si – log Km / Vmax) in functie de pH se obtin curbe a caror
perpendiculara coborata din punctele de inflexiune indica valorile pK ale gruparilor aminoacizilor
implicati in mecanismul catalizei enzimatice.
Reprezentarea grafica a unor constante cinetice a reactiei enzimatice in functie de pH.0

Influenta tariei ionice asupra vitezei reactiilor enzimatice

• Taria ionica potrivita pentru masurarea activitatii enzimatice este dictata de molaritatea solutiei
tampon utilizate.
• Ex. o tarie ionica ridicata (1 M) poate conduce la inactivarea enzimei, cu unele exceptii (enzimele
din organisme termofile si halofile).
 • Natura ionilor din solutia tampon poate fi un factor determinant pentru inactivarea sau
destabilizarea enzimelor.
• Solutiile tampon bazate pe substante de natura organica pot fi mai stabile.
Influenta temperaturii asupra vitezei de reactie
Viteza unei reactii (bio)chimice creste odata cu temperatura.
Dependenta activitatii enzimatice in functie de temperatura are aspectul unei curbe in forma de clopot,
cu un maxim de activitate in dreptul temperaturii optime.
Pentru majoritatea enzimelor, temperatura optima este de 37-38°C.
Peste temperatura optima, activitatea enzimelor scade repede, iar la temperaturi de peste 55-60°C (in
functie de enzima) survine denaturarea termica a proteinei enzimatice.

Influenta efectorilor asupra vitezei reactiilor enzimatice

Activatori enzimatici
= substante care stimuleaza activitatea enzimelor = efectori pozitivi ai enzimelor
Activarea enzimelor:
Directa- cand este influentata formarea complexului ES
Indirecta- cand activarea se refera la indepartarea unui inhibitor din sistem
Modalitati de activare a enzimelor
1. Activarea prin ioni (Mg 2+, Mn2+, Co2+, Zn2+. Cl-)
Ex: fosforilazele, fosfoglucomutazele
2. Activarea prin transformarea proenzimei in enzima
Ex: tripsinogenului-tripsina
pepsinogen-pepsina
chimotripsinogen-chimotripsina
3. Activarea prin antiinhibitie
Ex: proteinkinaze (AMPc)
4. Activarea prin protejarea enzimei
Ex: papaina, catepsina, succinat-dehidrogenaza (glutationul redus, betamercaptoetanol, 1,4-ditiotreitol
,cisteina)
Inhibitia enzimatica
Inhibitori enzimatici
= substante care determina scaderea/ reducerea activitatii enzimatice
1. Inhibitie reversibila
- Competitiva
- Necompetitiva
2. Inhibitie ireversibila
Diferenta dintre inhibitia reversibila competitiva si necompetitiva
Inhibitia enzimatica reversibila - Eficienta inhibitorului
Eficienta unui inhibitor este exprimata prin Ki- constanta de inhibitie
ki [E] x [I]
E+I EI de unde: Ki =
k-i [EI]

Competitiva
Inhibitorul enzimei prezinta asemanare sterica cu substratul, putand fi recunoscut si legat de enzima in
locul substratului, fara a putea fi insa transformat de enzima.
Inhibitorul se leaga de enzima in centrul activ al acesteia, impiedicand legarea substratului.
Intre substrat si inhibitor exista deci o competitie pentru centrul activ al enzimei. Inhibitia va fi cu atat
mai puternica cu cat numarul moleculelor de inhibitor este mai mare fata de cele ale substratului.

În reprezentarea dublu-reciprocă Lineweaver-Burk (1/V şi 1/S):

Km
panta dreptei martor – în absenţa inhibitorului – este: Vmax
[I]
iar panta reacţiei inhibate va fi: Km
x (1 + )
Vmax Ki

Pentru reacţia inhibată, reciproca vitezei va fi:

1 [I] Km 1
= (1 + ) x x
V Ki V max [S]
Ex: inhibarea succinat dehidrogenazei de catre: acid malonic (HOOC-CH2-COOH), acid glutaric (HOOC-
CH2-CH2-CH2-COOH) si acid oxalic (HOOC-COOH)
Aplicatii: tratarea pacientilor care au ingerat metanol, tratamentul cu metotrexat in cancer
Aplicatii ale utilizarii inhibitorilor enzimatici competitivi
Acidul folic (vit. B9) este alcatuit dintr-un nucleu pteridinic substituit, legat de acidul para-aminobenzoic
(PABA) si unul sau mai multe resturi de acid glutamic.
Rol in sinteza ADN in celulele care au capacitatea de proliferare
Rol in dezvoltarea embrionara, a tubului neural si ulterioara a fetusului
Rolul acidului folic in aparitia si progresia cancerului
– Metotrexatul (citostatic) este un inhibitor competitv al conversiei acidului folic in forma sa
activa- acidul tetrahidrofolic.

Inhibitia enzimatica reversibila

Necompetitiva
Inhibitorul si substratul nu concureaza pentru acelasi situs al moleculei enzimatice, fiecare legandu-se in
locuri diferite. Aceasta explica independenta gradului de inhibitie de concentratia substratului.
Km nu se modifica, in schimb este modificata Vmax.
 În inhibiţia necompetitivă, reacţiile de echilibru sunt următoarele:

E + S  ES E + I  EI ES + I  ESI EI + S  ESI
Din acest şir de echilibre se observă că în inhibiţia necompetitivă se poate
crea complexul ternar enzimă-substrat-inhibitor.
În reprezentarea Lineweaver-Burk, intersecţia pantei martor (în absenţa
1
inhibitorului) la ordonată este:
Vmax
1 [I]
în timp ce pentru reacţia inhibată este: Vmax
x (1 +
Ki
) .

Alte tipuri de inhibitie enzimatica

Mixta

Acompetitiva

Modificarea parametrilor cinetici in functie de tipul de inhibitie

Inhibitia enzimatica ireversibila
Inhibitorul se leaga de enzima prin legaturi covalente, formand compusi stabili (cianurile, compusii
organofosforici).
In inhibitia ireversibila gradul de inhibitie este dependent de timp, activitatea enzimei neputand fi
recuperata odata ce s-a instalat inhibitia.
Ex:“Inhibitori sinucigasi” DFMO (difluoro-metil-ornitina) => Inhiba ornitin decarboxilaza
Ex: Penicilina inhiba o enzima cheie (transpeptidaza) implicata in sinteza peretelui celular bacterian
Forme de depozitare a energiei la nivel celular
La nivel celular, energia este stocata in legaturile macroergice ale ATP-ului.

Utilizarea energiei la nivel celular

Energia este folosita la nivel celular pentru:
• realizare de lucru mecanic (contractie, miscare)
• transport (transmembranar)
• cataliza enzimatica
Care este modalitatea prin care se regenereaza ATP?
Reactii chimice in celula vie
G = G final- G initial
G < 0, reactia este exergonica, se desfasoara spontan.
G > 0, reactia este endergonica, nespontana.
Reactii catabolice-exergonice

Reactii anabolice- endergonice

Ce este energia libera Gibbs?
Energia libera Gibbs masoara abilitatea unui sistem de a efectua lucru mecanic (energie utilizabila) la
temperatura si presiune constanta.
Variatia de energie libera Gibbs
G= H-TS
H= entalpia
T=temperatura absoluta Kelvin (oC+273)
S =variatia de entropie
Entalpia de formare standard (H) a unei substante compuse reprezinta cantitatea de caldura degajata
sau absorbita in timpul reactiei chimice de formare a acestei substante din elementele componente.
Entropia (S) este o marime fizica ce masoara gradul de dezorganizare al moleculelor in timpul unui
proces natural.
G-variatia de energie libera Gibbs
Energia libera este o masura a gradului de instabilitate a unui sistem
Intr-o modificare spontana a unui sistem, energia libera scade, dar creste gradul de stabilitate.
Un proces este spontan cand se desfasoara inspre atingerea echilibrului.
Fiecare reactie chimica implica formarea sau ruperea de legaturi chimice.
Enzimele nu modifica energia libera Gibbs a unei reactii

Ce este energia de activare?

Energia de activare (Ea) = cantitatea de energie necesara/investita pentru a destabiliza legaturi
chimice, sau pentru a forma noi legaturi chimice.
De unde provine energia necesara reactiilor endergonice??
Enzimele- reduc energia de activare prin formarea unuia sau a mai multor complexe enzima-substrat
(ES)
-complexele ES- sunt mai reactive decat substratul
Ex: Degradarea celulozei nu are loc spontan
Legaturile dintre unitatile de glucoza sunt legaturi covalente- stabile
Mecanismul catalizei enzimatice

S + E ↔ E-S → E+P

Cum se poate evidentia formarea complexului enzima-substrat?

1. Cristalografia de raze X
Enzimele micsoreaza energia de activare necesara convertirii moleculelor participante la reactie intr-o
stare reactiva, prin formarea unuia sau a mai multor complexe enzima-substrat.
2. Modificari spectrale la formarea complexului enzima-substrat
Enzimele nu modifica echilibrul unei reactii
Enzima= triptofan sintetaza (bacterii)
Grupare prostetica-piridoxal fosfatul
Substratul: 1-serina si derivat de indol
Mecanismele de actiune ale enzimelor
Mecanismul unei reactii catalizate enzimatic = descriere detaliata a evenimentelor care au loc in
timpul reactiei enzimatice la nivel molecular, atomic si subatomic.
Cunoasterea mecanismului de actiune a unei enzime inseamna:
• clarificarea modului in care enzima reactioneaza cu substratul la formarea complexului enzima-
substrat;
• stabilirea structurii si a numarului acestor complexe;
• modul de formare si de eliberare a produsilor de reactie;
• modul de regenerare a enzimei libere.
Mecanismul catalizei enzimatice
Enzimele nu actioneaza toate dupa un singur mecanism de reactie universal valabil
Dintre numeroasele mecanisme de actiune propuse, cele mai importante sunt:
1. Efecte de apropiere si orientare
2. Cataliza acido-bazica
3. Cataliza covalenta
4. Cataliza prin distorsiune
1. Cataliza prin efecte de apropiere si orientare
Se datoreaza capacitatii unor enzime de a-si apropia si orienta gruparile reactive din centrul catalitic
activ in vederea facilitarii legarii substratului.
Viteza reactiei creste datorita, acestor efecte de apropiere si orientare.
Tipuri de efecte de orientare:
– Orientarea substratului
– Orientarea unor grupari catalitice din structura enzimei
Proximitatea (apropierea): Reactia dintre doua molecule nu necesita neaparat coliziunea dintre acestea.
Ele pot fi aduse in contact -cresterea locala a concentratiei substratelor
Orientarea: Substratele nu numai ca sunt apropiate unele fata de altele dar sunt orientate in pozitie
optima pentru a reactiona
2. Cataliza acido-bazica
Consta in procese de transfer de protoni intre gruparile acido-bazice ale enzimei si cele ale substratului.
 Este cel mai frecvent mecanism intalnit in cataliza enzimatica.

Cataliza acido bazica:

• Specifica (H+, OH-)
• Generala
In calitate de catalizatori acido-bazici generali pot functiona :
• gruparile carboxilice sau aminice libere ale resturilor aminoacizilor acizi sau bazici;
• gruparea tiol a cisteinei,
• gruparea imidazol a histidinei
Grupari ionizabile prezente in situsul activ al enzimelor
3. Cataliza covalenta
Presupune formarea unui intermediar in care substratul este legat covalent de enzima. Cataliza poate
avea loc prin atacul nucleofilic sau electrofilic al enzimei asupra substratului
1. Cataliza nucleofila
2. Cataliza electrofila
Atom nucleofil - prezinta o pereche de electroni neparticipanti pe care-i poate ceda foarte usor.
Atom electrofil - are capacitatea de a accepta o pereche de electroni.
Catalizatori nucleofili (resturi de histidina, cisteina, serina, lizina)
Catalizatori electrofili (ionii metalici)
Mecanismul de actiune al unor serin proteaze digestive- exemplu de cataliza covalenta si acido-bazica
Secventa de aminoacizi a unor serin proteaze digestive
Identitate: >40 %
Centrul activ este format din resturile aminoacizilor:
His57, Asp102, Ser195 Triada catalitica

Specificitatea de substrat a serin proteazelor digestive

Diferente la nivelul situsului activ al serin proteazelor digestive:
Chimotripsina- un rest de serina (lipsita de sarcina electrica) la nivelul situsului activ hidrofob capabil sa
interactioneze cu resturile unor aminoacizi aromatici
Tripsina- un rest de aspartat (incarcat negativ) care leaga lizina sau arginina
Elastaza- resturi de valina sau treonina care leaga aminoacizii cu masa moleculara mica (glicina sau
alanina)
Mecanismul de actiune al chimotripsinei
Mecanismul de actiune al chimotripsinei are la baza doua tipuri de cataliza enzimatica:
1. Cataliza covalenta
2. Cataliza acido-bazica generala
Ciclu de reactii incepe cu extragerea unui proton de catre His57 de pe restul de Ser195, generandu-se
astfel un puternic reactant nucleofil care va ataca legatura peptidica din substrat.
Aceasta reactie este posibila datorita restului de Asp102, care stabilizeaza histidina, prin legaturi de
hidrogen, favorizand atacul asupra restului de Ser195

Mecanismul de actiune al unor metaloenzime

• Ionii metalici sunt parte integranta din structura enzimelor, si participa la procesul catalitic:
metaloenzimele
• Ionii metalici nu intra in structura enzimei- enzime activate de ioni metalici (kinazele, au nevoie
de ionii de Mg 2+ pentru a forma complexe cu ATP)
Ionii metalici:
 Pot interveni in orientarea substratului pentru a putea fi transformat de enzima
 Pot fi catalizatori electrofili Ex: Zn2+= cofactor pentru anhidraza carbonica
 Pot media reactii de oxido-reducere la nivelul situsului activ
 participa direct la activarea enzimelor din precursori inactivi (carboxipeptidaza A)
Mecanismul de actiune al anhidrazei carbonice
• Anhidraza carbonica (carbonic-anhidraza) este o Zn-enzima care catalizeaza hidratarea
reversibila a CO2 sau a altor compusi carbonil (acetaldehida).

• Atomul de Zn formeaza chelati cu 3 resturi de His (94,96,119) ai enzimei. A patra legatura se

realizeaza cu o molecula de H2O.
• Enzima contine un situs protonat si unul deprotonat, aflate in echilibru permanent, fapt ce
explica reversibilitatea reactiei.
Rol: mentinerea echilibrului acido-bazic
4. Cataliza prin deformare (distorsiune)
 Se aplica in special la enzimele hidrolitice
 Accelerarea vitezei de reactie prin acest mecanism s-ar datora inducerii unei tensiuni in
molecula substratului, ceea ce ar determina “activarea” sa.
 Se presupune astfel ca legarea specifica a substratului de molecula enzimei induce aparitia unei
tensiuni sau a unei deformari in legatura ce urmeaza a fi scindata.
 Deformarea survenita permite complexului enzima-substrat sa fie mai reactiv decat substratul
singur si sa se transforme mai rapid in produsii de reactie.
 Ex: fosfataza alcalina, lizozim, etc.
Relatia dintre anabolism si catabolism
 Procese de degradare, in care moleculele organice complexe, de origine exogena, sunt scindate
in constituenti simpli, reactiile dominante fiind de tip oxidativ.
  Se caracterizeaza prin transformarea si conservarea energiei din structura compusilor
biochimici exogeni, sub forma moleculei de ATP.
 Prin catabolism se elibereaza energie ce va fi incorporata sub forma de legaturi macroergice in
molecula de ATP.

 Procese biosintetice in care, pornind de la precursori simpli, se ajunge la compusi cu un inalt

grad de organizare si complexitate, reactiile dominante fiind de tip reducator.
 Procesele anabolice decurg cu scaderea entropiei si cu consum de energie ce este furnizata de
ATP.
 Caile anabolice nu reprezinta o simpla inversare a cailor catabolice.
De ce este nevoie de reglarea activitatii metabolice/ enzimatice?
 sintetiza precursorilor care nu sunt disponibili in dieta.
 cand precursorul este deja disponibil se opreste sinteza.
 sinteza precursorilor si a macromoleculelor precum si degradarea lor in proportii adecvate.
Reglarea activitatii enzimatice
Modalitati de reglare:
1. Controlul sintezei de enzime (transcrierea si traducerea ARNm pentru genele care codifica
enzimele)
2. Control prin intermediul efectorilor sau prin control alosteric
3. Modificari covalente
Reglarea biosintezei enzimelor
 • Controlul biosintezei enzimelor se poate realiza la nivelul transcrierii, prin fenomenul de
inductie si represie, si la nivelul traducerii prin blocarea initierii biosintezei proteice si
degradarea ARNm.
• In afara acestor mecanisme de control, biosinteza enzimelor poate fi reglata printr-o serie de
mecanisme suplimentare cum sunt:
1) viteza de atasare a ribozomilor la ARNm;
2) stabilitatea ARNm;
3) fondul de ribonucleotide al celulei din care se formeaza ARNm;
4) viteza de sinteza a diferitelor tipuri de ARN si a precursorilor lor;
5) concentratia relativa a diferitelor tipuri de molecule de ARNt necesare legarii aminoacizilor;
6) fondul de aminoacizi al celulei, materialul de constructie a proteinelor.
1.Controlul sintezei de enzime
Ex: - β-galactozidaza la bacterii (E.coli)
- enzimele implicate in biosinteza histidinei
Reglarea biosintezei enzimelor la nivelul transcrierii
• Inductia este procesul de stimulare a biosintezei proteinelor datorita prezentei unui inductor.
Exemple de inductie:
• O cultura de E. coli crescuta pe un mediu din care lipseste lactoza – un galactozid – nu are
aproape deloc activitate β -galactozidazica, celula continand doar 1-3 molecule de enzima.
Adaugarea de β-galactozid (lactoza) in mediul de cultura determina la scurt timp (3-4 minute, la
37°C) aparitia unei activitati β-galactozidazice maxime; in celula se vor gasi circa 2.000 de
molecule de enzima, iar activitatea enzimatica va creste de 600-2.000 de ori.
• Masurarea simultana a concentratiei de ARNm, responsabil de codificarea enzimei, prezinta o
crestere doar pe durata prezentei inductorului – reprezentat de allolactoza (produs secundar a
metabolismului lactozei sub actiunea β –galactozidazei) sau izopropiltiogalactozid (IPTG).
 • Represia reprezinta diminuarea sau oprirea biosintezei proteinelor datorita actiunii unui
represor. Represorul reprezinta proteina codificata de gena reglatoare care blocheaza operonul
in urma cuplarii cu regiunea operator din ADN (ex. represorul MetJ in cazul blocarii sintezei
metioninei).
• Represia reprezinta diminuarea sau oprirea biosintezei proteinelor datorita actiunii unui
represor.
• Exemple de represie:
– O cultura de E. coli poate sa se dezvolte foarte bine pe un mediu de cultura care cuprinde clorura de
amoniu ca sursa de azot si un compus organic, de exemplu glucoza, ca sursa de carbon. Pornind de la
acesti doi compusi din mediul de cultura, bacteria isi sintetizeaza toti compusii de care are nevoie pentru
cresterea si dezvoltarea sa (aminoacizi, glucide, lipide etc.). Prin introducerea in mediul de cultura a unui
aminoacid, biosinteza aminoacidului respectiv de catre bacterie inceteaza.
Ex. Represia sintezei de triptofan in prezenta triptofanului.

• Un astfel de mecanism este, insa, mai putin economic pentru celula, deoarece permite
realizarea transcrierii, pentru care se consuma material de “constructie” si energie, care nu se va
finaliza.
• La eucariote se cunosc actualmente mai multe mecanisme majore de control la nivelul
traducerii:
1) blocarea etapei de intiere a biosintezei proteinelor;
2) reglarea prin intermediul hormonilor steroidici (atat la nivelul traducerii cat si transcrierii);
3) legarea unor proteine care stabilizeaza ARNm;
4) destabilizarea si degradarea ARNm in citosol dupa legarea unor ARN cu molecula mica de
interferenta complementar pe anumite portiuni cu ARNm;
5) degradarea proteinelor implicate in reglarea metabolica la nivelul proteasomilor.
2. Reglarea activitatii enzimatice de catre efectori
 Activare
 Inhibare
ATCaza- Aspartat carbamoiltransferaza (E.coli, biosinteza pirimidinei)

 Feed-back negativ
Produsul final = L-izoleucina inhiba activitatea enzimatica a treonindezaminazei.

3. Modificari covalente
 Fosforilare
 Clivare proteolitica a precursorilor enzimei
 Adenilare
 Metilare
 ADP-ribozilare
Fosforilare
(Serina, Treonina, Tirozina) Ex: glicogen fosforilaza
Clivare proteolitica
 enzimele proteolitice din stomac si pancreas
 Sintetizate ca zimogen - forma inactiva
Ex:
- Chimotripsina
- Pepsina
- Carboxipeptidaza
• Ex. Fosforilare-defosforilare- enzime implicate in metabolismului glicogenului
• Adenilare: reglarea activitatii glutamin sintetazei sau a GTP-azelor mici (Rho, Rab).
• Uridinilare: reglarea proteinei bacteriene PII implicate in reglarea glutamin sintetazei
• ADP-ribozilare: reglarea activtatii enzimelor implicate in apoptoza, proliferare celulara
• Metilare: enzimele implicate in caile de semnalizare celulara.
Metode de studiu ale enzimelor
Elemente de proteomica
Genomul, transcriptomul si proteomul
Genomul: toate genele dintr-un organism.
Genomica: studiaza genomul
Transcriptomul: totalitatea ARNm prezent la un moment dat intr-o anumita celula sau organism
Transcriptomica: studiaza transcriptomul
Proteomul: colectia completa de proteine dintr-o anumita celula
Proteomica: studiaza proteomul
De ce a fost necesara aparitia proteomicii ?
Pana in 1995: cercetare pe baza unei ipoteze (engl., “hypothesis-driven research”), in care
cercetatorul propunea o ipoteza care sa explice anumite observatii care apoi trebuiau
confirmate/infirmate experimental.
In prezent: cercetare bazata pe descoperire (engl., “discovery-driven research”), in care sunt
analizate componentele unui sistem aflat in cercetare fara existenta unei ipoteze anterioare.
Proteomul
Proteomul este setul complet de proteine produs de o celula sau un organism in anumite
conditii.
Proteomul este o entitate complexa si dinamica care poate fi caracterizata printr-o anumita
structura, secventa, abundenta, localizare, modificare, interactiuni si anumite functii biochimice.
Ce este proteomica?
La inceputul anilor ’90, Marc Wilkins si colab. introduc termenul de proteomica.
Definitia clasica a proteomicii= caracterizarea unui set de proteine (proteom) codificate de catre
genomul unui anumit organism.
Proteomica studiaza exprimarea proteinelor, structura, functia proteinelor, reglarea sintezei proteice si
modificarile postsintetice ale proteinelor in sistemele vii, precum si interactiunile proteinelor intre ele
sau cu alte tipuri de compusi chimici.
Obiecte de studiu ale proteomicii in cazul enzimelor
• Exprimarea partii proteice din structura enzimelor in cadrul unor celule;
• Reglarea sintezei enzimelor;
• Modificarile postsintetice ale enzimelor (ex. modificari covalente);
• Interactiunile enzimelor cu substratul sau cu liganzi diferiti (activatori, inhibitori).
De ce este necesar un studiu proteomic?
Analiza genelor si a ARNm ne informeaza indirect despre functia proteinelor.
Pentru o intelegere corespunzatoare a functiei proteinelor este necesar un studiu direct al
acestora.
Adundenta ARNm nu reflecta prezenta proteinelor corespunzatoare (vezi mecanismele de
reglare ale enzimelor).
Diversitatea proteinelor este generata dupa transcriere.
Anumite proteine devin functionale in urma modificarilor postsintetice care nu pot fi observate
doar prin studiul genomic sau transcriptomic.
• Functia unei proteine depinde adesea de localizarea sa.
Clasificarea proteomicii
• Proteomica structurala (“expression proteomics”) studiaza analiza cantitativa a proteinelor,
identificarea proteinelor codificate in diferite genomuri, gradele de exprimare ale proteinelor in
diferite celule si tesuturi.
• Proteomica functionala studiaza functionarea proteinelor in diferite complexe, modificarile
conformationale ale proteinelor pentru a realiza anumite functii, interactiunile proteina-
proteina, proteina-anumiti liganzi, proteina-acizi nucleici, etc.
• Proteomica legata de bioinformatica integreaza datele obtinute prin tehnicile proteomicii
structurale si functionale cu cele cuprinse in bazele de date privind genele codificatoare, asigura
predictia functiilor proteice pe baza unor domenii sau motive cuprinse in structurile proteice.
De ce este necesara integrarea tehnicilor de proteomica?
 pentru a determina puritatea enzimei izolate.
 pentru a determina daca enzima purificata. este functionala (pliata corespunzator, activa).
 pentru a monitoriza stabilitatea enzimei pe durata purificarii.
Tehnici de proteomica structurala
 Tehnici de extractie si purificare ale enzimelor
 Tehnici de cuantificare (dozare sau determinare cantitativa) ale enzimelor
 Tehnici de evidentiere si sau cuantificare ale enzimelor
 Tehnici de determinare a structurii enzimelor
Tehnici de extractie si purificare a enzimelor
Metode mecanice: determina dezintegrarea membranelor si a peretilor celulari pentru a elibera
enzimele aflate in studiu (sonicare, utilizarea unor detergenti).
Metode chimice:
a) Metode de precipitare;
b) Metode de separare cromatografica.
• Dezintegrarea membranelor biologice:
Tesuturile sau celulele se incubeaza cu un tampon de liza a membranelor celulare.
• Cel mai important component al tamponului de liza este detergentul utilizat pentru solubilizarea
componentelor membranelor celulare .
• SDS
• NP-40
• Triton X-100
• Tween 20
• CHAPS
• Cel de-al doilea component principal al tamponului de liza este inhibitorii de proteaze
• Price proteina denaturata este susceptibila degradarii induse de proteaze. Este nevoie
de mai mai multi inhibitori de proteaze.
• Aprotinina
• Leupeptina
• PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride, fluorura de fenilmetil sulfonil).
Inhibitori de fosfataze
 • Trebuie adaugati tamponului de liza in cazul in care avem proteine fosforilate
• Inhibitori
– ZnCl2
– NaF
– Vanadat de sodiu
– Coctail de mai multi inhibitori
Componente ale tamponului de liza
• Tampon (Tris sau Hepes cu pH 7-8)
• Sare (de obicei NaCl 150mM -500mM)
• Agent chelator (EDTA sau EGTA)
• Detergent
• Inhibitori de proteaze
• Inhibitori de fosfataze (optional)
• Incubarea cu tamponul de liza la 4°C;
• Obtinerea omogenatelor din lizate celulare sau tisulare (prin metode mecanice sau fizice);
Precipitarea proteinelor
Precipitarea proteinelor reprezinta trecerea din stare dizolvata in stare solida (precipitat).
Precipitarile pot fi reversibile sau ireversibile.
Ionii anorganici in concentratie mare precipita proteinele prin spargerea sferei de hidratare care le
inconjoara si stabilizeaza molecula proteica dizolvata, pentru a se dizolva ei insisi in apa extrasa.
Fenomenul acesta se numeste salifiere.
o Concentratia salina de precipitare variaza de la o proteina la alta, ceea ce permite fractionarea
proteinelor dintr-un amestec neomogen. Sarurile de sulfat de amoniu, de sulfat de magneziu si
sulfat de sodiu, precipita in mod reversibil proteinele, cu pastrarea activitatii biologice. Unele
saruri pot produce precipitarea ireversibila a proteinelor, ca in cazul sarurilor metalelor grele:
acetatul de plumb, sulfatul de zinc, azotatul de argint, clorura mercurica etc.
o O clasa de precipitanti proteici des utilizati in laborator include acizi (acidul tricloracetic, acidul
percloric, acidul sulfosalicilic, acidul fosfotungstic (fosfowolframic), acidul picric) sau baze care
pot desface puntile saline din structura lanturilor polipeptidice.
o Proteinele precipita la punctul izoelectric.

Cromatografia- o metoda de separare a compusilor dintr-un amestec, in urma interactiunii acestora cu

2 faze distincte din punct de vedere fizic: o faza mobila si o faza stationara sau fixa.
Exemple de tehnici cromatografice utilizate pentru separarea enzimelor: cromatografia prin excludere
moleculara; cromatografia pe schimbatori de ioni, cromatografia de afinitate.
• Tehnici de cuantificare (dozare sau determinare cantitativa) a enzimelor: determinari
colorimetrice, spectrofotometrice sau cromatografice (HPLC);
• Tehnici de evidentiere si/ sau cuantificare a enzimelor: electroforeza in conditii denaturante
(SDS-PAGE) si nedenaturante, Western blotting, electroforeza bidimensionala (2D), tehnica
array pentru proteine.
A se studia referatele lucrarilor practice de Biochimie I si II (metode de dozare a proteinelor,
determinarea activitatii catalitice, SDS-PAGE, spectrofotometria).
Ce este cromatografia?
- o metoda de separare a compusilor dintr-un amestec, in urma interactiunii acestora cu 2 faze
distincte din punct de vedere fizic: o faza mobila si o faza stationara sau fixa.
• Faza mobila: gaz, lichid
Rol: desprinde un compus dintr-un amestec de pe faza stationara
• Faza stationara: lichid sau solid
Tipuri de cromatografie
 Dupa scopul urmarit:
Tehnici analitice (ex: determinarea unor impuritati)
Tehnici preparative (cantitative)
 Dupa mecanismul de separare:
Cromatografie de partitie
Cromatografie de adsorbtie
Cromatografie de afinitate
Cromatografie de excluziune moleculara (gel filtrare)
Cromatografia de partitie
- o metoda de separare a compusilor dintr-un amestec, in urma solubilitatii acestora in 2 faze
distincte din punct de vedere fizic: o faza mobila si o faza stationara sau fixa.

Kd = Concentratia substantelor dizolvate in faza stationara / Concentratia substantelor dizolvate in faza

mobila
Utilizarea cromatografiei in strat subtire
Determinare calitativa:
• determinarea numarului de componenti dintr-un amestec
• identificarea compusilor necunoscuti dintr-un amestec
Cromatografia de adsorbtie (pe schimbatori de ioni)
Principiu: separarea unui compus dintr-un amestec , pe baza unui proces de schimb ionic datorita
stabilirii unor legaturi de natura electrostatica intre sarcinile electrice ale macromoleculelor analizate si
sarcinile electrice de semn contrar ale schimbatorului de ioni.
Eluarea moleculelor de pe schimbatori de ioni
Utilizarea fortei ionice
Modificarea pH-ului
Aplicatii: separarea, purificarea, caracterizarea enzimelor.
Cromatografia de excludere moleculara (gel-filtrarea)
Principiu: separarea compusilor organici dintr-un amestec, prin trecerea lor printr-o “sita moleculara”
creata de reteaua unui gel hidrofil.
Caracteristicile gelului:
- stabil intr-un interval larg de pH (2-9).
- “sita moleculara” care conditioneaza separarea moleculelor in functie de
dimensiunea lor.
Aplicatii ale cromatografiei de excludere
• izolarea si fractionarea macromoleculelor
• concentrarea substantelor cu masa moleculara
mare in vederea analizei lor ulterioare
• desalifierea moleculelor proteice
Cromatografia de afinitate - Cromatografia de imunoafinitate
Principiu: Separarea unui compus dintr-un amestec pe baza afinitatii fata de un ligand legat de faza
solida
Cromatografia de imunoafinitate - Utilizeaza anticorpi monoclonali care prezinta afinitate doar pentru
un anumit compus de interes (antigen)
HPLC sau cromatografia lichida de presiune inalta (in general 5800 – 7000 psi (psi=pounds per square
inch= 0.068 atm) este caracterizata prin utilizarea unei presiuni inalte pentru a asigura trecerea fazei
mobile printr-o coloana care contine faza stationara strans impachetata in vederea separarii de inalta
rezoltutie a constituientilor unei probe .
Echipament HPLC

Tipuri de detectoare
• UV/VIS
– Cu o singura lungime de unda (filtre);
– Cu lungimi de unda variabile (monocromator);
– Cu citire simultana la mai multe lungimi de unda.
• Cu fluorescenta
• Electrochimice (are la baza oxidarea analitului dupa desprinderea de pe coloana, si masurarea
fluxului de electroni).

• Spectrometre de masa (are la baza analiza moleculei prin ionizare si observarea

comportamentului sau in campul electric sau magnetic).
Tipuri de metode HPLC
Tehnici HPLC cele mai utilizate
• cu faza stationara normala (engl. Normal Phase).
 faza stationara polara si faza mobila nepolara.
• cu faza stationara inversa (engl. Reverse Phase).
 faza stationara nepolara si faza mobila polara.
• Eluarea analitului de pe faza stationara este obtinuta prin modificarea polaritatii, tariei ionice si
a pH-ului.
HPLC in faza normala vs. HPLC in faza inversa

Faze mobile utilizate in HPLC

Faze stationare folosite in HPLC

Parametrii intr-o analiza HPLC
• Faza mobila si coloana
• Volumul de injectie
• Temperatura de incubare
• Lungimea de unda
• Timpul de masurare
Cromatograma = Aproximarea prin aria triunghiului care incadreaza peak-ul

Ultra performance liquid chromatography (UPLC) of Ultra high performance liquid chromatography
(UHPLC)
 • Pompele au capacitatea de a realiza presiuni de pana la 15000 psi (UPLC) si de pana la 20000 psi
(UHPLC).
• Coloanele au matrici (suporturi solide) cu granulatie sub 2 µm.
• Avantaje: o rezolutie mai buna a separarii.

Tipuri de electroforeza Western blotting Imunoprecipitare

Electroforeza—generalitati
• Definitie: miscarea diferentiata a speciilor chimice incarcate electric (a ionilor) prin atractie sau
respingere intr-un camp electric, in functie de raportul sarcina/masa.
• v=Eq/f
– v = viteza de migrare a unei molecule
– E = camp electric
– q = sarcina neta a moleculei
– f = coeficient de frecare
Factorii care afecteaza mobilitatea particulelor in camp electric
• marimea sarcinii analitilor din proba
• natura suportului de migrare
• suprafata interioara a porilor suportului si porozitatea suportului
• tensiunea aplicata
• natura si concentratia electrolitului (solutiile tampon)
• pH electrolitului
• temperatura si vascozitatea solutiei
Tipuri de electroforeza
• Electroforeza in mediu liber (frontala)
• Electroforeza in mediu stabilizant (zonala)
• Ex. electroforeza cu focalizare izoelectrica
• Electroforeza la tensiune joasa sau inalta in medii:
• inerte (a caror interactiune cu particulele care
• migreaza este neglijabila)
• care participa activ in separare (interactioneaza
cu particulele care migreaza): imunoelectroforeza.
Aplicatiile tehnicilor elecroforetice

• Chimie analitica
• Biochimie
• Biotehnologii
• Stiinta alimentelor
• Diagnosticul clinic
• Cercetarea medicala
• Monitorizarea calitatii mediului
• Stiintele farmaceutice
• Etc.
 • Migrarea in camp electric depinde de marimea si sarcina fiecarei molecule.
Tipuri de electroforeza utilizate pentru separarea proteinelor:
• Electroforeza capilara (masa si sarcina proteinei)
• SDS-PAGE - in gel de poliacrilamida (greutatea moleculara)
• Focalizarea la punct izoelectric (sarcina proteinei, pI)
• Electroforeza bidimensionala (pI si greutate moleculara)
Gel- electroforeza in SDS-poliacrilamida
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
• Aceasta metoda de electroforeza utilizeaza pentru migrare un gel puternic hidratat de
poliacrilamida, a carui porozitate poate fi reglata pentru a evita fenomenul de sita moleculara a
gelului.
• Solventul utilizat pentru dizolvarea proteinelor contine un detergent anionic numit dodecil sulfat
de sodiu (sodium dodecyl sulfate, SDS), care se leaga de regiunile hidrofobe ale proteinelor,
cauzand despachetarea lor si eliberarea lanturilor polipeptidice din agregatele moleculare. De
asemenea, SDS incarca negativ catenele polipeptidice.
• In gelul de poliacrilamida, moleculele mai mari vor migra mai lent decat moleculele mai mici,
deorece viteza migrarii este determinata nu numai de campul electric ci si de efectul de sita
moleculara a gelului.
Solventul utilizat pentru dizolvarea proteinelor contine un detergent anionic numit dodecil sulfat de
sodiu (sodium dodecyl sulfate, SDS), care se leaga de regiunile hidrofobe ale proteinelor, cauzand
despachetarea lor si eliberarea lanturilor polipeptidice din agregatele moleculare. De asemenea, SDS
incarca negativ catenele polipeptidice.

Pregatirea probelor biologice

• Incubarea cu tamponul de liza la 4°C;
• Obtinerea omogenatelor din lizate celulare sau tisulare (prin metode mecanice sau fizice);
• Determinarea concentratiei proteice;
• Prepararea probei pentru migrat in gelul de poliacrilamida:
» Se trateaza proba cu tamponul pentru denaturarea proteinelor
din proba (tampon de probe, “loading buffer);
» Tamponul de probe contine:
» Tris-Cl pH 6.0
» 2% SDS – pentru solubilizarea monomerilor de proteina
» 0.1% albastru de bromofenol- pentru colorare
» 10% glicerol (pentru a se depune in godeu)
» β-mercaptoetanol (agent reducator).
• Probele se incubeaza cu tamponul de probe si apoi se fierb 3-5 minute.
SDS-PAGE
• Echipamente necesare:
- placi de sticla pentru solidificarea gelului;
- pieptene;
- camera de electroforeza formata din doua compartimente: central sau de sus (-) si
compartimentul lateral sau de jos (+);
- redresor;
- baie de apa pentru denaturarea probelor proteice.
Reactivi pentru prepararea gelurilor in SDS-PAGE
• Se prepara doua geluri: un gel de migrare si un gel in care se incarca probele (gelul de
concentrare).
Reactivi pentru prepararea gelurilor:
• SDS- pentru incarcarea negative a proteinelor
• Tris – asigura sursa de ioni pentru migrare
• Acrilamida si NN-bis-acrilamida
– monomerii necesari formarii retelei de gel
• TEMED (Tetrametiletilendiamina)
• declanseaza polimerizarea (produce radicali liberi din persulfat de amoniu
• Persulfat de amoniu
- sursa de radicali liberi pentru polimerizare.
Could purchase pre-cast gels if you have the
Tipuri de aparate utilizate
• Mari
– Geluri cu 10 sau 15 godeuri
– 200ml de proba
• Mici
– Geluri cu 10 sau 15 godeuri
– Max. 30- 50ml de proba
Gelul de migrare (running gel)
• Concentratia de acrilamida:
– 15% pentru proteine de 12-43kDa
– 10% pentru proteine de 16-68kDa
– 7.5% pentru proteine de 36-94kDa
– 5.0% pentru proteine de 57-212kDa
- Tamponul Tris utilizat are un pH < 8.
Gelul de concentrare (stacking gel)
• Se prepara dupa polimerizarea gelului de migrare.
• Tamponul Tris utilizat are un pH < 6.8.
• Contine 5% acrilamida.
• Asigura depozitarea si concentrarea proteinelor la interfata dintre gelul de concentrare si gelul
de migrare.
Operatii efectuate dupa migrarea proteinelor in gel in cadrul SDS-PAGE
• Colorarea gelului si evidentierea benzilor de proteine.
sau
• Electrotransferul monomerilor proteici pe hartie de nitroceluloza in vederea efectuarii tehnicii
western blot.
Tehnica “Western Blotting”
• Western Blotting permite detectia proteinelor separate in urma electroforezei in gel (SDS-
PAGE), dar si evidentierea unor modificari ale exprimarii anumitor proteine in celule.
• Identifica proteinele si le estimeaza masa lor moleculara.
• Permite indentificarea fosforilarii si modificarilor lipidice postsintetice ale proteinelor.
• Permite detectia unor cantitati reduse de proteine. Este atat o metoda de detectie, cat si de
cuantificare semicantitativa a proteinelor.
Terminologie
• Western blotting (immunoblot de proteine) pentru detectia de proteine.
• Southern blotting pentru detectia unei secvente de ADN.
• Northern blotting pentru detectia exprimarii genice (a unei secvente de ARN).
• Eastern blotting pentru detectia unor proteine modificate postsintetic prin adaugare de resturi
glucidice, lipidice etc.
• Southwestern blotting, pentru detectia unor proteine de legare de ADN-ului.
In prima etapa, proteinele sunt separate pe un gel de poliacrilamida si apoi sunt electrotransferate pe
un suport (membrana) format dintr-un material inert din punct de vedere chimic (ex. nitroceluloza).
Aparatura de electrotransfer
• 2 tipuri de aparate:
– Aparat pentru transfer umed
– Contine o camera (sau tanc de transfer)
plina cu tampon de transfer .
– Aparat pentru transfer semi-uscat
• Nu exista camera de transfer.
• Se umecteaza electrozii in tamponul de transfer.
Etapa de blocare
– Pentru a evita legarea nespecfica a acestor anticorpi de alte tipuri de proteine se efectueaza o
incubare prealabila cu un “tampon de blocare” care contine un amestec de proteine (lapte praf
degresat sau solutie de albumina serica bovina).
 Incubare cu anticorpii primari. Urmeaza etape succesive de incubare cu anticorpi anti-proteina de
interes. Anticorpul care leaga proteina de interes se numeste anticorp primar.
• Dupa blocare se incubeaza membrane cu proteinele de interes cu anticorpii anti-proteinele
respective la concentratia specificata de producator.
• Solutia de anticorp se prepara in tamponul de blocare.
• Incubarea cu solutia de anticorpi primari are loc fie la 4oC in jur de 12 ore sau 1-2 ore la temperature
camerei (25oC).
• In tamponul de spalare se adauga si detergent Tween 20 pentru a inlatura legarea nespecifica
 Incubare cu anticorpii secundari
• Pentru amplificarea semnalului produs de legarea anticorpului primar, acesta este recunoscut de un
anticorp secundar cuplat cu o enzima (de exemplu, peroxidaza din hrean - HRP (engl. Horse raddish
peroxidase)).
• Se adauga anticorpii anti-specia in care au fost produsi anticorpii primari. Acesti anticorpi sunt arcati
prin conjugare cu enzime (ex. Peroxidaze) sau cu fluorofori.
• Incubarea cu solutia de anticorpi secundari are loc fie la 4oC in jur de 12 ore sau 1-2 ore la
temperature camerei (25oC).
• Urmeaza o etapa de detectie prin incubarea cu substratul enzimei, iar detectia se poate efectua
fie prin masurarea chemiluminiscentei emisa de produsul de reactie (prin expunerea unui film
de autoradiografie) sau prin vizualizarea culorii produsului de reactie.
SNAP i.d.® Protein Detection System
• Sistemul asigura o crestere a interactiunii anticorp-proteina cu ajutorul vidului.
• Reduce timpul de incubare (10 min.-1 ora)
Cerinte privind tehnica western blotting
• Se interpreteaza rezultatele prin comparare cu proteinele identificate intr-un lot martor.
• Rezultatele se compara incarcand aceeasi cantitate de proteina/godeu de SDS-PAGE.
• Se utilizeaza un control pozitiv (loading control) din proba biologica analizata.
• Se poate reutiliza anticorpul primar de cel putin trei ori.
• In cazul in care nu se pot vizualiza proteinele prin western blotting se utilizeaza
imunoprecipitarea.
Imunoprecipitarea proteinelor
Este aplicabila in cazul in care:
• nu se pot vizualiza proteinele prin western blotting;
• analiza asocierii proteinelor cu alte macromolecule;
• analiza modificarilor postsintetice ale proteinelor;
Se bazeaza pe legarea proteinelor A (din peretele bacteriei Staphylococcus aureus si respectiv G
(Streptococcus sp.) de anticorpi cu formarea unor precipitate.
Se utilizeaza particule magnetice cu proteina A sau B sau proteina recombinata A/G pentru legarea
complexelor imune.
 • Migrarea in camp electric depinde de marimea si sarcina fiecarei molecule.
Tipuri de electroforeza utilizate pentru separarea proteinelor:
• Electroforeza capilara (masa si sarcina proteinei)
• SDS-PAGE - in gel de poliacrilamida (greutatea moleculara)
• Focalizarea la punct izoelectric (sarcina proteinei, pI)
• Electroforeza bidimensionala (pI si greutate moleculara)
Punctul izoelectric (pI) al proteinelor
• Majoritatea proteinelor sunt electroliti amfoteri, avand atat proprietati ale bazelor, cat si ale
acizilor. In fiecare proteina exista numeroase grupari aminice (-NH2) si carboxilice (-COOH)
libere, apartinand aminoacizilor diaminomonocarboxilici, respectiv monoaminodicarboxilici.
• In cursul titrarii unei proteine apare o valoare de pH la care incarcarea aparenta este zero; acest
pH se numeste punct izoelectric (pI) si se evidentiaza experimental prin lipsa migrarii in campul
electric.
• La pI, sarcina neta a moleculei proteice este nula, iar solubilitatea proteinei este minima.
• Din cauza numarului mare de sarcini purtate, proteinele sunt polielectroliti. La trecerea unui
curent electric, ionii se vor deplasa spre polul de semn contrar, fenomen numit electroforeza.
Combinarea electroforezei cu precipitarea la punctul izoelectric (engl., IEF - "isoelectric
focusing") constituie o metoda moderna si extrem de sensibila pentru separarea si izolarea
diverselor proteine din amestecuri (apartine grupului de tehnici de proteomica structurala).
Electroforeza bidimensionala (I)
Aceasta metoda se bazeaza pe utilizarea unui amestec de amfoliti (compusi sintetici cu grupari
ionizabile), care sunt lasati sa se distribuie pe lungimea tubului electroforetic sub influenta campului
electric, in functie de sarcina fiecarei particule de amfolit.
O varianta mai imbunatatita de separare a proteinelor in functie de pI este utilizarea de imobiline
(derivati carboxilati sau aminati ai monomerilor de acrilamida, cu un anumit pH). Dupa crearea unui
gradient de pH, in urma polimerizarii imobilinelor, se introduce amestecul de proteine de studiat.
Fiecare proteina se va opri (precipita) la valoarea de pH corespunzatoare pI.
Electroforeza bidimensionala (II)
• “prima dimensiune”: IEF (proteinele sunt separate pe baza pI)
• “a 2-a dimensiune” : SDS-PAGE (proteinele snt separate pe baza greutatii lor moleculare)

Electroforeza bidimensionala (III)

Proteinele separate in gel se pot evidentia prin diferite metode de colorare :

• albastru Coomassie (colorantul este anionic si se leaga de aminoacizii incarcati pozitiv);

• coloratia cu saruri de argint (ionii de Ag se leaga de gruparile sulfhidril si carboxil din structura
proteinelor);
• utilizarea unor coloranti fluorescenti (de ex.,derivati cianinici - Cy – coloranti ce se leaga specific
de resturile de cisteina).
Metoda este extrem de sensibila permitand separarea proteinelor si identificarea lor ulterioara prin
spectrometrie de masa.

Metode de colorare a proteinelor dupa electroforeza bidimensionala

Majoritatea acestor metode de colorare sunt compatibile cu identificarea proteinelor prin spectrometrie
de masa (engl., MS – mass spectrometry).
• Spectrometria de masa, utilizata pentru determinarea masei moleculare, compozitia substantei.
• SM (MS) are la baza analiza moleculei prin ionizare si observarea comportamentului sau in
campul electric sau magnetic.
Proteomul si genomul sunt comparate
• Dupa identificarea secventei de aminoacizi din structura unei proteine, aceasta este comparata
cu secventele de codoni din genele codificatoare prin consultarea bazelor de date.
Studiul proteinelor prin spectrometrie de masa (MS)
• Principiul spectrometriei de masa consta in ionizarea in vid a probei (numita analit), urmata de
introducerea moleculelor ionizate intr-un camp electric si/sau magnetic.
• Trecerea lor prin campul electric si/sau magnetic depinde de masa si sarcina (m / z) lor.
• Aceasta tehnica poate dermina masa moleculara cu foarte mare precizie (raportul m / z fiind
specific fiecarui analit).
Aparatura moderna utilizata in MS permite fragmentarea in mod controlat a moleculelor analizate
pentru obtinerea de detalii suplimentare, care pot evidentia particularitati structurale. Controlul acestor
fragmentari este asistat de calculator.
O fragmentare controlata se poate obtine prin utilizarea unor tipuri diferite de proteaze care recunosc
legaturile peptidice dintre anumiti aminoacizi.
Spectrometria de masa in tandem (MS/MS)
• Este utilizata pentru identificarea unor proteine necunoscute.
• O solutie proteica de investigat este supusa unui tratament proteazic sau a unui alt agent chimic
care va fragmenta proteina in peptide scurte.
• Amestecul peptidic este apoi injectat intr-un aparat format din 2 spectrometre de masa care
functioneaza in tandem. In primul spectrometru de masa (MS-1) amestecul peptidic este sortat
si ionizat. Numai peptidele necunoscute (care nu se gasesc in baza de date a computerului
spectrometrului de masa) sunt selectate si lasate sa treaca prin camera de vid care separa cele 2
spectrometre de masa.
• In urma energiei inalte de coliziune cu un gaz inert (Heliu sau Argon), aceste peptide sunt
fragmentate in general la nivelul legaturii peptidice. Deoarece camera cu vid exclude apa, in
urma fragmentarii se formeaza radicali (de exemplu carbonil). Cele doua fragmente rezultate din
peptidele selectate sunt analizate in spectrometrul de masa 2(MS-2). Fragmentele rezultate
dintr-un peptid prin ruperea unei anumite legaturi peptidice au fie extremitati N-terminale (b)
fie C-terminale (y). Prin analiza tuturor fragmentelor rezultate prin ruperea legaturilor peptidice
din anumite pozitii se poate determina peptidul initial.
Cristalografia cu raze X
• La inceputurile sale ca metoda de cercetare stiintifica, cristalografia cu raze X a fost folosita
pentru determinarea dimensiunii atomilor, lungimii si tipurilor legaturilor chimice ori a
diferentelor la scara atomica intre diferite materiale, in mod special minereuri si aliaje. Metoda
a fost folosita si pentru descifrarea structurii si modului de functionare a multor molecule
biologice, inclusiv vitamine, enzime (proteine) si alte macromolecule biologice.
• Prin cristalografia cu raze X se determina aranjamentul atomilor dintr-o structura cristalina. In
esenta avem de-a face cu un fascicul de raze X care loveste cristalul studiat, iar pe baza
unghiurilor de difractie si a intensitatilor razelor imprastiate se obtine o imagine tridimensionala
 a densitatii electronilor din interiorul cristalului. Pe baza valorilor asociate acestei densitati de
electroni pot fi determinate pozitiile atomilor in macromolecula proteica, precum si legaturile
chimice dintre acestia.
Cristalografia cu raze X sta la baza unor mari descoperiri recompensate cu Premii Nobel
• Structurile macromoleculelor biologice ale proteinelor, unele neregulate si mult mai mari decat
in cazul sarurilor, au reprezentat urmatorul obiectiv. La finele anilor '50, in 1958, un model
tridimensional al mioglobinei era pus la punct de catre Max Perutz si Sir John Cowdery Kendrew,
iar in 1959 Max Perutz determina structura moleculara a hemoglobinei, dupa 22 de ani de
cercetari. In 1962, Max Perutz si Sir J.C. Kendrew primeau Premiul Nobel pentru Chimie.
• Watson, Crick si Wilkins au fost distinsi cu Premiul Nobel pentru descoperirea structurii dublu-
helicale a ADN si in urma studierii acestei molecule cu ajutorul cristalografiei cu raze X.
• De asemenea, cei trei laureati ai Premiului Nobel pentru Chimie din 2009, Ada E. Yonath,
Venkatraman Ramakrishna si Thomas A. Steit, premiati pentru descifrarea structurii si
functionarii ribozomului, "fabrica de proteine" a fiecarei celule, nu ar fi reusit in cercetarile lor
fara a folosi tehnica cristalografiei cu raze X.
Aplicatie practica - validarea unui proces biotehnologic
• Validarea unei proces biotehnologic inseamna demonstrarea ca acest procesul indeplineste
toate conditiile pentru aplicatiile practice pentru care a fost optimizat.
• Pentru a intocmi documentatia pentru dosarul de validare este nevoie de un protocol de
validare si un raport de validare.
• Protocolul de validare este o descriere a studiilor specifice de validare si a modalitatilor de
evaluare a rezultatelor privind acceptabilitatea lor (adica descrierea parametrilor de
performanta a procesului.
• Raportul de validare trebuie sa contina conditiile in care s-a facut validarea (adica cu ce fel de
echipamente, personal), rezultatele obtinute, concluzii privind interpretarea acestor rezultate.
Cei mai importanti parametri de performanta ai unui proces biotehnologic
• Acuratetea (exactitatea)
• Precizia (fidelitatea)
• Repetabilitatea
• Reproductibilitatea
• Liniaritatea
ACURATETEA (EXACTITATEA)
Acuratetea (exactitatea) = o caracteristica a apropierii rezultatelor analitice de valoarea
adevarata. Exactitatea este o masura a deviatiei valorii medii gasita prin analiza, fata de valoarea
adevarata.
Acuratetea se evalueaza prin aplicarea procesului studiat, la probe cu concentratii cunoscute
(de exemplu concentratii cunoscute de substrat enzimatic).
Se recomanda ca studiile de exactitate pentru diverse produse sa se efectueze la nivele de
80%, 100% si 120% (un interval de 80 – 120% sau chiar 75 – 125% din concentratia reala).
Pentru probele biologice, regasirea poate fi ± 80% din concentratia reala.
PRECIZIA
 Precizia exprima ingustimea gradului de dispersie a valorilor unor masuratori care provin din mai
multe serii ale aceleiasi probe (rezultate independente) in conditii identice de lucru.
Precizia ofera date asupra erorilor intamplatoare si nu are nici o legatura cu valoarea adevarata.
Deoarece toate masuratorile contin erori intamplatoare, rezultatul unei singure masuratori nu poate fi
acceptat ca valoare adevarata.
Se apreciaza prin calcularea coeficientului de variatie denumit si deviatie standard relativa
(RSD), care se exprima ca procent, conform formulei de mai jos:

Criteriul acceptat pentru valoarea RSD in studiul preciziei metodei este RSD ≤ 2% (n ≥ 6).
Se determina pentru cel putin 3 concentratii.
REPETABILITATEA

Repetabilitatea: rezultatele independente sunt obtinute folosind aceeasi procedura, pe probe identice,
in acelasi laborator, de catre acelasi operator, utilizand acelasi echipament si intr-un interval scurt de
timp.
Repetabilitatea analizei se studiaza utilizand un minim de 9 determinari acoperind domeniul specific de
concentratie (de exemplu 3 determinari la 3 valori ale concentratiei), sau un minim de 6 determinari
pentru aceeasi concentratie.
Se calculeaza intervalul de incredere 95% si se aplica criteriul Chauvenet.
• Distributia normala (Gauss-Laplace)
Reproductibilitatea
• Reproductibilitatea sau stabilitatea unui proces biotehnologic reprezinta gradul de obtinere a
unor rezultatelor similare pe aceeasi proba, in conditii diferite, cum sunt: laboratoare diferite,
analisti diferiti, aparatura diferita, diferite loturi de reactivi, zile diferite de lucru etc.
• Se aplica testul t de neperechi pentru compararea a doua seturi de date si one way ANOVA
pentru compararea a trei sau mai multe seturi de date.
Compararea esantioanelor de masuratori.
• Testul t sau testul Student pentru un numar total de observatii <30
• Testul t se aplica pentru compararea mediilor a 2 esantioane care au fiecare o distributie
cunoscuta.
 •
Se poate determina utilizand din excel functia specifica pentru testul t care nu este de perechi
(engl. unpaired) sau se poate aplica formula pentru testul t de mai sus, si apoi valoarea p se afla
din tabele specifice pentru testul t, in care numarul de grade de libertate este n-1, unde n este
numarul total de elemente din cele 2 esantioane.
Notiuni de teoria probabilitatilor si statistica
Probleme de estimatie statistica
Compararea esantioanelor.
• Pentru compararea unui numar de esantioane mai mare decat 2 se aplica asa-numita metoda a
analizei de varianta sau ANOVA (engl. analysis of variance) .
• Avem mai multe metode de analiza de tip ANOVA. Cand se ia in calcul o singura variabila (un
singur factor) care ar putea sa influenteze aparitia unei observatii in cadrul unui esantion avem
one-way ANOVA, in cazul in care se iau in calcul 2 variabile (two-way ANOVA).
• Ex. de situatie in care aplica one-way ANOVA: grupuri experimentale supuse unor tratamente
diferite; cultura de drojdii cultivate in prezenta a diferite concentratii de glucoza.
• Ex. de situatie in care aplica two-way ANOVA: Exprimarea unor gene diferite in aceeasi tulpina
de drojdii in urma expunerii la UV la diferite intervale de timp.
• Metodele de tip ANOVA se pot aplica prin utilizarea din excel a pachetului “Data Analysis tools”.
LINIARITATEA

Liniaritatea reprezinta capacitatea procesului de a produce rezultate direct sau indirect

proportionale cu concentratia analitului din proba pe un anumit interval de concentratii.

De obicei, liniaritatea este reprezentata printr-o curba de regresie liniara a valorii masurate ca o
functie a cresterii concentratiei analitului

Criteriul de liniaritate se aplica pentru rezultatele obtinute, adica pentru relatia dintre
concentratia calculata experimental pe baza functiei de raspuns si cea introdusa (calculata teoretic).

In anumite cazuri, pentru a obtine liniaritatea intre raspuns si concentratia probei, datele
experimentale trebuie supuse unei transformari matematice inainte de analiza lor prin regresie. In cazul
dependentei vitezei de reactie de concentratia substratului enzimatic se aplica liniarizarea Lineweaver-
Burk.

In urma analizei de regresie se vor calcula coeficientul de corelatie (r), coeficientul de regresie
2
(r ).

Corelatia inseamna existenta unei asocieri intre cele doua variabile. Ambele variabile sunt
independente (nu se conditioneaza una pe cealalta).
De ex., asocierea dintre consumul de cafea si activitatea intelectuala
Daca o variabila depinde de cealalta, se determina functia de regresie (o dreapta
de regresie).
Cele doua variabile sunt numite: variabila independenta si variabila dependenta.
De ex. legatura dintre concentratia substratului si viteza de reactie a unei reactii catalizate enzimatic.
Notiuni de teoria probabilitatilor si statistica
Corelatii statistice intre parametri cuantificabili
• Corelatia liniara. Cand curba de regresie este o dreapta avem o corelatie liniara sau regresie
liniara. In acest caz gradul de legatura se apreciaza prin intermediul unui coeficient de regresie
sau coretatie liniara r. Acest coeficient se numeste coeficient Pearson.

Se aplica cand ambele variabile sunt distribuite normal. Cu cat valoarea sa este mai apropiata de -1 sau 1
cu atat corelatia este mai buna.
Cand avem corelatie pozitiva valorile lui r >0 si apropiate de 1, si in cazul corelatiei negative r < 0 si
apropiate de -1.
Coeficientul Pearson, r
Cand avem corelatie pozitiva valorile lui r >0 si apropiate de 1, si in cazul corelatiei negative r < 0 si
apropiate de -1.
Se poate calcula aplicand din excel Data Analysis si apoi Correlation.