Misión del programa: “La formación de profesionales químicos que lideren el desarrollo, potencien la

investigación y apoyen el aprovechamiento de los recursos naturales del entorno mediante procesos científicos
y tecnológicos”.

UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS, Escuela de Ciencias Químicas
Laboratorio de Bioquímica I

Compilador: Angélica María García T.

12. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (amilasa salival)

Material a traer por parte del estudiante: guantes, gafas de protección, tapabocas, cinta o
marcador para rotular, toalla (2, una para uso personal y otra para el trabajo práctico), jabón
personal y jabón para lavado de material de vidrio, gotero.

INTRODUCCION
De todas las funciones de las proteínas, la catálisis es tal vez la más importante, en ausencia de
catálisis todas las reacciones de los sistemas biológicos se llevarían a cabo con lentitud. Las enzimas
son los catalizadores más eficientes conocidos, pueden aumentar la velocidad de una reacción en un
factor de hasta 1020 respecto a las reacciones no catalizadas. Las enzimas se caracterizan por una
alta especificidad funcionando con base en el reconocimiento molecular, incluso al grado de poder
distinguir entre los esteroisómeros de un compuesto dado ya que poseen sitios activos específicos
que se unen al sustrato.

El estudio de la velocidad y mecanismo de las reacciones enzimáticas se lleva a cabo por análisis de
Cinética Enzimática. Existen factores que modifican la velocidad tales como: la concentración de la
enzima, la concentración del sustrato, la presencia y concentración de coenzimas, presencia y
concentración de inhibidores, el pH y la temperatura durante la reacción. Para evaluar cada factor,
es necesario mantener una sola variable y analizar la velocidad de reacción inicial (cuando no se
haya alcanzado más del 10% de la reacción enzimática).

Una de las primeras enzimas relacionadas con el proceso digestivo es la α-amilasa salival, la cual
degrada almidones formando dextrinas y carbohidratos más sencillos. El contenido de la enzima en
la saliva puede encontrarse en concentraciones entre 0-3 mg/mL y al ser catalogada como una α-
endoglicosidasa (cataliza la hidrolisis de enlaces glicosídicos) tiene como sustrato natural al almidón.
CONSULTA PREVIA A LA PRÁCTICA
1. Qué es sitio catalítico de una enzima?, Qué factores que afectan la actividad enzimática?
2. Cuáles son los componentes de la saliva?, Qué enzimas y cuál es la función de las enzimas
salivares?
3. Cómo está formado químicamente el Reactivo de lugol y qué clase de carbohidratos identifica?
4. Cuáles son los componentes del almidón?, Qué le sucede al almidón al ser tratado con la amilasa
(incluir reacción)

MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales: Gradilla, 12 tubos de ensayo, 2 pipetas de 5 mL, 2 vasos de precipitados de 100, 250 y
400 mL, pipeteador, embudo de vidrio, termómetro, papel filtro y papel indicador de pH, estufa o
plancha de calentamiento, pH-metro.
Reactivos: almidón, lugol, solución de KCl, ácido tricloroacético (TCA), fluoruro de sodio, slns buffer
pH 4.9 (acetato de sodio), pH 7.0 (fosfato) y pH 8.9 (cloruro de amonio), agua destilada, hielo.

PROCEDIMIENTO
 Preparar una solución de almidón al 1%.
 Enjuáguese la boca varias veces con agua, estimule la producción de saliva y recójala en un
vaso limpio (aprox. 5 mL), adicione 20 mL de agua destilada, mezcle bien y filtre la solución.
Identifique este tubo como solución de enzima.
 Mantenga la solución de enzima y los tubos de reacción en un baño maría a de 37 °C.

1. DETERMINACION DEL pH OPTIMO DE LA AMILASA SALIVAL

Preparar el siguiente set de tubos:

Muestra Buffer PH= 4.9 Buffer PH= 7.0 Buffer PH=8.9 KCl Almidón Agua dest. Enzima
Tubo No. mL mL mL mL 1% (mL) mL mL
1 0.2 0.4 1.0 1.0 1.0
2 0.2 0.4 1.0 1.0 1.0
3 0.2 0.4 1.0 1.0 1.0

 Agitar cada tubo antes de adicionar la enzima

 Adicione la enzima secuencialmente cada 30 segundos, deje reaccionar por 4 minutos y
adicione luego 0.3 mL de TCA (ácido tricloroacético) para detener la reacción. Posteriormente
adicione 3 gotas de lugol.
 Realice el respectivo análisis para cada tubo e identifique el valor del pH óptimo de la enzima.

2. CINETICA ENZIMATICA CON RESPECTO A LA CONCENTRACION DE SUSTRATO

Preparar el siguiente set de tubos:

Muestra Buffer PH=7.0 KCl Sustrato Agua Dest. Enzima
mL mL mL mL mL

AGITACIÓN
Tubo No.
1 0.5 1.0 0.5 2.0 1.0
2 0.5 1.0 1.0 1.5 1.0
3 0.5 1.0 1.5 1.0 1.0
4 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0
5 0.5 1.0 2.5 0 1.0
 Agitar bien cada tubo antes de adicionar la enzima.
 Agregar la enzima, agitar y dejar un intervalo de 30 segundos entre cada tubo.
 Dejar los tubos 5 minutos y adicionar 0.3 mL de TCA para detener la reacción.
Posteriormente adicionar 5 gotas de lugol a cada tubo.
 Realice el respectivo análisis a cada tubo. Explique cuál es la función del lugol durante el
procedimiento.

3. CINETICA ENZIMATICA CON RESPECTO A LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA

Preparar el siguiente set de tubos:

Muestra Buffer KCl Almidón Agua Enzima
PH= 7 mL mL Destilada mL
AGITACIÓN

Tubo No. mL mL
1 0.5 1.0 1.0 1.5 0.5
2 0.5 1.0 1.0 1.0 1.0
3 0.5 1.0 1.0 0.5 1.5
4 0.5 1.0 1.0 0.0 2.0
 Agitar bien cada tubo antes de adicionar la enzima.
 Agregar la enzima, agitar y dejar un intervalo de 30 segundos entre cada tubo.
 Dejar los tubos 5 minutos y adicionar ácido tricloroacético (TCA) para detener la reacción y
luego adicionar 5 gotas de lugol a cada tubo.
 Realice el respectivo análisis a cada tubo. Explique cuál es la función del lugol durante el
procedimiento.
 A qué se debe las diferentes coloraciones cuando se le adiciona el lugol

4. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Preparar el siguiente set de tubos:
 Muestra Buffer (mL),pH= 7.0 KCl (mL) Almidón (mL) Agua Destilada (mL)
Tubo
1 0.2 0.4 1.0 1.0
2 0.2 0.4 1.0 1.0
3 0.2 0.4 1.0 1.0
 Coloque el tubo 1 en un baño de hielo por 5 minutos, el tubo 2, dejarlo a temperatura
ambiente y el tubo 3, colocarlo en un baño de agua a ebullición por 5 minutos.
 Transcurridos estos 5 minutos y sin sacar los tubos de los respectivos baños de incubación,
adicione a cada tubo 0.5 mL de la solución de enzima (agite muy bien y suavemente) y
controle que el tiempo de reacción sea de 4 minutos, adicione luego el TCA.
 Adicione a cada tubo 5 gotas de lugol
 Realice el respectivo análisis a cada tubo. Explique cuál es la función del lugol durante el
procedimiento.

5. IDENTIFICACION DEL COFACTOR Y DE UN INHIBIDOR DE LA ENZIMA SALIVAL

Preparar el siguiente set de tubos:

Muestra Buffer (mL), Sln A Sln B Sln C Almidón Agua Enzima

Tubo pH 7.0 (mL) (mL) (mL) (mL) (mL) (mL)
1 0.5 0.2 0.5 1.0 0.5
2 0.5 0.2 0.5 1.0 0.5
3 0.5 0.2 0.5 1.0 0.5
 Recuerde adicionar la enzima en forma secuencial para controlar el tiempo y detener la
reacción con el TCA a los 5 minutos exactos de haberse iniciado la misma.
 Adicione a cada tubo 5 gotas de lugol.
 Realice el respectivo análisis a cada tubo. Explique cuál es la función del lugol durante el
procedimiento.
 Cuál es la solución que contiene la sustancia inhibidora
 Qué solución contiene los iones cloruros

PREGUNTAS A INCLUIR DENTRO DEL RESPECTIVO INFORME

En esta práctica por qué se utiliza la saliva?, Qué factores estudiados afectaron la actividad
enzimática. Por qué?, Cuál es el pH óptimo de la enzima, de los reactivos empleados, cual fue la
sustancia activadora e inhibidora de la amilasa salival, por qué?
RESULTADOS
Presente sus resultados de la forma más clara posible apoyándose en el uso de tablas, gráficos, etc.
Responda las preguntas planteadas. NO OLVIDE ENTREGAR COPIA DE LA HOJA DE RESULTADOS AL
PROFESOR.
BIBLIOGRAFÍA
La presente práctica fue diseñada tomando como pauta base:
VARIOS AUTORES. 2010. Prácticas de Laboratorio de Bioquímica para Ingeniería Agronómica. Universidad Pedagógica y Tecnológica de
Colombia, Facultad de Ciencias, escuela de Química, Tunja, Colombia.
MIGUEZ, J.B.1997. Prácticas de bioquímica. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Facultad de Ciencias, escuela de
Química, Tunja, Colombia.
VARIOS AUTORES. 2010. Prácticas de Laboratorio de Bioquímica. Universidad Jorge Tadeo Lozano.
MIYARES CALAS, M. Cuaderno de Trabajos Prácticos de Bioquímica I. FUD.
Textos de apoyo:
LEHNINGER, A., NELSON; D.; COX, M. 2004. Lehninger Principles of Biochemistry. Macmillan Higher Education, 4a ed.
VOET, D., VOET, J. 2002. Biochemistry. Wiley & Sons. 2ª ed. Canada.
BOHINSKI, R.C. 1991. Bioquímica. Addison-Wesley-Longman, 5ª ed. México D.F. México.
CAMPBELL, M. y FARREL, S. 2004. Bioquímica. Editorial Thomson. México.
PACHECO, D. 2005. Bioquímica Medica. Editorial Limusa. México.
MORRISON AND BOYD. Química Orgánica. Editorial Fondo Educativo Internamericano.
CERRETTI, H. y ZALTS, A. Experimentos en Contexto. Química . Manual de Laboratorio. Editorial Pearson. Argentina. 2000.

Visión del programa: “El programa de química de la UPTC para el año 2019 se proyecta en el ámbito nacional como uno de los líderes
en la gestión y desarrollo de procesos de investigación, apropiación, adaptación e innovación de ciencia y tecnología en química”.
UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA
PROGRAMA DE QUÍMICA
LABORATORIO BIOQUÍMICA I
HOJA DE RESULTADOS

12. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA α-AMILASA

Nombres:___________________________________________________________________

1. pH óptimo de la actividad enzimática α-amilasa

Tubo Observaciones
1

3
2. Efecto concentración del sustrato

Tubo Observaciones
1

5
3. Efecto concentración de la enzima

Tubo Observaciones
1

4
4. Efecto de la temperatura

Tubo Observaciones
1

3
5. Identificación de un cofactor y un inhibidor

Tubo Observaciones
1
2
3
6. Observaciones adicionales: