Objetivos

 Se estudiara la hidrólisis de la sacarosa mediante levadura de

panificación (Saccharomyces cereviseae)
 Aprovechar las propiedades de los polímetros naturales para construir
sistemas de aplicaciones múltiples, con proyección industrial.
 Introducción a la bioquímica de azucares.
 Manejo de conceptos de cinética enzimática

Introducción.
Las enzimas son catalizadores biológicos, de naturaleza proteica, altamente
específicos. Su origen biológico es responsable de algunas de sus ventajas y
limitaciones con respecto a los catalizadores químicos. Dos de las
características que han limitado la aplicación de las enzimas en diversos
procesos son: las condiciones de trabajo bajo las cuales son estables y su
solubilidad en agua, esto último las hace difíciles de separar del medio para
reutilizarlas.
La inmovilización enzimática se puede definir como el confinamiento de la
enzima en un soporte, lo cual limita su movimiento, pero conserva su poder
catalítico. La inmovilización además aumenta la estabilidad de la enzima y hace
posible su reutilización al mantenerla en forma insoluble. No obstante, la
inmovilización también presenta algunos inconvenientes como la alteración de
la conformación de la enzima, pérdida de actividad, heterogeneidad en el
sistema soporte-enzima (ya que habrá enzimas unidas al soporte en mayor o
menor grado), y el incremento en el costo de la enzima inmovilizada.

La invertasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de la sacarosa en D-

Fructosa y D-Glucosa. En la levadura común, dicha enzima se encuentra como
un complejo proteico localizado en el espacio periplasmático y su función es
hidrolizar la sacarosa proveniente del medio ya que no existe transportadores
específicos para la sacarosa en la membrana plasmática celular. Se utiliza
ampliamente en industria de edulcorantes y confitería. La hidrólisis parcial y
total de la sacarosa presenta las siguientes ventajas: mayor higroscopicidad,
menor actividad acuosa y menor poder edulcorante ya que la mezcla fructosa-
glucosa obtenida es sustanciablemente más dulce en comparación a la
sacarosa original. Estas propiedades del hidrolizado se aprovechan en
confitería para la preparación de bombones y centros líquidos de caramelos.
En el presente trabajo de laboratorio la inmovilización enzimática se realiza en
una matriz polimérica, alginato de Ca 2+ . Esto se logra suspendiendo las
células en una solución de alginato de Na+, alcanzándose la gelificacion
mediante el remplazo de los iones Na+ por los iones Ca2+. Las bolitas así
formadas se emplean para hidrolizar una solución de sacarosa. Para ello se
preparo (auxiliares de laboratorio) un dispositivo en el cual las bolitas son
retenidas en una columna a través de la cual se hace circular una solución de
sacarosa.

Metodología

Parte A- Inmovilización de Saccharomyces cerevisiae por oclusión en

alginato de calcio

El alginato es un componente de la pared celular de las algas pardas, está

formado por dos tipos de unidades monoméricas: el acido β(1-4) D-manuronico
y el acido α(1,4)-L-guluronico. Cuando el alginato es expuesto a la presencia
de iones calcio se forma una red de entrecruzamiento con los polímeros del
ácido gulurónico, que permite la inmovilización de células. La inmovilización de
microorganismos en alginato de calcio es el método más usado, debido a que
en su preparación no se requieren condiciones de reacción extremas, es de
bajo costo y de baja toxicidad.

Parte B- Medición de actividad invertasa: hidrólisis enzimática de

sacarosa
 Se colocaron las bolitas de levadura inmovilizadas en un jeringa hasta
alcanzar un volumen aproximado de 5 mL. Luego se pesaron las bolitas
de levadura inmovilizada. Se agregó un determinado volumen de
solución buffer hasta tapar las bolitas. Luego con una pipeta automática
de volumen variable se agrega 100 μL de una solución de sacarosa
dejando a cada columna un determinado tiempo. Luego se recogió un
volumen eluido de cada una de las columnas. Después se procedió a
hacer una dilución 1/10,

Procedimiento
Se estabilizan 5 jeringas llenas con levadura inmovilizada y 0,1 ml de sacarosa
20% m/m junto también a una solución buffer. Se deja incubar las bolitas 2, 5,
10,15 y 20 minutos. Luego del tiempo de incubación, se colecta 2,3 ml de la
columna. Para reconocer la actividad de la invertasa, el colectado fue diluido en
una proporción de 1 en 10.
El método de neocuproina fue la técnica para medir la reducción. Esta técnica
cuantitativa se basa en la reducción de Cu (II) a Cu (I), este último ión forma un
complejo rápidamente, la 2-9 dimetil 1-10 fenantrolina. Este complejo es
naranja y alcanza un pico de absorción a 450 nm.
Resultados
El instrumento que se utilizó en esta práctica fue el espectrofotómetro. Este
instrumento consta de una fuente de luz “blanca” caracterizada por un espectro
de emisión continuo en un intervalo amplio de longitudes de onda y de un
monocromador que actúa como filtro óptico transmitiendo un haz de luz de
longitud de onda fija λ e intensidad I0. Este haz de luz penetra en la cubeta de
análisis donde se encuentra la muestra. Un detector sensible a la luz mide la
intensidad del haz a la salida. La intensidad del haz de luz se va atenuando a
medida que atraviesa la cubeta debido a la absorción de las moléculas de la
muestra. El ritmo de absorción depende de la intensidad inicial de luz y de la
concentración de moléculas.

Fuente:
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/quimbiotec/FQpractica4.pdf

En el espectrofotómetro se colocaron todos los tubos (incluyendo a los

duplicados) y se midió la absorbancia de cada muestra:

TUBOS CONCENTRACCIÓN ABSORBANCIA ABSORBANCIA PROMEDIO

1 0,00 0,144 0,169 0,157
2 0,05 0,192 0,211 0,202
3 0,10 0,243 0,23 0,237
4 0,15 0,309 0,299 0,304
5 0,20 0,346 0,291 0,319
6 0,25 0,544 0,65 0,597
7 0,30 0,67 0,693 0,682
8 0,35 0,664 0,732 0,698
9 0,40 0,887 0,777 0,832
10 0,45 0,854 0,884 0,869
11 0,50 0,954 0,961 0,958

Tabla1. Valores de absorbancia determinados y promedio.

Se observa en la grafica 1 que los datos experimentales de concentración
10µgr/ ml , 15 µgr/ ml y 20 µgr/ ml no siguen la tendencia lineal de los demas
datos, por lo que se decide no tomarlos en cuenta para realizar la curva de
calibración para el análisis cuantitivo de concentración de glucosa.

Grafica 2. Curva de calibración corregida en la que se omiten los datos

experimentales de 10 µgr/ ml , 15 µgr/ ml y 20 µgr/ ml, por presentar un
valor de absorbancia lejano a la línea de tendencia.
Cálculo de la concentración de glucosa, método curva de calibración.

Absorbancia de muestra de glucosa de 0 µgr/ml : 0,157

y  1,6395 x  0,153

0,157  0,153
x  2,44  10 03
1,6395

Concentración de glucosa = 0,0024 µgr/ ml

0,0024glu cos a
gr ( glu cos a)   10ml  0,8gr...glu cos a
0,03ml

0,8 ..gr..glu cos a

 ..gr..glu cos a   2,3ml  1,84 ..gr..glu cos a
ml

0,8 ..gr..glu cos a

 ..gr..glu cos a   1,4ml  1,12 ..gr..glu cos a
ml

0,8..gr..glu cos a
..gr..glu cos a   1,8ml  1,44 ..gr..glu cos a
ml

0,8 ..gr..glu cos a

..gr..glu cos a   2,1ml  1,68 ..gr..glu cos a
ml

0,8 ..gr..glu cos a

..gr..glu cos a   1,9ml  1,52 ..gr..glu cos a
ml

tiempo (minutos) concentración µgr/ml

2 1,52
5 1,68
10 1,44
15 1,12
20 1,84
Actividad enzimatica

Tiempo (minutos) Volumen Absorbancia Absorbancia

colectado (ml)
2 1,9 0,309 0,268
5 2,1 0,244 0,251
10 1,8 0,296 0,297
15 1,4 0,274 0,293
20 2,3 0,285 0,805
Blanco 1,135 1,041
En la gráfica se observa la tendencia absorbancia en los diferentes tiempos
demuestra que la enzima invertasa está ejerciendo su función como catalizador
de la hidrólisis de la sacarosa con la producción de glucosa y fructosa, y a
mayor cantidad de glucosa producida la absorbancia y por consiguiente la
concentración de glucosa en la muestra será mayor.

Adicionalmente se observa que la gráfica obtenida es de tipo exponencial, en

donde en la primera fase la actividad de la enzima crece rápidamente, luego se
observa que desciende a los 2 minutos para luego seguir hasta una tendencia
estacionaria, en donde la actividad enzimática disminuye levemente.