Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Químicas

Carrera: Química y Farmacia
Prácticas de Laboratorio
PRACTICA Método Cromogénico y E. Coli O157: H7
#7
Grupo 4B Nombre: Rodriguez Cedeño Carlos A. Docente: Dra. Celeste Carrillo Tomalá.
Microbiología II Fecha: 22/02/2019
Objetivos de la práctica de laboratorio
1. Conocer que es un medio de cultivo Cromogénico
2. Preparar un medio Cromogénico
3. Identificar como se puede encontrar la E. coli en un medio Cromogénico
4. Conocer sobre E. coli O157 H:7
Fundamento
Medios de cultivo cromogénicos
La incorporación de más de un cromógeno en un medio puede mejorar sus propiedades de especificidad y
diferenciales. Un medio que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indoxil β-D-glucopiranosida (X-Gluc) y 6-cloro-3-
indoxil β-D-galactopiranosida (red-Gal) es útil para la diferenciación de potenciales patógenos del tracto
urinario.

Los organismos que expresan β-galactosidasa escinden el sustrato red-Gal para producir colonias rosas/rojas
(por ejemplo E. coli), mientras que la expresión de β-glucosidasa resulta en una escisión del X-Gluc para
formar colonias verdes (por ejemplo Enterococcus spp.). La expresión de ambas enzimas resulta en colonias
de un azul-violeta oscuro y es indicativo de Klebisiella, Enterobacter o Serratia spp. (grupo KES).
Staphylococci (con la principal excepción de S. saprophyticus) y streptococci no producen ninguna de esas
enzimas y crecen como colonias blancas o incoloras. La diferenciación de estos géneros se establece
rápidamente por una prueba de catalasa (los estafilococos son positivos para esta enzima, y los estreptococos
negativos). Proteus spp. puede ser diferenciado por la inclusión of triptófano, formando colonias color canela
debido a la reacción del triptófano con la deaminasa (TDA).
Esta tecnología también se aplicó a la diferenciación de Candida spp. con el uso de cromógenos de indoxil
para detectar la presencia de hexosaminidasa y fosfatasa alcalina.

La solubilidad de los sustratos iniciales y la insolubilidad de los productos finales son características que
hacen al grupo indoxil de cromóferos particularmente útiles para su uso en medios de cultivo sólidos. Esto es
debido a que la coloración está restringida a la masa celular, permitiendo a las colonias de especies que
poseen la hidrolasa pertinente, ser fácilmente reconocibles en un cultivo mixto. Un inconveniente de los
cromógenos de indoxyl es su dependencia de la oxidación, haciéndolos inútiles para la detección de bacterias
anaeróbicas. Se han descrito cromógenos alternativos para superar este problema, en particular, los quelantes
de metales (por ejemplo, esculina, 8-hidroxiquinolina, dihidroxiflavonas y alizarina).
Sustratos cromogénicos
Un sustrato cromogénico puede ser definido como “un compuesto o sustancia que contiene un grupo
formador de color”. Los sustratos cromogénicos comercialmente sintetizados (o cromógenos) están
disponibles para la detección de muchas enzimas hidrolasas, incluyendo glicosidasas, peptidasas, fosfatasas y
esterasas. Este grupo de enzimas incluye varios productos génicos específicos para cierto género (o en
algunos casos especie) de bacterias y su detección a menudo puede ser una ayuda invaluable para la
diferenciación e identificación. Esto puede reducir significativamente la cantidad de trabajo requerido para
confirmar la identidad y el significado de la colonia sospechada.
Las glicosidasas exhiben especificidad no solo por el tipo de azúcar, sino por su conformación estérica (D- o
L-) y la conformación del enlace glucosídico (α- o β-)2. Por ejemplo los cromógenos β-D-glucósidos son
específicos para detectar actividad de β-D-glucosidasa y su utilidad en la diferenciación bacteriana está bien
documentada.

Marco teórico
Beneficios de los medios cromogénicos
Un amplio rango de medios cromogénicos están disponibles comercialmente para la detección de muchos
organismos de significación en microbiología de agua, alimentos, clínica e industrial (por ejemplo, Listeria,
Salmonella, Bacillus cereus, clostridios, Candida, enterococos, estafilococos, E. coli y coliformes). Los
principales beneficios de estos medios sobre los convencionales son su sensibilidad y especificidad
mejoradas. En algunos casos la sensibilidad mejorada puede conducir a una reducción del tiempo de
incubación (por ejemplo, agar cromogénicos para detección de MRSA), permitiendo un tiempo más rápido
del reporte de resultados. Estas propiedades también los hace ideales como medios de cribado de alto
volumen debido a la reducción resultante en las pruebas confirmatorias requeridas. Desde la perspectiva de
un encargado de laboratorio, los beneficios clave de los medios cromogénicos pueden ser resumidos de la
siguiente manera:
Facilidad de uso e interpretación:
Entrenamiento requerido mínimo.
Permite un uso más apropiado del personal experimentado.
Rendimiento mejorado:
Más confianza en los resultados comparado con los medios convencionales.
Resultados más rápidos.
Volumen reducido del trabajo de seguimiento.
Rentabilidad:
Pruebas confirmatorias reducidas, evitan costo extra de medios.
Significativamente más barato que un PCR u otros métodos moleculares automáticos.
Aunque las técnicas moleculares están ganando reconocimiento y credibilidad rápidamente para ciertas
aplicaciones, debido a que son caras, generalmente son rentables para una gran cantidad de muestras o
cuando la detección no es posible por maneras convencionales. Estas técnicas no permiten cultivos
subsecuentes del organismo. Esto no es un problema necesariamente en ciertas circunstancias, pero puede ser
una desventaja importante, especialmente en algunos escenarios, donde se requiere una caracterización
fenotípica posterior (por ejemplo, patrones de sensibilidad antimicrobiana). La mayor ventaja de los sistemas
moleculares es un menor tiempo en los resultados. El impacto de esto en términos reales puede ser medido
solo por la eficiencia en el sistema de reporte por sí mismo y en algunos casos puede no haber ningún
beneficio con respecto al tiempo.
Sobre todo, los medios cromogénicos representan una manera rentable de conseguir una sensibilidad y
especificidad mejorada de resultados sin el costo de técnicas moleculares automatizadas. Otras aplicaciones
de tecnología cromogénica se están encontrando todo el tiempo y están limitadas solo por la búsqueda de más
sustratos diferencialmente útiles.

Medios de Cultivo Cromogénicos de CHROMagar

CHROMagar ofrece soluciones de medios de cultivo cromogénicos innovadores, diseñados para mejorar y
simplificar las técnicas de cultivo tradicionales. CHROMagar suministra la gama más amplia de medios
cromogénicos de cultivo disponibles, que abarcan aplicaciones de:
• Bacteriología clínica
• Microbiología industrial
• Control de calidad para las industrias de alimentos y bebidas
• Pruebas de agua
• Monitoreo ambiental
Estos medios permiten una detección rápida, sencilla y altamente confiable de patógenos clínicos y los
transmitidos por alimentos y bebidas.

Para la detección y enumeración de Enterobacterias.

«Las Enterobacterias y las bacterias coliformes de esta familia representan dos de los grupos más comunes de
indicadores utilizados por la industria alimentaria. En algunos países, en función de los requisitos normativos,
la industria alimentaria ha avanzado hacia la detección de Enterobacterias.» ILSI Europe (Instituto
Internacional de Ciencias de la Vida) La ISO 21528 especifica un método para la enumeración de
Enterobacterias, aplicable a productos destinados al consumo humano, la alimentación de animales y
muestras ambientales utilizando VRBG como medio de cultivo. CHROMagarTM Enterobacteria permite la
detección y diferenciación de E. coli y otras Enterobacterias por el color
Rendimiento del medio.

FÁCIL DIFERENCIACIÓN ENTRE E. COLI Y OTRAS ENTEROBACTERIAS

Al contrario que con VRBG, con CHROMagarTM Enterobacteria se puede diferenciar facilmente E. coli del
resto de Enterobacterias por el color.
FÁCIL LECTURA
Las intensas colonias de color sobre un fondo de agar transparente facilitan la lectura, en comparación con
VRBG, donde el fondo ahumado permite poco contraste.

E. coli

Escherichia coli (E. coli) es una bacteria que se encuentra normalmente en el intestino del ser humano y de
los animales de sangre caliente. La mayoría de las cepas de E. coli son inofensivas. Sin embargo, algunas de
ellas, como E. coli productora de toxina Shiga, pueden causar graves enfermedades a través de los alimentos.
La bacteria se transmite al hombre principalmente por el consumo de alimentos contaminados, como
productos de carne picada cruda o poco cocida, leche cruda, y hortalizas y semillas germinadas crudas
contaminadas.
E. coli productora de toxina Shiga produce toxinas conocidas como toxinas Shiga por su semejanza con las
toxinas producidas por Shigella dysenteriae. E. coli productora de toxina Shiga puede crecer a temperaturas
que oscilan entre 7 °C y 50 °C, con una temperatura óptima de 37 ºC. Algunas pueden proliferar en alimentos
ácidos, hasta a un pH de 4,4, y en alimentos con una actividad de agua (aW) mínima de 0,95.
E. coli productora de toxina Shiga se destruye cociendo los alimentos hasta que todas las partes alcancen una
temperatura de 70 °C o más. E. coli O157: H7 es el serotipo de E. coli productora de toxina Shiga más
importante por su impacto en la salud pública, pero hay también otros serotipos frecuentemente implicados
en brotes y casos esporádicos.
La mayor parte de la información disponible sobre E. coli productora de toxina Shiga guarda relación con el
serotipo O157: H7, pues es el más fácil de distinguir bioquímicamente de otras cepas de E. coli. El reservorio
de este patógeno es principalmente el ganado bovino. También se consideran reservorios importantes otros
rumiantes, como ovejas, cabras y ciervos, y se ha detectado la infección en otros mamíferos (como cerdos,
caballos, conejos, perros y gatos) y aves (como pollos y pavos).
E. coli O157: H7 se transmite al hombre principalmente por el consumo de alimentos contaminados, como
productos de carne picada cruda o poco cocida y leche cruda. La contaminación fecal del agua y de otros
alimentos, así como la contaminación cruzada durante la preparación de estos (con carne de vacuno y otros
productos cárnicos, superficies y utensilios de cocina contaminados), también es causa de infecciones.
Ejemplos de alimentos implicados en brotes de E. coli O157: H7 son las hamburguesas poco cocidas, el
salami curado, la sidra fresca no pasteurizada, el yogur y el queso elaborado con leche cruda.
Un número creciente de brotes se asocian al consumo de frutas y verduras (como las coles de Bruselas, las
espinacas, la lechuga, las ensaladas de col y de otro tipo) contaminadas por el contacto con las heces de
animales domésticos o salvajes en algún momento durante su cultivo o manipulación. También se ha aislado
E. coli productora de toxina Shiga en masas de agua (estanques y arroyos), pozos y abrevaderos, y se ha
observado que puede sobrevivir durante meses en el estiércol y en los sedimentos de recipientes de agua. Se
ha informado de casos de transmisión por el agua, tanto por agua de bebida contaminada como por aguas de
recreo.
Los contactos de persona a persona son una forma de transmisión importante por vía oral-fecal. Se ha
informado de un estado de portador asintomático, en el que la persona no muestra signos clínicos de la
enfermedad, pero puede infectar a otros. La excreción de E. coli productora de toxina Shiga dura
aproximadamente una semana o menos en los adultos, pero puede prolongarse más en los niños. Se ha
observado que otro factor de riesgo importante de infección por E. coli productora de toxina Shiga son las
visitas a granjas y otros lugares donde el público en general puede entrar en contacto directo con el ganado.

EPIDEMIOLOGÍA
Hasta ahora, el serotipo O157:H7 ha causado más de 60 brotes de toxiinfecciones alimentarias en los Estados
Unidos. El consumo de hamburguesas y derivados cárnicos poco cocinados y contaminados explica la
mayoría de éstos, aunque también se han descrito brotes producidos por el consumo de leche no higienizada
en este país y en Canadá. La higiene deficiente, junto con la diseminación secundaria por contacto
interpersonal, constituye otra vía de transmisión. En los últimos años, sin embargo, ha habido varios brotes
producidos por el serotipo O157:H7 en los que se ha implicado a ciertos vehículos de infección poco
frecuentes, entre los que se incluyen los alimentos ácidos, frutas, vegetales, yogur y agua.
En el otoño de 1991, se logró realizar el seguimiento de un brote del serotipo O157:H7 que afectó a 23
personas, hasta llegar a implicar en el brote el consumo de sidra recién pisada. Esta sidra, hecha con
manzanas caídas sin lavar, tenía un pH de
3,7-3,9; no fue pasteurizada, ni se le añadieron conservantes. Varios estudios de laboratorio demostraron con
posterioridad que los aislamientos del serotipo O157:H7 pueden tolerar condiciones ácidas y que algunas
cepas persisten en medios que
un pH incluso de 2, o en sidra enfriada (8 ºC) durante 10-31 días. El origen último del brote no pudo ser
inequívocamente establecido, aunque se sospechó que las manzanas caídas estaban contaminadas por
estiércol.
En 1993, coincidiendo con una serie de brotes en restaurantes que se relacionaron con otro alimento ácido,
fue cuando se logró demostrar la capacidad del serotipo O157:H7 de tolerar la acidez. Aunque no se pudo
identificar de forma concluyente la fuente inicial, los estudios epidemiológicos y otros datos apuntaban a la
mayonesa o a salsas similares. Tras este brote, varios estudios confirmaron que, aunque algunos aislamientos
del serotipo O157:H7 no se multiplican en estas condiciones, sí que podían, sin embargo, mantenerse en la
mayonesa comercial hasta 55 días a 5 ºC. De nuevo no se pudo probar con certeza la fuente de contaminación
por el serotipo O157:H7, si bien se sospechó que la manipulación de la mayonesa o la contaminación de la
misma con caldos de carne o productos cárnicos podrá haber sido su origen.
Algunos incidentes recientes demuestran que tanto el agua de consumo como la de uso recreativo pueden
servir como vehículo para la transmisión de las infecciones por el
E. coli O157:H7. En Missouri, en 1989, ocurrió el primer y más importante brote hídrico asociado con este
microorganismo. Aunque de nuevo no se identificó la fuente, se sospechó que el reflujo derivado de la rotura
de una tubería podría haber contaminado el suministro de agua potable. Como la mayoría de
E. coli
Los aislamientos de este serotipo son sensibles a los efectos del cloro. Los ajustes de la cloración en el
suministro de agua durante las reparaciones son, por tanto, decisivos en la prevención de brotes de origen
hídrico.
Reactivos de laboratorio
 H2O destilada
 Medio Cromogénico CHROMagar E. coli
 Agua de peptona
 Alcohol potable
 Muestra carne molida
Materiales de laboratorio
 Beakers
 Cilindros
 Tubos
 Espátulas
 Varillas de vidrio
 Caja petri
Equipos de laboratorio
 Balanza
 Potenciómetro
 Estufas
 Hornilla
Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento

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Resultados obtenidos

En la siembra por agotamiento podemos presenciar el crecimiento bacteriano colonias azules que indican la
presencia de E. coli y de color fucsia o malva de coliformes fecales.
UFC incontables 1:10
En la 1:10 podemos presencian colonias blancas o translucida se tiene una sospecha de que puede ser cepas
de bacterias Gram negativas, pero no se puede especificar a qué género. O también podría ser un medio que
se contamino con hongos y crearon un medio acido lo que inhibió el crecimiento de las E.coli y coliformes
fecales.

UFC incontables 1:1000

En la 1:1000 podemos ver el crecimiento de cepas E. coli, coliformes fecales y Gram negativas en carne
molida el crecimiento de colonias es incontable a pesar de la dilución que se realizo.

aspecto de colonias típicas

• E. Coli azul

• otros (fecal) Coliforme bacteria color de malva

• otros Gram negativa bacteria incolora

Conclusiones
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Recomendaciones
 Seguir las recomendaciones para la elaboración de los medios de cultivos.
 No exceder la temperatura del medio.

Bibliografía
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