UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHOMANN

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

INFORME: DETERMINACION DE PROTEINAS - METODO DE

BRADFORD (DYE BINDING)
NOMBRE: Vanessa Rosario Miranda Ttito
Kevin Aldair Tarqui Chura
CODIGO: 2016-111058
2016-111012
HORARIO: MARTES 11:00 a 13:00 hr
CURSO: ANALISIS INSTRUMENTAL
DOCENTE: ING. GABRIELA BARRIONUEVO
ESCUELA: ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIA

TACNA-PERU
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ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

1. TITULO: DETERMINACION DE PROTEINAS - METODO DE

BRADFORD (DYE BINDING)

2. OBJETIVOS:
Determinar la concentración de proteínas en una muestra de leche por el
método de Bradford.
3. FUNDAMENTO TEORICO:

Metodo Bradford:
Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración
azul entre los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el
colorante Azul Coomassie Absorbe luz a 595 nm. El rango de
determinación de proteína es de 1 a 10 mg/ml (ensayo micro) y de 0.5 a
1,4 mg/mil (ensayo estándar). La intensidad de absorción depende del
contenido de aminoácidos básicos y aromáticos, método por unión de
colorantes. (Bradford,1976)
En condiciones adecuadas los grupos ácidos o básicos de las proteínas
pueden interaccionar con grupos orgánicos de determinados colorantes
para dar lugar a precipitados con un color característico. Para el ensayo
de Bradford se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G-250. Se basa
en la conversión de la forma leuko del colorante (marrón-naranja) a una
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de color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante

interaccionan con los grupos amino de las proteínas.
Dicha reacción se mide por absorbancia a 595 nm y también existe una
relación lineal dentro de determinadas concentraciones de proteínas. Este
método es muy sensible y se puede trabajar en un rango de 20 a 140
microgramos de proteína para el ensayo estándar y de 1 a 50
microgramos para el micro-ensayo.(Biol et al., n.d.)
El método se basa en la unión específica del colorante azul de Coomassie
brillante G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las
proteínas. El CBBG se une a los residuos de las proteínas produciendo
una absorbancia máxima a 595nm mientras que el colorante libre tiene
una absorbancia máxima a 470 nm. A diferencia del método de Lowry
(otra técnica colorimétrica para determinar proteínas) que es muy sensible
a la composición de la solución que acompaña a las proteínas, el método
de Bradford sólo es afectado por algunos detergentes. Una de las
desventajas de este método es que el colorante CBBG se une
fuertemente a las celdas de cuarzo. Por esto se recomienda usar celdas
de vidrio o de polipropileno. Al usar celdas de polipropileno se facilita su
limpieza con un poco de alcohol.(Greaves, 2013)
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4. MATERIALES, METODOS Y PROCEDIMIENTOS

4.1. Materiales:
 Micropipeta 20-200µl
 Micropipeta 100-1000 µl
 Puntillas desechables
 celda de vidrio
 tubos de ensayo 13x100
 espectrofotómetro
 vaso precipitado
4.2. Reactivos:
 Reactivo de Bradford
 Agua desionizada
 Patrón de albumina 1mg/ml
4.3. Muestra:
 leche descremada
4.4. Método:
 Método de Bradford
4.5. Procedimiento:
Se prepara una serie de estándares de concentración creciente a partir de un
patrón de albumina de 1mg/ml añadiendo 0, 20, 30, 40, 50, 60 y 80 µl para un
volumen total de 300µl con agua.

Procedimiento del metodo:

1. Se harán 3 dimensiones crecientes de la muestra añadiendo 20, 40 y 60µl

a un volumen total de 300 µl con agua.
2. Se hace una dilución de 1:20 por la alta cantidad de proteínas que
contiene.
3. Se agrega 3 ml del reactivo de Bradford tanto a la muestra como a los
estándares y se agitara
4. Realizar la calibración del espectrofotómetro, con 595nm de longitud de
onda ajustando a 0 la absorbancia usando el agua destilada.
5. Se realiza la lectura de los estándares y las muestras en el
espectrofotómetro.
6. Se dibuja una gráfica de proteínas: concentración de albúmina contra la
absorbancia obtenida a una longitud de onda de 595 nm.
7. Finalmente obtener las concentraciones de proteína.
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5. CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Cálculos y Resultados:
Absorbancia de los estándares:

[albumina] en
Absorbancia
µg/mL
0 0.874
66.7 1.065
100 1.165
133.3 1.2
166.7 1.238
200 1.385
266.6 2.152

Fuente: Elaboración propia (2018)

Tras tener un R² = 0.8062 el cual no es favorable se elimina el ultimo punto

para corregir la ecuación.

[albumina] en
Absorbancia
µg/mL
0 0.874
66.7 1.065
100 1.165
133.3 1.2
166.7 1.238
200 1.385
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Curva patron
1.6 y = 0.0024x + 0.8923
1.4 R² = 0.9687
Absorbancia 1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracion µg/mL

Fuente: Elaboración propia (2018)

Luego de corregir la ecuación procedemos a encontrar las concentraciones

por formula en el programa de Excel o mediante la formula encontrada.

Concentracion en
Muestra Dilusiones en µl Absorbancia
µg/mL
Leche 20 1.129 100.6469776
descremada 40 1.375 201.6486839
Primera disolución:
µl 300µl 20 µl
100.6469 × × = 30194.07
ml 20µl 1 mL
µl 1𝑔𝑟 𝑔𝑟
30194.07 × = 0.030194
mL 1000000µg 𝑚𝐿
Segunda disolución:
µl 300µl 20 µl
201.6487 × × = 30247.305
ml 40µl 1 mL
µl 1𝑔𝑟 𝑔𝑟
30247.305 × = 0.030247
mL 1000000µg 𝑚𝐿
5.2. Discusión:
𝑔𝑟 𝑔𝑟
0.030194 × 100 𝑚𝐿 = 3.0194
𝑚𝐿 100𝑚𝐿
𝑔𝑟 𝑔𝑟
0.030247 × 100 𝑚𝐿 = 3.0247
𝑚𝐿 100𝑚𝐿
𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 3.02205 gr en 100 mL.

Se obtuvo como resultado la concentración de proteínas en la leche

descremada de 3.02205 gr en 100 ml.
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6. CONCLUSIONES:
 El análisis de regresión lineal revelo una alta correlación al relacional el
peso de la muestra y la cantidad de proteína.
 Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-
naranja) a una de color intensamente azul cuando los grupos aniónicos
del colorante interaccionan con los grupos amino de las proteínas.
 La reacción en el metodo de Brandford se mide por absorbancia a 595
nm y también existe una relación lineal dentro de determinadas
concentraciones de proteínas.
 Interfieren en el ensayo detergentes y las soluciones alcalinas.
 Este método es muy rápido, barato y sensible y se puede trabajar en un
rango de 1 a 25 microgramos para un volumen de 1 ml.

7. BIBLIOGRAFIA:

Biol, M., Laboratorio, G. T. D. E., Prote, D. E., Docentes, N. A. S., Maugeri, D., &
Iribarren, P. (n.d.). QUÍMICA BIOLÓGICA TRABAJO DE LABORATORIO No 1:
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS DOCENTES: Dante Maugeri y Paula
Iribarren Introducción, 1–9. Retrieved from
http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/Qui
micaBiol/1489768358.pdf

Bradford, M.M. (1976) Analytical Biochem. 72, 248-254.

Greaves, N. (2013). Facultad de Química Departamento de Bioquímica Material de

apoyo para los estudiantes del curso Bioquímica experimental ( 0141 ) Elaborado
por : Dra . Sobeida Sánchez Nieto Editora : Dra . Nahieli Greaves Fernández
Semestre 2013-1, (0141), 0–43.
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8. ANEXOS:

Ilustración 1Preparacion de muestra

Ilustración 2 Adición del reactivo de Brandford

Ilustración 3 Lectura de absorbancias