UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI

MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREŞTI

FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI

METODE DE SEPARARE, IDENTIFICARE ȘI CUANTIFICARE A

CAROTENOIDELOR DE ORIGINE VEGETALĂ

Specializarea: Master CEAEHK

Anul: II
Semestrul: I

Masterand:
Denisa RĂGUȘITU (OPRESCU)

Bucureşti
2019
 Cuprins

INTRODUCERE.............................................................................................................................3
CAPITOLUL I: Stadiul actual al cunoștiințelor în domeniul carotenoidelor..................................4

1.1.Structura carotenoidelor.............................................................................................................4
1.2.Clasificarea carotenoidelor........................................................................................................5
1.3.Metode de separare a carotenoidelor din plante........................................................................6
1.4.Metode de extracţie. Generalităţi privind metodele generale de extracţie.................................7
1.4.1. Metode de extracţie a carotenoidelor..................................................................................8
1.4.1.1.Extracţia din ţesuturile plantelor superioare........................................................................8
1.4.1.2.Extracţia din alge.................................................................................................................9
1.5. Cromatografia........................................................................................................................10
1.6.Metode de separare a carotenoidelor.......................................................................................11
1.6.1. Separarea prin repartiţia lichid-lichid................................................................................12
1.6.2. Separarea prin metoda distribuţiei contracurent................................................................12
1.6.3. Separea prin metode cromatografice.................................................................................13
CONCLUZII..................................................................................................................................16
BIBLIOGRAFIE............................................................................................................................17

2
 Introducere

Denumirea de carotenoide provine de la cuvântul carotte (fr.) sau carrot(eng.) care

înseamnă morcov.
Carotenoidele sunt pigmenți galbeni, roșii sau portocalii care sunt răspândiţi atât în
regnul vegetal cât și în cel animal. Ele însoţesc clorofila verde a frunzelor şi ierburilor regnului
vegetal şi sunt prezenţi în multe flori, fructe, seminţe sau rădăcini. Sunt sintetizate numai în
organismul vegetal iar în organismul animal sunt introduse odată cu hrană.
Se cunosc aproximativ 600 carotenoizi, dintre care cel mai răspândit este β-carotenul,
pigmentul de culoare portocalie al morcovilor (Daucus Carota). Foarte răspândiţi sunt α- şi γ-
carotenul, criptoxantina, zeaxantina, licopenul, lutina.
Carotina din morcov (Daucus carota) a fost izolată în stare cristalizată de Wackenroder în
1831 iar Berzelius a studiat colorantul galben din frunzele tomnatice în 1937 dar Willstaetter a
observat că acest colorant este întotdeuna însoțit de o hidrocarbură carotina C40H56 și de un diol
înrudit cu aceasta, xantofila C40H56O2.
După ce s-a constatat că există o înrudire între carotenoide și vitamina A în 1928 studiul
carotenoidelor a fost continuat de P. Karrer, R. Kuhn și L. Zechmeister ducând în final la
izolarea, stabilirea structurii și realizarea sintezelor principalelor carotenoide.

3
 CAPITOLUL I
Stadiul actual al cunoștiințelor în domeniul carotenoidelor

1.1. Structura carotenoidelor

Cei mai importanți precursori naturali ai vitaminelor A sunt: α, β și γ carotenii, iar dintre
carotenoizi se cunosc cel puțin șapte reprezentanți care pot fi grupați în categoria provitaminelor
A: criptoxantina, afanina, mixoxantina, echinenona, leprona și hipoxantina.
Majoritatea celor 80 de carotenoide extrase din plante conțin 40 de atomi de carbon doar
câteva au molecule mai mici, fiind probabil produși de degradare oxidativă ai carotenoidelor.
Numărul mare de duble legături conjugate le conferă o culoare specifică care variază de
la galben la portocaliu și de la roșu la violet. Pigmenții prezenți în tomate și în morcovi datorită
prezenței în molecula lor a dublelor legături conjugate sunt colorați în roșu.
Carotenoizii care conțin în molecula lor oxigen (xantofilele) au culoare galbenă.
Prezența dublelor legături în molecula carotenoidelor determină o izomerie cis-trans ceea
ce determină prezența a numeroși izomeri geometrici dar majoritatea carotenoidelor prezintă o
configurație trans. Lanțul carbonic este constituit din opt unități izoprenice conferindu-le
carotenoizilor solubilitatea în grăsimi. De aceea, acestea sunt numite și substanțe lipocrome.
Toate carotenoidele absorb lumina în regiunea albastră și ultravioletă a spectrului.
Carotenoidele sunt molecule hidrofobice cu solubilitate mică, sau chiar deloc, în apă. Ele
sunt astfel de așteptat să fie restricționate de zonele hidrofobice în celulă, precum interiorul
membranelor, exceptând cazul în care în asociație cu proteine sunt prezente într-un mediu apos.
e polare funcţionale alterează interacţiunea cu alte molecule.
Catena izoprenică a carotenilor se termină la cele după extremităţi cu două cicluri
iononice din care unul poate avea o structură α-iononica, iar celălalt este de regulă un ciclu β-
iononic.
Ciclul β-iononic este necesar pentru caroteni care îndeplinesc funcţia de provitamine A.
α-Ionona are în soluţii diluate un miros caracteristic de violete. Ea a fost extrasă din Vila
odorata. Timan a obţinut iononele şi în laborator. Ele fiind identificate sub forma liberă şi în
produsele naturale cum ar fi uleiul extras din Boronia megastigma.

4
 1.2. Clasificarea carotenoidelor

Carotenoidele se clasifica în două categorii:

- hidrocarburi carotenoidice C40H56;
- xantofile-derivati hidrocarbonaţi oxigenaţi (alcooli, epoxizi, oxizi furanoidici şi cetone);
Carotina şi xantofila care au fost izolate de Willstaetter şi considerate de acesta ca fiind
substanţe pure s-a dovedit în timp ca de fapt sunt amestecuri de mai multe substanţe izomere
asemănătoare.
Numele de xantofile s-a păstra pentru a desemna grupa alcoolilor cu schelet carotinoidic.
Xantofilele se găsesc în plante esterificate cu acizi graşi superiori. De aceea, după ce s-a
extras materialul natural uscat într-o atmosferă de gaz inert (N2, H2) cu dizolvanţi cum ar fi
benzen, eter de petrol, metanol, eter, etanol şi îndepărtarea dizolvantului, reziduul este supus
hidrolizei cu KOH metanolic.
O primă separare a carotenoidelor obţinute se realizează prin repartiţie între doi dizolvanţi
nemiscibili cum ar fi eter de petrol şi metanol. Astfel, unele carotenoide rămân dizolvate în
dizolvantul nepolar şi anume carotenoidele epifazice (hidrocarburile carotenoidice) iar altele trec
în dizolvantul polar cum ar fi carotenoidele hipofazice ( xantofilele cu două grupe OH şi
epoxizii).
Carotenoidele cu o singură grupare OH se repartizează aproximativ uniform între cele
două faze.
Purificarea se realizează prin cromatografie pe oxid de aluminiu, oxid de calciu.

5
 1.3. Metode de separare a carotenoidelor din plante

Dezvoltarea impetuoasă a tehnicilor de izolare şi identificare a compuşilor naturali a avut

ca rezultat o îmbogăţire rapidă a numărului pigmenţilor carotenoidici.
Pentru izolarea din amestecurile de produşi naturali, se ţine cont de proprietăţile lor fizice
şi chimice.
Pigmenţii carotenoidici sunt sensibili la lumină, căldura, oxigen,acizi şi baze alcaline. Din
acest motiv, trebuie respectate anumite condiţii,pentru păstrarea materialului supus analizei. Prin
expunerea la lumină, în mod deosebit la lumina solară directă sau la lumina UV, se realizează
fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la fotodistrugerea lor. Deaceea, materialele
biologice ce conţin carotenoide sau soluţiile lor trebuie ferite de acţiunea luminii. Multe
carotenoide sunt termolabile, în special xantofilele, incalzirealor realizându-se doar în situaţia
când este absolut necesar acest lucru.
Separarea carotenoidelor trebuie realizată la temperatura camerei, până la 200 C şi la
întuneric. În cazul saponificării la cald, soluţiile trebuie protejate prin utilizarea solvenţilor cu
puncte de fierbere nu foarte ridicate (30-600C).În prezenţa oxigenului (aer) sau a peroxizilor,
multe carotenoide pot fioxidate, ele fiind foarte sensibile la oxigen în stare adsorbită (în
cromatograme, pe coloana şi pe strat subţire). Este necesar să se lucreze în stare inertă (în
atmosfera de azot sau vacuum).
Oxidarea în timpul extracţiei şi saponificării poate fi minimă prin utilizarea unei atmosfere
de azot. Prin expunerea carotenoidelor sau a materialelor biologice acţiunii acizilor, au loc o seri
de transformări, cum sunt descompunerile oxidative, izomerizarea cis-trans şi izomerizarea 5,6-
epoxizilor la 5,8-epoxizi. Înlăturarea acestor inconveniente se realizează prin neutralizarea cu
CaCO3, piridina sau dimetilalanina. De asemenea, se lucrează cu solvenţi purificaţi şi proaspăt
distilaţi, îndeosebi derivaţii cloruraţi, cum estediclormetanul, care conţine în mod frecvent HCl.
Depozitarea pigmenţilor carotenoidici se realizează la întuneric, subatmosfera de azot sau
în vacuum, la o temperatură de .200C. Cel mai bine se păstrează în stare cristalină. Păstrarea sub
formă de soluţie se realizează ineter de petrol, hexan sau benzen.
Determinarea unor constante fizice ca temperatura de topire, temperatura de fierbere,
densitatea, indicele de refracţie, intensitatea absorbţiei la anumite lungimi de undă etc., oferă
date distincte care permit individualizarea unui compus organic, caracterizarea lui. Totuşi, în

6
cercetările actuale se utilizează metodele spectrale, care oferă informaţii mai precise privind
structura şi proprietăţile substanţelor organice.
Metodele spectrale au avantajul, faţă de metodele chimice de identificare, că furnizează
date în timp mult mai scurt şi sunt mai precise, necesita cantităţi mici de substanţă şi oferă
posibilitatea analizării continue, în diferite etapeale prelucrării compusului extras, fără
modificarea compoziţiei substanţei cercetate, ceea ce permite recuperarea sa.

1.4. Metode de extracţie. Generalităţi privind metodele generale de extracţie

În lucrarea de faţă sunt prezentate principalele metode de extracţie,separare şi identificare

a compuşilor organici, cu aplicaţii directe la pigmenţi carotenoidici.
Distribuţia într-o mare varietate de materiale şi lichide biologicea compuşilor biologic
activi a făcut să nu se poată adopta o metodă general-valabila de extracţie care să poată fi
aplicabilă în mod universal şi adoptată ca o tehnică standardizată. Acest lucru se datorează
structurii diferite a compuşilor biologic activi, chiar şi cei din aceeaşi clasă deosebindu-se între ei
prin lungimea catenei, prin grupări funcţionale specifice sau configuraţie, solubilizării diferite în
solvenţi etc.
Metodă de extracţie se alege în funcţie de natura materialului vegetal, de uşurinţa extracţiei
cu solvenţi, de cantitatea şi proprietăţile compuşilor supuşi extracţiei (solubilitate,
termolabilitate) etc.
După natura substanţei de extras, lichida sau solidă, se aplică extracţia solid-lichid, în
marea majoritate a cazurilor, şi extracţia lichid-lichid, adică extracţia unui lichid sau a
principiilor active aflate într-un lichid (rezultatul primei faze de extracţie), cu ajutorul altui lichid
nemiscibil.
Produsul vegetal proaspăt sau uscat se pulverizează sau se zdrobeşte foarte fin până la
gradul de mărunţire convenabil realizării extracţiei.
Alegerea solventului este determinată de natura principiilor active, proprietăţile fizico-
chimice ale solventului, selectivitatea solventului. În general, substanţele termolabile sunt extrase
la rece prin percolare sau agitare.
Pentru extracţia la cald se folosesc mai multe metode în funcţie de regimul de extracţie, şi
anume extracţia la reflux, extracţia continuă solid-lichid sau lichid-lichid.

7
 Cele mai bune rezultate se obţin prin aplicarea extracţiei în contra-curent. O metodă
eficace de extracţie o constituie ultrasonicarea materialului supus extracţiei cu solvenţi.

1.4.1. Metode de extracţie a carotenoidelor

Extracţia carotenoidelor din produsul vegetal se realizează cu solvenţi organici nepolari, de

regulă eter etilic sau cloroform, prin macerare, agitare mecanică sau prin refluxare pe baia de apă
în fierbere. Se impune un grad de mărunţire avansat, deoarece solventul nepolar nu pătrunde prin
membrana celulară pentru a dizolva carotenoidele.
Materialul vegetal supus extracţiei poate fi în stare proaspătă sau uscată.Dacă materialul
supus extracţiei se afla în stare proaspătă, aces tlucru implica şi existenţa apei în ţesuturi, pentru
îndepărtarea ei fiind necesară uscarea prealabilă a materialului vegetal prin extracţia cu solvenţi
miscibili cu apă (acetona, metanol, etanol), materialul trebuind să fie suficient de deshidratat
pentru a se preta extracţiilor ulterioare cu solvenţi neaposi.

În cazul materialului uscat, extracţia se realizează cu solvenţi nemiscibili cu apă.Soluţia

extractivă organică conţine derivaţi carotenoidici nativi, alături de numeroase substanţe balast,
cum ar fi clorofila.

1.4.1.1. Extracţia din ţesuturile plantelor superioare

Pentru ţesuturile plantelor superioare se cunosc o multitudine de metode de extracţie, în

continuare fiind prezentate doua, ce constituie variante simplificate ale metodei generale de
extracţie.
Metoda I
Materialul vegetal este mărunţit foarte fin şi omogenizat cu acetonă, timp de 1-2 minute, în
atmosferă de azot.
Omogenatul este filtrat, iar reziduul este supus extracţiei ulterioare cu acetonă, până când
omogenatul devine incolor. Extractele acetonice se reunesc şi se concentrează la volum mic prin
evaporare la rotavapor.
Peste extractul acetonic se adaugă un volum egal de eter etilic proaspăt distilat,
omogenizând amestecul şi spălându-l apoi cu o soluţie deNaCl (pentru că eterul etilic să se
îndepărteze uşor şi pentru a se evita emulsionarea amestecului), până la îndepărtarea completă a
acetonei. Această metodă este foarte utilizată în cazul în care se realizează extracţii ale
ţesuturilor verzi ale plantelor, florilor şi fructelor.

8
 Metoda II
Această metodă este utilă în cazul în care se lucrează cu cantităţi mici de substanţă.
Ţesutul este mărunţit şi triturat cu Na2SO4 anhidru, până se obţine o pudră foarte fină,
care este apoi supusă extracţiei cu acetona,urmată de eter etilic. Extractul se centrifughează,
precipitatul obţinut extrăgându-se în continuare până la incolor, soluţiile supernatante
reunindu-se şi concentrându-se, transferându-se apoi într-un volum egal de eter etilic, ca şi în
cazul metodei I.
Pentru ambele metode este necesară saponificarea, care permite îndepărtarea substanţelor
balast, mai ales a clorofilei, şi hidroliza esterilor xantofilei.
Saponificarea se realizează prin adăugarea de KOH15% peste extract (1:10, v/v). Aceasta
saponificare se poate realiza în două moduri:- încălzirea amestecului alcalin timp de 10-15
minute pe baie de apă, în atmosfera de azot, la întuneric; -pastrarea la temperatura camerei sau la
50C, la întuneric, timp de10-15 ore. Este de preferat utilizarea metodei de saponificare prin
răcire, datorită faptului că unii pigmenţi carotenoidici (cum sunt xantofilele) sunt labiletermici,
existând posibilitatea degradării.

1.4.1.2. Extracţia din alge

În cazul extracţiei carotenoidelor din alge nu se mai aplică metoda generală prezentată mai
sus, datorită faptului că, pentru o extracţie eficientă, este necesară o disrupţie mecanică sau un
pretratament. De asemenea, extracţia carotenoidelor din alge se realizează cu solvenţi mai polari
decât acetona (etanol sau amestec acetona:etanol), datorită faptului că au polaritate mare şi
permit efectuarea saponificării pe extractul iniţial. Pretratamentul poate consta în suspendarea
algelor în apă distilată și răcirea timp de 5-8 ore înaintea extracţiei propriu-zise, apoi extracţia cu
metanol.
Un alt pretratament consta în decolorarea preliminară cu vapori de apă sau tratarea cu apă
fierbinte, timp de 2-3 minute, apoi răcirea rapidă cu gheaţă. Acest ultim procedeu înlesneşte
extracţia carotenoidelor, dar are şi un inconvenient, şi anume posibilitatea distrugerii enzimelor
careactioneaza asupra carotenoidelor şi clorofilelor.
Pentru o izolare eficientă a carotenoidelor din alge, acestea pot fi supuse uscării, deşi, prin
acest procedeu, unii compuşi pot suferi modificări, şi pot exista diminuări ale randamentelor de
extracţie.

9
 Un procedeu care implică uscarea prealabilă a algelor a fost utilizat la extracţia
carotenoidelor din Fucus serratus, când algele sunt uscate timp de câteva zile, măcinate, apoi
pudra este amestecată cu apă (800 ml apă la 500g pudră), după care amestecul este eluat într-o
coloană prin percolare cu amestec benzen:metanol (1:10, v/v).
Eluatele de culoare verde se îndepărtează, iar zona brută se eluează cu mult solvent, se
concentrează şi se cromatografiază pe coloana de CaCO3.

1.5. Cromatografia

Cromatografia este o metodă fizică de separare bazată pe distribuţia componentelor

dintr-un amestec între două faze: una fixă, denumită fază staţionară, şi altă mobilă, ce străbate
faza staţionară. Faza staţionară poate fi un adsorbant solid (cromatografie de adsorbţie), un lichid
depus pe suprafaţa unui suport solid (cromatografie de repartiţie), un schimbător de ioni
(cromografie prin schimb ionic) sau un gel.
Cromatografia se aplică în scopul izolării unor componenţi prin separarea acestora la eluţia
coloanei, prin răzuirea spoturilor de pe cromatoplaci (cromatografia în strat subţire) sau prin
tăierea spoturilor de pe hârtie.
Termenul de cromatografie, care înseamnă scriere în culori, (chrom=culoare în limba
greacă) a fost dat de Tvet (1906), cu ocazia separării coloranţilor din frunze verzi (clorofile,
carotenoide), prin adsorbţie lichid-solid.
Principiul metodei Tvet consta în stabilirea unui echilibru într-un proces cinetic de
adsorbtie-desorbtie între faza solidă fixă şi fază lichidă mobila. Faza staţionară este alcătuită din
material adsorbant, granular, plasat într-o coloană, iar faza mobila este o soluţie a amestecului de
separat într-un solvent potrivit. Soluţia se deplasează în coloana prin cădere liberă sau cu ajutorul
unei diferenţe de presiune.
Pentru distanţarea zonelor în care s-au adsorbit diverşi componenţi ai amestecului se
adaugă un solvent la partea superioară a coloanei. Componenţii migrează cu viteze diferite,
datorită faptului că sunt reţinuţi în mod diferit de către faza staţionară.Procesul este denumit
developarea cromatogramei.
Separarea completă a componenţilor din coloană, numită eluţia cromatogramei, se
realizează prin adăugarea de solvenţi diferiţi şi culegerea soluţiilor respective în vase diferite.
Componenţii ies din coloana în ordinea inversă adsorbabilitatii lor în faza staţionară. Dintre

10
metodele cromatografice, cromatografia în faza gazoasă şi cromatografia gaz-lichid sunt foarte
răspândite, datorită faptului că pot fi aplicate oricărui amestec de componenţi lichizi cu
temperaturi joase de fierbere.
Pentru compuşii organici cu volatilitate redusă, se utilizeaz acromatografia în strat subţire
şi cromatografia pe hârtie. În cromatografia pe hârtie, faza staţionară este constituită dintr-o foaie
de hârtie de filtru, pe care se aplică la o extremitate o picătură din amestecul de analizat. Hârtia
se introduce apoi cu extremitatea conţinând picătură într-un eluent situat într-un vas acoperit.
Eluentul urca prin capilaritate şi antrenează componentele în ordinea crescândă a valorii Rf, ce
reprezintă raportul dintre viteza de migrare a componentului şi viteza de migrare a eluentului:
Practic se măsoară distanţă de migrare a solventului şi distanţă de migrare a
componentului. Recunoaşterea componenţilor incolori se realizează cu ajutorul unui reactiv
specific cu care dau compuşi coloraţi.Când se doreşte separarea netă a componenţilor unui
amestec, se realizează o cromatografie bidimensională când, după o primă developare,hârtia se
usucă, se roteşte cu 900 şi se aşază într-un nou eluent. În cromatografia în strat subţire, faza
staţionară este un strat adsorbant (de silicagel sau alumina), depus pe o placă de sticlă. Principiul
separării este acelaşi ca la cromatografia pe hârtie, însă prezintă avantajul unei separări mai
rapide şi mai precise.

1.6. Metode de separare a carotenoidelor

Separarea carotenoidelor dintr-un amestec este dependentă de natura lor şi anume de

polaritatea moleculei şi de grupările funcţionale din moleculă, ce determina caracterul lor
hidrofil. Datorită acestor proprietăţi există două metode de separare a carotenoidelor, şi anume:
-repartitia între două faze lichide nemiscibile între ele; -separare prin adsorbţie pe adsorbant.
Schema generală de separare implică următoarele etape: -faza organică, obţinută după
saponificarea extractului, este anhidrizata cu Na2SO4., se supune repartiţiei între eter de
petrol-metanol 92% pentru a separa hidrocarburile carotenoidice şi xantofilele monohidroxilate
care trec în epifaza(eter), iar xantofilele dihidroxilate şi alte carotenoide superior oxidate trec în
hipofaza (alcool);- fiecare fază se supune cromatografierii pe coloana de oxid de aluminiu
(Al2O3 standardizat .Brockmann II-III) au alt adsorbant, utilizând ca eluanţi eter, alcool etilic:
eter (1:9, v/v), alcool etilic absolut, acetona. Se reţin fracţiuni de 50-100 ml, cărora li se
determina puritatea prin cromatografie în strat subţire, folosind drept faza staţionară silica gel, iar
drept faza mobila un sistem de solvenţi.

11
 1.6.1. Separarea prin repartiţia lichid-lichid

După cum s-a arătat mai sus, un sistem de repartiţie îl constituie eterul de petrol şi
metanolul. Prin această metodă se pot separa carotenoidele hidrocarburice de xantofile.
Separarea este utilizată ca o fază preliminară cromatografiei pe coloana sau în strat subţire.
Separarea prin repartiţie între două lichide poate fi o alternativă a saponificării în vederea
îndepărtării clorofilei din extractele ce nu se pot saponifica prin adăugare de baze, datorită
existenţei carotenoidelor sensibile la aceste substanţe. Acest procedeu implica trecerea
xantofilelor în hipofaza metanolica, clorofilele trecând în epifaza.
O altă variantă este extracţia unei soluţii metanolice a unui pigment cu eter de petrol, până
când clorofilele sunt îndepărtate. În ambele cazuri, xantofilele din hipofaza sunt trecute în eter
etilic şi apoi spălate cu apă. Acest procedeu este din ce în ce mai puţin utilizat datorită
sensibilităţii metodelor cromatografice, prin repartiţie randamentul des eparare fiind destul de
redus, carotenoidele, din cauza solubilităţii diferite, putându-se găsi în ambele fracţiuni de
repartiţie.
În cazul unei carotenoide ce posedă solubilitate doar în unul din cei doi solvenţi (glicozid
sau acid), acest procedeu se poate aplica, preferându-se, totuşi, metodele cromatografice.

1.6.2. Separarea prin metoda distribuţiei contracurent

Acest procedeu constă în repartiţie repetată între cei doi solvenţi descrişi mai sus,
ajungându-se la metoda denumită ,,distribuţia contracurent”. După un număr suficient de mare
de repartiţii, amestecul original este separat în fracţiuni, având fiecare o anumită solubilitate:
hidrocarburi carotenoidice, xantofile mono şi dihidroxilate, etc. Separarea prin metoda
distribuţiei contracurent este urmată de o fracţionare prin cromatografie pe coloana, prin
adsorbţie diferită datorată grupărilor specifice fiecărei grupe de carotenoide. Acest procedeu este
util în cazul separării xantofilelor foarte polare, care sunt puternic adsorbite.

12
1.6.3. Separea prin metode cromatografice

Pentru separarea carotenoidelor sunt foarte utilizate metodele cromatografice, atât cea în
strat subţire, cât şi cea pe coloană.
 Cromatografia în strat subţire

Cromatografia în strat subţire este o tehnică foarte utilizată în separarea şi purificarea

carotenoidelor. Tehnica de bază a acestei metode a fost descrisă de diferiţi autori. Gradul de
purificare prin această metodă este mult mai mare, comparativ cu cromatografia pe coloană. În
funcţie de natura carotenoidului se vor alege faza staţionară, precum şi faza mobilă şi sistemul de
eluare din plăci.
În cromatografia în strat subţire a carotenoidelor trebuie luate anumite precauţii, şi anume:
 aplicarea rapidă a probei;
 aplicarea probei la lumină slabă;
 developarea imediată a cromatogramei;
 developarea la întuneric a cromatogramei;
 utilizarea unei atmosfere de azot.
Materialele biologice ce conţin carotenoide sau soluţiile lor trebuie ferite de acţiunea
luminii deoarece prin expunerea carotenoidelor la lumină, în mod deosebit la lumină solară
directă sau la lumină UV, se realizează fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la
fotodistrugerea lor. Multe carotenoide sunt termolabile, în special xantofilele, încălzirea lor
realizându-se doar în situaţia când este absolut necesar acest lucru. Separarea carotenoidelor
trebuie realizată la temperatura camerei, până la 200C şi la întuneric.
În cazul saponificării la cald, soluţiile trebuie protejate prin utilizarea solvenţilor cu puncte
de fierbere nu foarte ridicate (30-600C). În prezenţa oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe
carotenoide pot fi oxidate, ele fiind foarte sensibile la oxigen în stare adsorbită (în
cromatograme, pe coloană şi pe strat subţire).

Detectarea carotenoidelor

Datorită faptului că aceşti pigmenţi sunt coloraţi, se poate realiza şi identificarea vizuală a
lor (se poate detecta vizual până la 0,05 g -caroten).

13
 Carotenoidele, însă, se decolorează rapid pe placa cromatografică, din acest motiv fiind
necesară stropirea cromatoplacii cu o soluţie de parafină în eter de petrol. Unele carotenoide
carbonilice sau produşii de descompunere oxidativă pot fi identificaţi cu o soluţie de rodamină
1% în acetonă sau prin stropirea cu o soluţie de SbCl3 în cloroform. Cea mai sensibilă metodă
rămâne totuşi identificarea cu vapori de iod, când se formează spoturi de culoare brună, prin
această metodă identificându-se şi eventualele impurităţi.
Compuşii incolori pot fi detectaţi prin vizualizarea fluorescenței verde caracteristică la
absorbţie în ultraviolet.

Eluarea carotenoidelor din cromatoplaci

Eluarea se face în funcţie de stratul adsorbant şi de polaritatea carotenoidelor. La
cromatografiere pe silicagel G eluarea se face cu eter etilic sau eter etilic +5-10% etanol
(carotenoide polare), iar la cromatografiere pe MgO eluarea se face cu acetonă (hidrocarburi
carotenoidice şi xantofile). Eluarea se face după scoaterea zonei colorate de pe suport, urmată de
filtrare.
Cromatografia pe coloană

Cea mai importantă metodă de separare a carotenoidelor, cromatografia pe coloană, a fost

înlocuită recent cu cromatografia în strat subţire prin caracteristicile sale de adsorbţie. Această
metodă este utilizat aprin îmbunătăţirea ei odată cu descoperirea cromatografiei în fază lichidă de
înaltă performanţă, metodă care prezintă avantajele utilizării cantităţilor mici de substanţă şi
vitezei de separare mari, dar limitată la o anumită scară, neputând fi utilizată în scopuri
preparative.
În funcţie de natura carotenoidului se vor alege adsorbantul şi solventul de developare
adecvat. Dintre adsorbanţii utilizaţi în cromatografia pe coloană pentru separarea carotenoidelor,
pot fi amintiţi celuloza, Ca(OH)2 (utilizat mai ales la separarea hidrocarburilor carotenoidice),
zaharoza, amidon, silicagel, Al2O3 (folosit la separarea monohidroxicarotenoidelor), CaCO3 şi
MgO (aceştia fiind utilaizați la separarea carotenoidelor cu polaritate intermediară, cum este
cazul xantofilelor). Pe aceeaşi coloană se pot utiliza şi adsorbanţi diferiţi aşezaţi în funcţie de
puterea de adsorbţie, cel mai adsorbant fiind aşezat în partea superioară a coloanei.

14
 Solvenţii utilizaţi în cromatografierea pe coloană a carotenoidelor sunt eluanţi slabi.
Deobicei se lucrează cu amestec de solvenţi, cum ar fi acetonă-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat
de etil-benzen etc.
Coloana de adsorbţie trebuie încărcată cu adsorbant în proporţie de ¾, o parte rămânând
pentru solvent şi extract.
Adsorbantul trebuie să fie foarte bine compactat în coloană, din acest motiv umplerea
coloanei realizându-se cu porţiuni mici de adsorbant ce trebuie apoi tasat.
Extractul carotenoidic trebuie să fie foarte concentrat pentru a se putea adăuga în coloană o
singură dată. După ce amestecul de pigmenţi a fost introdus în coloană, se începe developarea cu
solvenţi diferiţi, începând cu cel mai nepolar.
În cromatografia pe coloană se disting trei procedee de bază pentru separarea
carotenoidelor, şi anume:
a) cromatografia în zone;
b) cromatografia eluţiei în trepte;
c)cromatografia eluţiei în gradient.
Cromatografia în zone
Amestecul de carotenoide care se afla într-un solvent nepolar se aplică pe la partea de sus a
coloanei. Pentru separarea zonelor pe coloană esteutilizat un solvent adecvat pentru developare.
Zonele sunt scoase din coloană, fiecare zonă fiind apoi eluată individual cu un solvent polar.
Cromatografia eluţiei în trepte
În această metodă se aplică principiul general al cromatografiei pe coloană, şi anume
introducerea amestecului carotenoidic în partea superioară a coloanei, apoi aplicarea solvenţilor,
în funcţie de polaritate.
Pigmenţii sunt eluați în ordinea creşterii afinităţii lor de adsorbţie şi colectaţi. Fiecare zonă
eluată este apoi evaporată la sec, redizolvată într-un volum mic de solvent,în vederea
spectrofotometrarii.

15
 CONCLUZII

În perioada actuală, când pe plan naţional şi internaţional se pune un accent deosebit pe

valorificarea superioară a plantelor de cultură şi a celor din flora spontană, a surselor naturale în
general, în funcţie de compoziţia lor chimică, cunoaşterea substanţelor biologic active se impune
ca o cerinţă de prima mărime. Numai prin cunoaşterea compoziţiei chimice a plantelor, a
mecanismelor biochimice ce stau la baza fenomenelor biologice se vor putea obţine hibrizi noi
de plante, cu conţinut ridicat în substanţe biologic active, care măresc valoarea biologică a
plantelor în care se găsesc.
Pentru stabilirea formulei moleculare, a structurii moleculare şi a proprietăţilor fizico-
chimice a unui compus biologic activ, este necesară mai întâi izolarea lui din amestecul de
compuşi naturali.
Metodele de extracţie a compuşilor biologic activi se aleg în functiede proprietăţile
compuşilor supuşi extracţiei. Extracţia carotenoidelor din produsul vegetal se realizează cu
solvenţi organici nepolari (eter etilic,cloroform), prin macerare, agitare mecanică sau prin
refluxare pe baia de apă în fierbere, impunându-se un grad de mărunţire avansat, datorită faptului
că solventul nepolar nu pătrunde prin membrana celulară pentru a dizolva carotenoidele.
Metodele de separare se aleg de asemenea în funcţie de proprietăţile fizice şi chimice ale
substanţelor ce urmează a fi separate. Dintre metodele utilizate frecvent la separarea
carotenoidelor, o importanţă deosebită o prezintă metodele cromatografice, atât pe coloană cât şi
în strat subţire, precum şi separările prin repartiţia lichid-lichid şi prin metoda distribuţiei
contracurent.

16
 BIBLIOGRAFIE

1. https://bibliotecă.regielive.ro/proiecte/chimie-organica/carotenoide-structura-clasificare-
rol-metode-de-obținere-303996.html

2. V.Tamaş, G.Neamtu-,,Pigmenţi carotenoidici şi metaboliţi”, vol 1, Ed.Ceres, Bucureşti

(1986)

3. I.Ciulei, V.Istudor, M. Palade-,,Analiza farmacognostica şi fitochimica aproduselor

vegetale”, Ed. Didactică şi Pedagogică, Bucureşti (1997)

4. B.Amotz, A.Katz, M.Avron- J.Phycol., 18:529-37 (1982)

5. I.Pogany,M.Banciu-“Tehnica experimentală în chimia organică”, Ed. Științ.Enciclopediă

București (1977)

6. M.Iovu - Chimie organică, Ed Didactică şi Pedagogică, Bucureşti (1982)

17