ESCUELA PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA

ESPECIALIDAD DE LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA

PATOLÓGICA

HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE
IN SITU (FISH)
CITOTECNOLOGÍA
Docente : Lic. TM. Nataly Gomez Leiva
Ciclo : VII
DEFINICION
La técnica consiste en preparar cortas secuencias de
DNA de una sola hebra, llamadas sondas, que son
complementarias de las secuencias de DNA que se
quieren marcar y examinar.

Es muy utilizada en la detección de anomalías

cromosómicas.

alta sensibilidad y especificidad

FUNDAMENTO
Se basa en la complementariedad de las bases que componen
los ácidos nucleicos: G con C (ADN y ARN) y A con T (ADN), o U
(ARN).
Se diseña una sonda marcada que hibride con la secuencia a
detectar.
Este sistema permite estudiar la distribución in situ de una determinada
secuencia de interés:

Las que revelan la presencia de algún

patógeno

Asociadas a enfermedades de origen genético

Las que se han asociado a desarrollo de ciertos tumores

o las que se emplean como indicadores de alteraciones
numéricas del conjunto de cromosomas de un individuo
SONDAS
Son secuencias cortas de ADN de una sola hebra, que
son complementarias de las secuencias de ADN que se
quieren marcar y examinar.
Fragmentos de ADN (300-500 pb)
homólogos a la secuencia blanco,
marcados con una molécula
detectable directamente o mediante
una reacción inmunoquímica

Estos fragmentos deben cubrir una región de por

lo menos 100 kb para poder ser detectados al
microscopio
 Hibridan a una región
particular de un gen. Esta
Sondas especificas sonda es útil cuando se ha
de un locus aislado una pequeña parte
de un gen y se quiere
averiguar en que cromosoma
se encuentra.
contienen secuencias
complementarias de las
secuencias repetidas que se
Sondas encuentran en los centrómeros
de los cromosomas. Como
centroméricas pueden utilizarse sondas de
diferentes colores, cada
cromosoma puede ser marcado
de manera distinta, con lo que
se puede averiguar si un
individuo tiene el número
correcto

Sondas para Son colecciones de sondas de

un tamaño reducido, cada una
cromosomas de las cuales se hibrida a una
completos secuencia diferente a lo largo
de todo un cromosoma.
Utilizando estas librerias de
sondas, se puede marcar todo
un cromosoma generando un
cariotipo espectral.
Tipos de sondas

- ADNcd
- ADNcs
- ARN
- Oligonucleótidos sintéticos

Marcaje de las sondas

- radioactivo: uso de radioisótopos (revelado por ARG)

H3 P32 P33
S35

- no radioactivo: marcaje directo e indirecto mediante haptenos (detección

inmunológica)

Digoxigenina ALP
Peroxidasa
Biotina FITC
DIRECTAS:
La sonda está marcada con un fluorocromo

INDIRECTAS:
La sonda está marcada con una molécula detectable mediante una reacción
antígeno-anticuerpo, donde el anticuerpo está unido al fluorocromo
Según la extensión de la región a detectar se dividen en:

Contienen secuencias
complementarias de las secuencias
repetidas que se encuentran en los
centrómeros y telómeros de los
cromosomas.

Colecciones de sondas
Se hibridan a una región particular de un gen. Estas de un tamaño reducido,
sondas son útiles cuando se ha aislado una cada una de las cuales se
pequeña parte de un gen y se quiere averiguar en hibrida a una secuencia
qué cromosoma se encuentra. diferente a lo largo de
todo un cromosoma.
Sondas gen-específicas

Ej: Inactivación del cromosoma X en

sexo femenino.
Centro de inactivación (Xic) ligado al X.
Incluye el locus de inactivación XIST
(sobreexpresión en X inactivo;
represión en el X activo).
 Sonda de fusión
A)

NORMAL TRANSLOCADO

B)

Punto de
NORMAL TRANSLOCADO ruptura
Punto de
Sonda de separación ruptura
Sondas región-específicas
 Sondas de pintado cromosómico

Permite detectar alteraciones estructurales o numéricas (metafase).

Inconvenientes:
- No permite detectar inversiones paracentroméricas
- Baja resolución, lo que impide detectar pequeñas deleciones,
translocaciones y duplicaciones.
 Pasos para la hibridación in situ
a) Generación de ácidos nucleicos marcados para una detección subsecuente.

b) Fijación de tejidos (seccionados), preparación de cromosomas.

c) Preparación del tejido para incrementar el acceso del ácido nucleico

marcado.

d) Hibridación de la sonda marcada en cromosomas o tejidos.

e) Lavados selectivos que remuevan las sondas que no hibridan.

f) Detección de la sonda marcada, revelando la localización celular de los

ácidos nucleicos.
PROCEDIMIENTO
APLICACIONES
Detecta anomalías: Aneuploidía, la pérdida de una
región cromosómica, un cromosoma entero o para
monitorizar la progresión de una aberración.

En el diagnóstico de una enfermedad genética.

FISH se puede aplicar a la investigación como: el

mapeo de genes, identificación de nuevos oncogenes
que contribuyen a diversos tipos de cáncer.
Aplicaciones de la hibridación in situ
1) Expresión génica

Expresión del gen Nkx2.1,

esencial para el desarrollo de
los pulmones, la glándula
tiroidea y los ganglios basales
telencefálicos.
2) Infecciones virales

Diagnóstico de HPV Diagnóstico de EBV Diagnóstico de CMV

 3) Diagnóstico

Gen HER2: produce una

proteína homónima, cuya
alteración puede ocasionar
cáncer.
Durante el desarrollo del
HER2 no amplificado cáncer este gen se
amplifica provocando la
sobreexpresión de la
proteína.
La amplificación del gen
HER2 se asocia a tumores
de mama muy activos y
con una tasa de
supervivencia muy baja.
HER2 amplificado
 FISH en la detección de leucemias
t(9;22)(q34;q11) origina el cromosoma Filadelfia

Leucemia mieloide crónica (95%) + algunos casos

de leucemia linfocítica aguda.

Gen de fusión BCR / ABL tiene importancia

diagnóstica.

Región BCR (22q11.2)

Región ABL (9q34)

t(8;21) : Gen de fusión AML1 /

ETO

t(8;21)(q22;q22): Leucemias
mieloides agudas,
especialmente de tipo M2.

Indica pronóstico bueno.

 FISH en interfase
mostrando alteraciones
numéricas
FISH en espermatozoides
Sondas centroméricas para los
cromosomas X, Y, y 18.
Sondas locus-específicas para los
cromosomas 13 y 21.
Porcentaje de espermatozoides
cromosómicamente alterados
permitiendo enumerar la cantidad de
cromosomas/espermatozoide.

Indicaciones:
- Oligoastenoteratozoospermia
- Abortos recurrentes
- Baja tasa de fecundación y fallo de la
implantación.
 Cariotipo espectral (FISH
multicolor)
Se genera un cariotipo en el que
cada cromosoma es pintado de un
color.

La imagen es procesada
digitalmente asignando un color
distinto a cada cromosoma.

Cromosoma normal: color uniforme

Cromosoma con rearreglo: varios
colores.

Detecta translocaciones, grandes

deleciones y duplicaciones.

Desventaja: no permite detección

de duplicaciones y deleciones de
pequeños fragmentos.
VENTAJA
Proporciona una resolución considerablemente
superior a la de las técnicas de bandas de alta
resolución; ya que puede detectar deleciones de
tamaño tan pequeño como 1 millón de pares de bases.

Pueden detectar aneuploidias empleando cromosomas

en interfase, no es necesario estimular a las células
para que se dividan con el fin de obtener cromosomas
en metafase.
 COMPARACION
Convencional: Técnicas de bandeo de cromosomas
(tinción Giemsa) revolucionó el análisis citogenético y
han sido fundamentales en la comprensión de los
cambios genéticos en ambas enfermedades
constitucionales y adquiridos.

La resolución del análisis de bandas es de tal manera

que sólo puede detectar reordenamientos que
implican 0,3 Mb de ADN.

Técnicas de bandas se limitan a células mitóticas

activas.
La tinción de cromosomas con Giemsa permite el
análisis de los diferentes tipos como: cromosomas
policéntricos, cromosomas en anillo, intercambios de
cromátidas y fragmentos.

Otros tipos de aberraciones cromosómicas tales como

translocaciones e inversiones recíprocas no son
normalmente reconocible con la tinción de Giemsa,
pero pueden ser visualizados por FISH.
Nueva: La tecnología de Microarreglos.
Analizar diferentes tipos de muestras biológicas
(tejidos, proteínas y material genético) y otras
moléculas de manera simultánea por ensayo.

La versatilidad de esta técnica permite utilizarla en

estudios de dosis-respuesta, para establecer perfiles de
expresión diferencial de genes en condiciones
experimentales distintas (enfermedades y
tratamientos) en el análisis de polimorfismos,
presencia de metilaciones, mutaciones puntuales e
identificación de blancos terapéuticos.
 Hibridación Genómica Comparativa (CGH)
• Técnica relacionada con FISH
• Permite analizar el número de
cromosomas totales
• Control positivo: células adultas
normales
• Resultados analizados por un
software

NORMAL igual cantidad de rojo y verde =

amarillo

TRISOMIA > rojo (ADN muestra analizada)

MONOSOMIA > verde (ADN control)

 FISH de metafase
La FISH puede usarse sobre células en metafase para
detectar microdeleciones específicas más allá de la
capacidad de resolución de la citogenética de rutina, o
para identificar material extra de origen desconocido.

Puede también ser de ayuda en casos donde es difícil

determinar mediante la citogenética de rutina si un
cromosoma tiene una deleción simple o si está implicado
en una reorganización sutil o compleja. Además, la FISH
de metafase puede detectar algunos de los
reordenamientos específicos que se observan en ciertos
tipos de cáncer.
Algunos síndromes de microdeleción
diagnosticables mediante FISH

•Síndrome de Miller-Dieker
•Síndrome de Williams
•Síndrome de Kallman
•Síndrome de Prader-Willi/Angelman
FISH de interfase

• La FISH se puede usar sobre células en interfase para determinar el

número de copias de uno o varios cromosomas, así como para
detectar algunas reorganizaciones específicas que son características
de ciertos tipos de cáncer.
• La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede realizar
muy rápidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no
requiere cultivo para la proliferación de las células.
 ESTUDIOS FISH

• SOSPECHA DE SINDROME DE MICRODELECION

• RETRASO MENTAL
• PAREJAS CON ABORTOS DE REPETICION
• CROMOSOMAS MARCADORES
• CARACTERIZACION DE REESTRUCTURACIONES CROMOSOMICAS
• DIAGNOSTICO PRENATAL DE LAS ANEUPLOIDIAS MAS FRECUENTES
• DIAGNOSTICO DE DIFERENTES ANEUPOLIDIAS EN ABORTOS ESPONTANEOS
Conclusiones
La FISH es una técnica útil a la hora de visualizar células en
división aunque también se puede aplicar a células tanto
parafinadas como congeladas.
 Técnica rápida, con gran especificidad y sensibilidad, incluso
en células pequeñas.
 Se pueden analizar un gran número de células.
 Es muy útil a la hora de diagnosticar enfermedades basadas
en aneuploidías y poliploidías.
 No obstante, su precisión se puede ver alterada por una
variedad de factores como la calidad de la sonda y de la
fijación, los reactivos de detección y la temperatura de
desnaturalización.