Inversión de sexo después de la eliminación de un solo

potenciador distal de Sox9

Las decisiones sobre el destino celular requieren una regulación apropiada de genes clave. Sox9,
un objetivo directo de SRY, es fundamental en la determinación del sexo de los mamíferos. Las
técnicas de accesibilidad a la cromatina de alto rendimiento in vivo, los ensayos transgénicos y la
edición del genoma revelaron varios elementos reguladores gonadales novedosos en el desierto
de genes de 2-megabase aguas arriba de Sox9.Aunque otros son redundantes, el potenciador 13
(Enh13), un elemento de 557 pares de bases ubicado a 565 kilobases 5 'del sitio de inicio de la
transcripción, es esencial para iniciar el desarrollo del testículo del ratón;su eliminación da como
resultado hembras XY con niveles de transcripción de Sox9 equivalentes a los de las gonadas
XX. Nuestros datos son consistentes con la actividad sensible al tiempo de SRY e indican un
orden estricto de uso del potenciador. Enh13 se conserva e integra dentro de una región de 32.5
kilobases cuya eliminación en humanos se asocia con la inversión de sexo XY, lo que sugiere que
también es crítico en humanos.
La regulación de genes con funciones importantes en el desarrollo embrionario puede ser
compleja, e involucra múltiples potenciadores, silenciadores y aislantes a menudo redundantes (1,
2). Los genes pueden tener un estado epigenético equilibrado antes de su expresión, y su
activación o represión puede implicar bucles de avance positivo o negativo. Es probable que esta
complejidad se amplifique cuando el gen tenga funciones en más de un tejido, dado que los
elementos reguladores requeridos para cada uno a menudo se intercalan y requieren alteraciones
dinámicas en la conformación de la cromatina (1, 2). Las gónadas en desarrollo constituyen un
sistema interesante para explorar cuestiones de regulación de genes durante el desarrollo (3). La
mayoría de los linajes celulares son bipotenciales, con la capacidad de dar origen a los tipos
celulares típicos de ovarios o testículos, y muchos genes que se asocian con el destino masculino o
femenino comienzan a expresarse en niveles equivalentes, aunque generalmente bajos, en células
de soporte. precursores de las gónadas XX y XY (4-6).
En los mamíferos, el gen Sry codifica una proteína que se expresa de forma transitoria e inicia el
testículo y el desarrollo masculino posterior al desencadenar células del linaje celular de soporte
para diferenciarse en células de Sertoli en lugar de células de la granulosa típicas de los ovarios
(7). Sox9, el principal objetivo de SRY, es fundamental para la diferenciación de las células de
Sertoli y luego funciona junto con otros factores de transcripción, especialmente Sox8 y luego
Dmrt1, para el mantenimiento de las células de Sertoli (4–6). Los estudios de ganancia y pérdida
de función en ratones y humanos demuestran que Sox9 desempeña un papel clave en la
determinación de los testículos (8–13). Cabe destacar que los humanos heterocigotos para
mutaciones nulas desarrollan displasia campomélica (CD) [Entrada en línea 114290 de Herencia
Mendeliana en el Hombre (OMIM)] (11), un síndrome grave en el que el 70% de los pacientes con
XY muestran desarrollo femenino (12, 13).
Sox9 funciona en muchos tipos de células embrionarias y adultas (14), y la evidencia genética y
molecular sugiere que su región reguladora se extiende sobre un desierto genético de al menos 2
Mb 5 'a la secuencia de codificación (15). El único potenciador que se sabe que es relevante para
la expresión en células de Sertoli fue TES, un elemento de 3.2 kb que mapea 13 kb 5 'desde el sitio
de inicio de la transcripción, y su núcleo de 1.4 kb, TESCO (16). La eliminación dirigida de TES o
TESCO redujo los niveles de expresión de Sox9 en el testículo temprano y postnatal de ratón a
aproximadamente el 45% de lo normal, pero no dio como resultado un desarrollo XY femenino
(17). Por lo tanto, utilizamos varios enfoques no sesgados para buscar sistemáticamente
potenciadores de gónadas adicionales antes del Sox9 del ratón. Usamos datos de secuenciación de
sitios hipersensibles de desoxirribonucleasa I ( DNasaI- seq) obtenidos con el día 13.5 embrionario
(E13.5) y células de Sertoli clasificadas E15.5 (18). De los 33 potenciadores putativos, elegimos solo
los positivos en ambas etapas (14 potenciadores) para la validación in vivo mediante ensayos
transgénicos (Fig. 1A y Fig. S1). En paralelo, llevamos a cabo ATAC-seq (análisis de cromatina
accesible por transposasa utilizando secuenciación) en gónadas XY y XX, lo que permitió el uso de
menos células clasificadas en E10.5, una etapa bipotencial temprana, y E13.5, cuando gonadal El
sexo ya está determinado (figs. S1 y S2 y métodos). La mayoría de los potenciadores putativos
descubiertos porDNaseIseq fueron evidentes en los datos E13.5 XY ATAC-seq; sin embargo,
utilizamos este ensayo para incluir dos potenciadores putativos más en la pantalla in vivo:
potenciador 1 (Enh1) y Enh14 (Fig. 1A y fig. S1). La secuenciación de inmunoprecipitación de
cromatina ( ChIP- seq) también se realizó para H3K27ac, una modificación de histona que marca
potenciadores activos (fig. S1).
Los 16 potenciadores putativos se clonaron cadena arriba de un promotor mínimo de Hsp68 y el
gen indicador LacZ y se usaron para generar ratones transgénicos (2, 19) (tabla S1). Para las
pantallas iniciales, realizamos análisis transitorios en E13.5. Doce potenciadores no produjeron
ninguna actividad gonadal b-galactosidasa (b-Gal), aunque muchos mostraron tinción en otros
tejidos en los que Sox9 se expresa normalmente, como los condrocitos, el cerebro y la médula
espinal (fig. S3). Los cuatro restantes mostraron expresión gonadal, y estas construcciones se
reinyectaron para generar líneas estables con el fin de estudiar mejor su actividad en machos y
hembras durante el desarrollo. Enh8 [672 pares de bases (pb) de largo, 838 kb 5 '] confirió una
actividad robusta de b-Gal en el ovario, mientras que estaba apenas presente en los testículos en
E13.5 (Fig. 1A y Fig. S4B). Esto puede deberse a que Enh8 haya sido sacado de su contexto
genómico original; notablemente, ATAC-seq reveló un pico mucho más fuerte en las células de la
granulosa que en las células de Sertoli (fig. S4A).
Sin embargo, la robusta actividad de b-Gal específica para testículos (Fig. 1A y Fig. S5B). Los datos
de DNaseI-seq, ATAC-seq y H3K27ac ChIP -seq sugieren que este potenciador está activo y abierto
solo en las células de Sertoli (figs. S1 y S5A). Para probar este candidato, usamos la edición del
genoma para eliminar Enh14. Sin embargo, la eliminación de Enh14 no alteró la expresión de
Sox9; su gen objetivo Amh ; o Foxl2, un marcador de células de la granulosa, en las gónadas E13.5
XY (fig. S5D), que indica que Enh14 tiene un papel redundante, al menos en el embrión. Enh32
(970 pb de longitud, 10 kb 5 ') también es específico para el testículo pero muy débil y está
restringido a un dominio cercano al mesonefros (Fig. 1A y Fig. S6, B y C). Los datos de ATAC-
seq, DNaseI -seq y H3K27ac ChIP- seq sugieren que Enh32 es un potenciador de células de Sertoli,
aunque se observaron picos débiles en las muestras de células granulosas ( figuras S1 y S6A).
El potenciador restante, Enh13 (557 pb de largo, 565 kb 5 ′), está altamente conservado entre los
mamíferos y se ubica hacia el extremo 5 'distal de una región de 25.7 kb en ratones que muestra
una sintenidad conservada con una región de 32.5 kb aguas arriba de SOX9 humano denominado
XY SR, cuya eliminación está asociada con la inversión de sexo (20) (Fig. 1, A y B, y Fig. S1). Enh13
muestra el pico específico de células de Sertoli más fuerte dentro de esta región en los datos
de DNaseI -seq y ATAC-seq. Los datos de H3K27ac ChIPseq marcan Enh13 como activo en células
tanto de Sertoli como de granulosa, lo que puede apoyar la observación de que algunas líneas
transgénicas también exhiben actividad b-Gal en el ovario (Fig. 1C y Fig. S1 y S7A). La expresión de
b-Gal está claramente dentro de las células de Sertoli y granulosa (fig. S7C). Los datos de ATAC-seq
de las crestas genitales E10.5 muestran que Enh13 no está abierto en esta etapa,
independientemente del sexo cromosómico (Fig. 1B y Fig. S1), lo que sugiere que se abre
coincidiendo con la especificación del linaje celular de soporte de SF1 positivo Células del epitelio
celómico (5).
La edición del genoma se usó para derivar ratones homocigotos para deleciones de Enh13. La
eliminación homocigótica siempre condujo al desarrollo femenino XY, ya sea en un fondo mutante
TES o en un fondo de tiposalvaje (Fig. 2 y figs. S8 a S10). El último resultado fue sorprendente,
porque si el TES representa el 55% de la expresión de Sox9 en las células tempranas de Sertoli,
cualquier potenciador adicional no debe representar más del 45% y, cuando se elimina este
potenciador, los niveles de Sox9 deben permanecer más altos que el umbral de ~ 25% por debajo
del cual podría esperarse una reversión de sexo (17).
Sin embargo, mientras que los embriones XY Enh13 +/− todavía experimentan un desarrollo
normal del testículo, los embriones XY Enh13 - / - producen ovarios indistinguibles de los
embriones de tipo salvaje XX, sin signos de cordones testiculares o un vaso coelómico (Fig. 2, B y C
, y fig. S10). El análisis de inmunofluorescencia de las gónadas XY Enh13 +/− y Enh13 - / - de E13.5
y 6 semanas de edad para SOX9 y FOXL2 mostró que los primeros aún son testículos mientras que
los últimos son ovarios completamente invertidos por el sexo (Fig. 2C y Fig. S10D ). Un análisis
similar de las gónadas XX con eliminación de Enh13 no mostró ningún fenotipo obvio (fig. S11)
La eliminación de Enh13 se generó en un fondo genético C57BL / 6J, que está sensibilizado hacia la
reversión del sexo femenino XY (21). Para probar la fuerza del alelo eliminado, por lo tanto,
retrocruzamos la eliminación en un fondo mixto C57BL / 6J × CBA. Como antes, los heterocigotos
XY se presentaron como machos fértiles normales, mientras que los homocigotos mostraron una
inversión total del sexo de hombre a mujer (fig. S12).
No pudimos detectar diferencias en los fenotipos gonadales entre los embriones o ratones Enh13−
/ -: TES + / + y Enh13 - / -: TES - / -, lo que sugiere que la homocigosidad para la eliminación de
Enh13 solo redujo los niveles de Sox9 muy por debajo del umbral crítico requerido para desarrollo
del testículo, que se había determinado en E13.5 (17) (figs. S8 y S10). Sin embargo, el examen de
los niveles de expresión génica en esta etapa cuando hay inversión del sexo no será informativo
porque factores como WNT4 y FOXL2 reprimen a Sox9 una vez que comienza el desarrollo del
ovario (5). Por lo tanto, analizamos los ARNm de Sox9, Sry , Sf1 y Foxl2 en E11.5, durante el breve
período en que se determina el sexo gonadal. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
en tiempo real (RT-qPCR) reveló que las crestas genitales XY Enh13 +/− y Enh13 - / - expresaban 58
y 21% de los niveles de tipo natural del ARNm de Sox9, mientras que XY TES +/− y TES - / - Las
crestas genitales mostraron 55 y 50%, respectivamente (Fig. 3A). Las crestas genitales de Control
XX contenían el 18% de los niveles de ARNm de Sox9 encontrados en las crestas genitales XY (Fig.
3A). Por lo tanto, las gónadas E11.5 XY Enh13 - / - expresan Sox9 a niveles cercanos a los de las
gonadas XX en la misma etapa, lo que explica la inversión sexual completa observada. La
eliminación de una o dos copias de TES tuvo un efecto relativamente pequeño en E11.5,
especialmente comparado con el efecto en E13.5, en contraste con los resultados con
eliminaciones de Enh13 en E11.5 (Fig. 3A) (17). De nuevo, esto respalda la conclusión de que
Enh13 desempeña un papel más importante que TES durante el desarrollo gonadal temprano.
La expresión de Sry está normalmente regulada a la baja a medida que aumentan los niveles de
SOX9, pero puede persistir si falla la diferenciación de los testículos (22, 23). Esto es consistente
con un efecto represivo directo o indirecto de SOX9 en Sry . En E11.5, los niveles de ARNm
de Sry fueron más altos que los niveles de tipo salvaje tanto en las gónadas Enh13 +/− como en la
Enh13 - / - XY (168 y 152%, respectivamente) (Fig. 3B). En contraste, la eliminación de TES no
alteró significativamente la expresión de Sry (Fig. 3B), lo cual se espera porque la diferenciación de
las células de Sertoli está avanzando en los mutantes de TES. Se sabe que SF1 interactúa primero
con SRY y luego con SOX9 para regular los niveles de expresión de Sox9 y también muchos de sus
genes diana posteriores (16). No encontramos cambios significativos en los niveles de ARNm de
Sf1 con ninguna de las eliminaciones del potenciador en E11.5 (Fig. 3C). Usando Foxl2 como un
marcador temprano de la diferenciación celular de la granulosa (24), encontramos que los niveles
de ARNm en XX gonadas de tipo salvaje en E11.5 eran 3.6 veces más altas que las de las gónadas
XY (Fig. 3D). En comparación con las últimas, las gónadas Enh13 +/− y Enh13 - / - XY mostraron
aumentos de dos y tres veces, respectivamente, con los homocigotos que tienen niveles de ARNm
muy cercanos a los niveles de control XX. Por lo tanto, las gónadas Enh13 - / - XY revelan un
compromiso temprano con la vía ovárica .
Hubo una disminución de 30 a 50% en los niveles de ARNm de Sox9 en E11.5 XX Enh13 - / -
gonadas en comparación con el tipo salvaje, como se refleja en la inmunofluorescencia reducida
para la proteína SOX9 (fig. S11).Estos datos indican que Enh13 también desempeña un papel en la
expresión muy temprana de Sox9 en la gónada XX, consistente tanto con el pequeño pico
observado con ATAC-seq como con la actividad informadora ocasional en los ensayos con ratones
transgénicos (Fig. 1, B y C , y fig. S7).
La secuencia de Enh13 está altamente conservada entre los mamíferos (Fig. 1B) y contiene sitios
de unión de consenso para los factores de transcripción que se sabe que regulan el desarrollo
temprano de la gónada y la determinación del sexo (fig. S13) (6). Mouse Enh13 contiene un único
sitio de unión SRY por consenso, así como un sitio SOX9 al que también se puede enlazar SRY (Fig.
4A y Fig. S13). Realizamos ChIP- qPCR en E11.5 gonadas disecadas de embriones transgénicos Sry-
Myc utilizando un anticuerpo específico contra la etiqueta MYC (22). Las gónadas SRY-MYC
positivas tuvieron un enriquecimiento de 11 veces en comparación con las gónadas negativas de
SRY MYC con cebadores que abarcan el sitio de consenso SOX9 y un enriquecimiento de seis
veces con cebadores que abarcan el sitio SRY, mientras que los cebadores se comparan con el sitio
de unión SRY más fuerte en TESCO (22) mostró cinco veces el enriquecimiento (Fig. 4, A y B). Esto
revela la fuerte unión de SRY a Enh13 en E11.5, con una preferencia por el sitio de consenso SOX9,
posiblemente debido al sitio de unión SF1 adyacente. La unión preferencial de SRY a Enh13 sobre
TESCO en E11.5 apoya la hipótesis de que el primero es más crítico porque inicia la regulación
ascendente de Sox9, mientras que el segundo es secundario.
Los ensayos de ChIP revelaron que el SOX9 estaba unido a niveles similares tanto a Enh13 como a
TESCO en células de los testículos E13.5 (Fig. 4C). Además, los datos de SOX9 ChIP- seq obtenidos
con el testículo embrionario bovino (25) revelaron un fuerte pico que se localiza en la región
syntenic conservada de Enh13 (537 pb de largo, 570 kb 5 ') (Fig. 4D). Esto sugiere que, al igual que
TES, el SOX9 utiliza Enh13 para autorregular la expresión de SOX9 y que esta interacción se
conserva en los mamíferos. A diferencia de varios otros potenciadores gonadales, Enh13 parece
estar bien conservado, tiene un papel claro en los ratones para iniciar la regulación positiva de la
expresión de Sox9 en respuesta a la actividad SRY, y puede contribuir a mantener la expresión de
Sox9. Esto hace que sea muy probable que desempeñe un papel similar en los humanos, dada su
ubicación dentro de la región XY SR (20, 26). Si desempeña un papel similar, la heterocigosidad
para las eliminaciones de Enh13 en humanos debería imitar la heterocigosidad para mutaciones
nulas en SOX9, con una inversión de sexo XY en aproximadamente el 70% de los casos pero quizás
sin otros fenotipos de CD .
De nuestros datos y de otros se desprende claramente que la región reguladora ascendente de
Sox9 es muy compleja. Nuestras pantallas con células gonadales revelaron 33 potenciadores
potenciales distribuidos en 1.5 Mb.Los ensayos transgénicos utilizados para probar los 16
potenciadores más prometedores revelaron 4 que produjeron expresión en las gónadas, mientras
que la mayoría no lo hizo. Esta "tasa de aciertos" del 25% está de acuerdo con los resultados de
algunos otros estudios (19) y merece precaución al interpretar los datos basados únicamente en la
accesibilidad de las marcas de cromatina e histonas. Sin embargo, varios de estos potenciadores
putativos son potenciadores de buena fe en otras ubicaciones; por ejemplo, Enh29, mapeando
aproximadamente 70 kb 5 ', es equivalente a SOM, un potenciador activo en muchos tejidos,
excluyendo las gónadas (27). Otros pueden tener roles distintos; Enh11 contiene un sitio de enlace
putativo CTCF. Además, varios potenciadores putativos, notablemente Enh4, -5, -8 y -9, parecen
estar abiertos tanto en la granulosa como en las células de Sertoli, con Enh8 aún más en la
primera. Estos pueden contribuir al bajo nivel de expresión de Sox9 que se observa en
los precursores celulares de soporte , pero también pueden representar secuencias requeridas
para reprimir Sox9, que podrían no detectarse mediante ensayos de indicadores transgénicos .
La noción de redundancia o "potenciadores de sombra" dentro de una región reguladora está bien
establecida (28, 29), y los datos recientes sugieren que la eliminación de potenciadores únicos,
incluso " ultraconservados " de genes importantes para el desarrollo puede tener, como mucho,
efectos sutiles, si no indetectables ( 30, 31). Por lo tanto, es notable ver que al eliminar solo
Enh13, las fenocopías de la propia pérdida de Sox9 dentro del linaje celular de apoyo (9, 32). La
evidencia sustancial apunta a la acción dependiente del tiempo de SRY en Sox9. Si Sox9 no alcanza
un umbral crítico en unas pocas horas, los factores antitestis y determinantes del ovario ,
como la señalización Wnt , se acumulan a un nivel suficiente para reprimir a Sox9 y hacerla
refractaria a los factores de promoción masculina, incluido el SRY, incluso aunque la expresión de
este último persiste en las gónadas XY cuando las células de Sertoli no logran diferenciarse
(33). Sugerimos que Enh13 es un potenciador de acción temprana, de modo que sin él, la
transcripción de Sox9 no aumenta a un nivel en el que los otros potenciadores pueden actuar
antes de que el gen sea silenciado. Solo después, TES, y quizás otros potenciadores como Enh14 y
Enh32, comienzan a actuar de una manera más redundante, aunque es posible que cada
potenciador juegue un papel importante durante las distintas fases del desarrollo de las células de
Sertoli desde el fetal hasta el El testículo adulto. Será de interés determinar cómo la actividad de
Enh13 cae en cascada en el reclutamiento de los otros potenciadores.

Fig. 1. Enh13 es un potenciador positivo para testículos de Sox9 ubicado dentro de la región XY
SR. (A) Una representación esquemática del gen del desierto corriente arriba del gen Sox9 de
ratón y las ubicaciones de los supuestos potenciadores identificados por ATAC-seq y DNaseI -seq
que se examinaron in vivo con ratones informadores transgénicos. Los potenciadores que no
condujeron la expresión de gónadas de LacZ se muestran en gris. Los potenciadores que
condujeron la expresión de LacZ específica para testículos y ovarios se muestran en azul y rosa,
respectivamente. Las regiones del ratón que muestran una sintenidad conservada con el XY SR
humano y el SEXO REV se muestran en recuadros verde y púrpura, respectivamente. (B) Enh13
(cuadro gris) está ubicado en el lado 5 'del locus XY SR equivalente al ratón de 25.7 kb (línea negra
gruesa). Datos de DNaseI -seq (negro) en células de Sertoli clasificadas X15 y E13.5 EY y secuencias
de ATAC en células de Sertoli clasificadas E13.5 (azul) y células de granulosa (púrpura), así como
células somáticas clasificadas E10.5 , en la región genómica Enh13 se presentan. Los picos
corresponden a regiones empobrecidas en el nucleosoma y están marcados por una línea
horizontal negra si están significativamente enriquecidos en comparación con las regiones
flanqueantes, según lo determinado por el análisis basado en modelos de ChIP- seq, y están
presentes en al menos dos réplicas biológicas. El cuadro gris que sobrepone el pico indica el
fragmento clonado. Las áreas verdes representan la conservación de secuencias entre ratones,
humanos (Hu), monos rhesus (Rh), vacas (Co) y pollos (Ch) (las pistas de conservación de
secuencias se obtuvieron de la Universidad de California-Santa Cruz). (C) tinción con b-Gal (azul)
de los testículos E13.5 y ovarios de dos líneas transgénicas ( Tg ) estables de Represent13,
independientes y estables . Escala Barras , 100 mm.

Fig. 2. La eliminación de Enh13 conduce a una inversión completa del sexo XY de hombre a
mujer. (A) Una representación esquemática de las ubicaciones de Enh13 y TES aguas arriba de
Sox9. Las flechas azul y púrpura representan los ARN de guía única externa e interna,
respectivamente, que se utilizan para eliminar Enh13. Las flechas negras representan los
cebadores de PCR utilizados para genotipo de embriones y ratones con la eliminación de
Enh13. Chr11, cromosoma 11. (B) Imágenes de campo brillante (BF) y hematoxilina y eosina (H&E):
secciones de E13.5 XY Enh13 + / +, Enh13 + / -, y Enh13 - / - y XX Enh13 + / +
gonads. (C) Inmunotinción de E13.5 XY de tipo salvaje, Enh13 + / - y Enh13 - / - y XX gónadas de
tipo salvaje. Las gónadas se tiñeron para el marcador SOX9 de Sertoli (verde), el marcador de
granulosa FOXL2 (rojo) y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (azul). Las gónadas de género
sexual son indistinguibles de las gónadas XX de tipo salvaje, mientras que la deleción
heterocigótica no parece alterar la morfogénesis del testículo. Escala Barras en (B) y (C), 100 mm.
Fig. 3. Enh13 regula la expresión del gen Sox9 in vivo. (A a D) Análisis de RT-qPCR de genes
implicados en la determinación del sexo gonadal masculino (Sox9, Sry , y Sf1) y femenino (Foxl2 y
Sf1) en E11.5 XY con eliminación de Enh13 y / o TES (18 somitas ). Los datos se presentan como
valores medios 2 − DDCt normalizados a la expresión del gen de mantenimiento Hprt . Los
tamaños de muestra (n) enumerados debajo de cada genotipo son los números de individuos. Las
barras de error muestran valores SEM de 2 − DDCt. Los valores de P se representan por encima de
las barras relevantes (prueba t no pareada, de dos colas en los valores de 2 − DDCt; * P ≤ 0.05, ** P
≤ 0.01, *** P ≤ 0.0 01, **** P ≤ 0.0001). WT, tipo salvaje .

Fig. 4. Enh13 está vinculado por SRY y SOX9 in vivo. (A) Una representación esquemática de las
ubicaciones de los cebadores utilizados para los experimentos de ChIP en Enh13. BS, sitio de
unión. (B) Ensayo ChIP- qPCR de crestas genitales de ratón E11.5 después de inmunoprecipitación
con anticuerpo anti- cMYC . Los datos se presentan como el nivel de enriquecimiento de las
crestas genitales negativas de SRY-MYC en relación con las crestas genitales negativas de SRY-
MYC, lo que significa que los valores superiores a 1 (marcados por la línea de puntos) representan
un enriquecimiento específico. Los cebadores utilizados abarcan el sitio de unión SRY putativo en
Enh13 y TESCO [alrededor del sitio SRY R6; ver (16)] y una región de control negativo en chr11. Los
datos son los medios ± SD (n = 2); * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, **** P <0.0005 (prueba t de
Student). (C) Ensayo ChIP- qPCR de testículos de ratón E13.5 después de inmunoprecipitación con
anticuerpo anti-SOX9. Los cebadores utilizados abarcan el supuesto sitio de enlace SOX9 en Enh13
y TESCO [alrededor del sitio SOX9 R1; ver (16)] y una región de control negativo en chr11. Los
datos son los medios ± SD (n = 3). **** P <0,0005; ns, no significativo (prueba t de
Student). Unr ab, anticuerpo no relacionado (isotipo IgG de conejo) utilizado como control. (D) -
seq chip con el uso de anticuerpo anti-SOX9 y E90 testículo bovino fetal. El bovina (bov) Enh13 se
indica mediante el recuadro gris (en vaca Bostau8 chr19: BP 60063628 a 60064165). El asterisco
denota los picos con una tasa de descubrimiento falsa de <0.05 en los dos conjuntos de datos
bovinos. Los números del eje y representan cuentas. La entrada Las pistas representan lecturas de
secuenciación de la entrada de cromatina . El gen Sox9 bovino es indicado por la flecha y es 570
kb en sentido descendente (a la izquierda) de Enh13.