La purificación, caracterización, y clonación de genes de una nueva β-galactosidasa

adaptada al frío de Erwinia sp. E602 aislado en el noreste de China.

RESUMEN los tratamientos de hidrólisis de la lactosa se realizan generalmente a

temperaturas moderadas, lo que podría causar una contaminación
Las β-galactosidasas se usan ampliamente en la industria para eliminar la
microbiana no deseada durante el tiempo de procesamiento (Katrolia et
lactosa de los productos lácteos. Se obtuvo una nueva β-galactosidasa de
al., 2011).
la cepa bacteriana Erwinia sp. E602, recién aislado en el noreste de China.
La enzima se purificó con los métodos de fraccionamiento con sulfato de
amonio, intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel para un
En los últimos años, las enzimas adaptadas al frío han generado un gran
estudio adicional de las características enzimáticas. La enzima purificada
interés en la industria láctea porque tienen algunas ventajas sobre las
tenía un peso molecular de cerca de 110 kDa. Se determinó que la
enzimas mesofílicas. Por ejemplo, tales enzimas pueden catalizar
temperatura de reacción y el pH óptimos de esta enzima eran 40 ° C y
reacciones a temperaturas más bajas, lo que podría evitar la pérdida de
7,0, respectivamente, lo que indica que esta enzima era una β-
nutrición en los alimentos y eliminar el deterioro microbiano de los
galactosidasa neutra mesófila. Además, la enzima retuvo cerca del 10% de
alimentos en gran medida (Ramli et al., 2011). Además, las enzimas
la actividad a 0 ° C, lo que también sugirió su propiedad adaptada al frío.
adaptadas al frío tienen una estabilidad relativamente alta y una
Se estudió la cinética de la β-galactosidasa, y la Km (constante de
eficiencia catalítica a temperaturas más bajas, lo que reduce el costo de
Michaelis) y Vmax (velocidad de reacción enzimática máxima) de esta
energía del procesamiento y los efectos secundarios inesperados, así
enzima fueron 0.21 mmol / L y 263.16 µmol / mg por minuto,
como la propiedad de la inactivación rápida a temperaturas moderadas
respectivamente. En este trabajo se estudiaron los efectos de los iones
(Borchert et al., 2017). El número de estudios sobre β-galactosidasas
metálicos sobre la actividad enzimática y la eficacia de la hidrólisis de la
adaptadas al frío continúa aumentando. Muchas de estas enzimas se
lactosa en la leche, así como su actividad de trans glicosilación. El gen
derivan de microorganismos de aguas frías de áreas frías, como
codificador de la β-galactosidasa se clonó para ser un fragmento de 3 kb
Pseudoalteromonas sp., Paracoccus sp. Y Rahnella sp. (Cieśliński et al.,
de longitud, que compartió a lo sumo el 81% de la identidad con las
2005; Wierzbicka-Woś et al., 2011; Fan et al., 2015).
secuencias publicadas en la base de datos de NCBI Blast (https: // blast
.ncbi.nlm.nih.gov). Los resultados de este trabajo sugieren que es una
nueva β-galactosidasa y tiene potencial para ser utilizada en el
En el estudio actual, informamos una nueva β-galactosidasa que tiene
procesamiento de lácteos y alimentos.
una actividad relativamente buena a bajas temperaturas. Esta enzima se
INTRODUCCIÓN obtuvo de la recién aislada Erwinia sp. cepa E602, que se extrajo de
suelo congelado en el área noreste de China. La β-galactosidasa se
La β-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es un tipo de glucósido hidrolasa que
obtuvo por fermentación de la cepa E602 y se purificó por salificación,
puede hidrolizar el enlace β-1,4-d-galactosídico en la lactosa. Esta enzima
diálisis, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de
se aplica en la industria láctea para eliminar la lactosa láctea y prevenir los
filtración en gel. En este trabajo investigamos la actividad y las
síntomas de intolerancia a la lactosa en seres humanos (Vincent et al.,
propiedades enzimáticas, así como la capacidad de hidrólisis de la
2013). Esta enzima también se usa ampliamente en otras áreas industriales
lactosa en la leche.
de alimentos (Panesar et al., 2010); por ejemplo, la producción de
galactooligosacáridos (GOS) utilizando β-galactosidasa parece ser
atractiva en los últimos años (Lee et al., 2017).

En la industria láctea, las β-galactosidasas utilizadas para la hidrólisis de la

lactosa son principalmente enzimas mesófilas de origen microbiano,
como las de las levaduras y los hongos (Panesar et al., 2010), por lo que
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Reactivos
Los componentes del medio, como la triptona y el extracto de levadura,
se compraron a Oxoid (Thermo Fisher Scientific, Waltahm, MA). El orto-
nitrofenil-β-dgalactopiranósido (ONPG) y el ditiotreitol se adquirieron en
Sangon Biotech (Shanghai, China). Isopropil-β-d-tiogalactopiranósido y
5-bromo-4-cloro-indolil-β-d-galactopiranósido (X-gal) se compraron en
Sigma-Aldrich (Shanghai, China). El acetonitrilo se adquirió de Sigma-
Aldrich. El marcador de proteína de peso molecular se adquirió de
Thermo Fisher Scientific. El kit de determinación de proteínas se adquirió
de Zoman Biotechnology (Beijing, China). El kit de determinación de
glucosa se adquirió de Rongsheng Biotech (Shanghai, China). Las enzimas
de restricción y la polimerasa se adquirieron de New England Biolabs
(Beijing, China). Otros reactivos fueron de grado reactivo analítico. Los
anfitriones de Escherichia coli DH5α y BL21 (DE3) fueron existencias en
nuestro laboratorio.
La β-galactosidasa comercial derivada de Aspergillus oryzae se adquirió
de Jiangsu Ruiyang Biotech Co. Ltd. (Wuxi, China). La leche utilizada para
el experimento de hidrólisis de lactosa fue leche fresca extraída de la
granja lechera local (Wuxi, China).
Aislamiento de cepa e identificación
Se tomó una muestra de suelo congelado de una granja forestal
suburbana en Qiqihar (provincia de Heilongjiang, China) y se usó para la
detección de cepas microbianas, que produjeron β-galactosidasa
adaptada al frío. El medio (triptona 15,0 g / L, peptona de soja 5,0 g / L,
K2HPO4 2,5 g / L, lactosa 2,5 g / L, extracto de levadura 3,0 g / L, NaCl
5,0 g / L, agar 15,0 g / L, pH 7,3– 7.5; TSA) se usó para el aislamiento de
las cepas diana. Se añadió una muestra de 10.0 g del suelo a 100.0 mL de
líquido TSA y se cultivó a 12 ° C con agitación a 200 rpm. Después de 48
h de cultivo, el cultivo se diluyó 10 veces y se sembró sobre la superficie
de medio TSA suplementado con lactosa (2,5 g / l, como un inductor para
la producción de β-galactosidasa) y X-gal (1,0 mg / ml), seguido de
incubación a 4 a 12 ° C durante 72 h. Las colonias azules que aparecieron
en las placas se recogieron todas y se inocularon en líquidos de TSA
suplementados con lactosa (2,5 g / L) para una investigación adicional de
las actividades de la β-galactosidasa a diferentes temperaturas. La cepa
con mayor actividad de β-galactosidasa a 10 ° C se seleccionó como la
cepa objetivo de este trabajo y se denominó E602. La morfología celular
y de colonias de la cepa diana se determinó mediante tinción de Gram y
microscopía. Para la identificación de la cepa objetivo en un enfoque
molecular, se extrajo todo el ADN genómico de la cepa E602 utilizando el
método del bromuro de cetil trimetilamonio (Healey et al., 2014). La
secuencia de ADNr 16s se amplificó luego mediante PCR utilizando el ADN
genómico completo como plantilla. Los cebadores para este experimento
fueron 27 adelante (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') y 1391 inversos
(5′-GACGGGCGGTGTGTRCA-3'). La cadena amplificada se sometió a
secuenciación de ADN en Biosune Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai,
China) para un análisis adicional. Se utilizó el programa de alineación de
secuencias en línea NCBI BLASTN2.2.26 + (Zhang et al., 2000) para
comparar y analizar la identidad de la secuencia con los datos del ARN
ribosomal 16S bacteriano. Se infirió un árbol filogenético utilizando los
datos de alineación con el software MEGA7 (Tamura et al., 2004; Kumar
et al., 2016). Para la identificación de la cepa objetivo con experimentos
fisiológicos y bioquímicos, la utilización de varias fuentes de carbono y los
resultados de la producción de ácidos de varios azúcares se probaron de
acuerdo con los métodos descritos anteriormente (Hauben y Swings,
2005).
Producción y purificación de β-galactosidasa de Erwinia sp. E602
La cepa E602 se rayó en medio TSA a 26ºC durante 24 h. Una sola colonia
de la cepa se inoculó en 5.0 ml de líquido TSA y se cultivó con agitación
a 26 ° C durante 12 h. La cepa E602 se activó en medio TSA a 26 ° C
durante 24 h. Una sola colonia de la cepa se inoculó en 5.0 ml de líquido
TSA y se cultivó con agitación a 26 ° C durante 12 h. Se tomaron partes
alícuotas del cultivo y se inocularon en una proporción de 1% (vol / vol)
en 100,0 ml de líquido TSA en un matraz y se cultivaron a 26 ° C durante
15 h. La semilla secundaria se inoculó luego en una proporción de 1% (vol
/ vol) en 5.0 L de líquido TSA suplementado con lactosa (2.5 g / L) en un
fermentador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) y se fermentó a 26 ° C
Durante 18 h con la velocidad de agitación de 200 rpm. Las células de
cultivo de la cepa E602 se recogieron y se sometieron a centrifugación a
4 ° C y 10.000 x g durante 30 min en una centrífuga Beckman Avanti J-
26xp (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) y luego se trataron con
sonicación. El sobrenadante se trató con saturación de sulfato de amonio
al 20% y luego se centrifugó a 4 ° C, 10.000 x g, durante 10 min. Después
de la centrifugación, el sedimento se descartó y el sobrenadante se llevó
a saturación de sulfato de amonio al 40%, seguido de centrifugación a 4
° C, 10.000 x g, durante 10 min. El sedimento se recogió y se disolvió en
10,0 mmol / l de PBS (pH 7,0) y se dializó a 0 ° C durante 12 h. La solución
resultante se sometió a cromatografía de intercambio aniónico, seguida
de cromatografía de filtración en gel. El proceso de cromatografía de
intercambio aniónico se realizó en un sistema purificador AKTA (GE
Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) utilizando una columna HiPrep
16/10 DEAE y se equilibró con 20,0 mmol / l de Tris-HCl (pH 7,0). La enzima
diana se eluyó con una solución (que contenía 2,0 mol / L de NaCl y 20,0
mmol / L de Tris-HCl, pH 7,0) a gradientes (vol / vol) de 10, 15, 27, 33 y
40%. La velocidad de elución fue de 5.0 mL / min. El proceso de
cromatografía de filtración en gel también se realizó en un sistema
purificador AKTA utilizando una columna HiPrep 16/60 Sephacryl S-100
(GE Healthcare). La β-galactosidasa se eluyó en 50.0 mmol / L de PBS
(150.0 mmol / L de NaCl, pH 7.0) a una velocidad de 0.5 mL / min.
Ensayo de actividad enzimática
La actividad de la β-galactosidasa se determinó como se describió
anteriormente (Xia et al., 2010) con algunas modificaciones. La solución
de sustrato de 5,0 ml (ONPG, 0,5 mg / ml, pH 7,0) se mezcló con 0,9 ml
de PBS (pH 7,0) y la mezcla se mantuvo en un baño de agua a la
temperatura óptima de la enzima durante 30 minutos. Los 100.0 µL de
enzima purificada (0.02 mg / mL) se agregaron luego a la mezcla y se
hicieron reaccionar durante 10 min. Después de eso, la mezcla de reacción
se añadió a 75,0 mg / ml de solución de Na2CO3 para terminar la
reacción. La mezcla de reacción se mantuvo luego a 25ºC durante 15
minutos, seguido de un ensayo de la absorbancia a 420 nm. Una unidad
de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que
hidroliza 1 µmol de sustrato ONPG por minuto. La actividad específica de
las β-galactosidasas se expresó en unidades por miligramo de proteína
enzimática. Este método se utilizó para la determinación de todas las
propiedades enzimáticas, excepto para los parámetros especiales
mencionados en el contexto.
Determinación de propiedades de β-galactosidasa
Los efectos de la temperatura sobre la actividad enzimática se
determinaron a temperaturas que oscilan entre 0 y 60 ° C. La
termoestabilidad de la enzima se probó mediante la incubación de la
enzima a temperaturas que oscilan entre 10 y 50 ° C durante 6 h. Los
efectos del pH sobre la actividad enzimática se determinaron a 40 ° C en
tampones que variaban en un pH de 4.0 a 9.0. El perfil de estabilidad del
pH de la enzima se determinó mediante la incubación de esta enzima a 4
° C durante 1 h en tampones PBS (pH 4.0–9.0), seguido de la
determinación de la actividad a 40 ° C en condiciones estándar. Los
efectos de estos factores se evaluaron mediante la determinación de las
actividades enzimáticas del residuo y se ilustraron como las actividades
relativas. Los efectos de varios reactivos químicos sobre la actividad
enzimática se determinaron analizando las actividades del residuo
después de incubar la enzima en 1,0 a 10,0 mmol / l de los reactivos
(disueltos en PBS, pH 7,0) a 25 ° C durante 20 min. Los cationes analizados
fueron Li +, Na +, K +, Mg2 +, Ca2 +, Zn2 +, Cu2 +, Fe2 +, Mn2 + y Pb2
+. También se examinaron los reactivos de tiol 2 mercaptoetanol y
ditiotreitol, el inhibidor enzimático ácido p-cloromercuribenzoico y el
agente quelante EDTA. La actividad relativa se estimó en los experimentos
anteriores en comparación con la actividad obtenida en el control.
Análisis cinético de la β-galactosidasa
Los parámetros cinéticos (la constante de Michaelis, Km y la velocidad
de reacción enzimática máxima, Vmax) de la β-galactosidasa se
calcularon a partir de gráficos de Lineweaver-Burk utilizando ONPG
como sustrato. La concentración de ONPG osciló entre 0,8 y 10,0 mmol
/ l. Para el análisis de los efectos de inhibición de los reactivos similares
al sustrato sobre la β-galactosidasa, las soluciones de ONPG se
agregaron con lactosa, galactosa y glucosa a concentraciones finales de
10.0, 100.0 y 100.0 mmol / L, respectivamente. Todos los experimentos
anteriores se llevaron a cabo a 40 ° C y pH 7.0.
Hidrólisis de la lactosa en la leche por la β-galactosidasa
Se agregaron quince unidades de la β-galactosidasa purificada a 5 ml
de leche fresca (que contiene 5% (peso / volumen) de lactosa). La
solución se incubó a diferentes temperaturas que oscilan entre 4 y 40 °
C durante 12 h. Cien microlitros de las partes alícuotas se retiraron cada
2 h de la incubación y la β-galactosidasa se desnaturalizó añadiendo
ácido tricloroacético al 10%. Después de la centrifugación a 4 ° C, 10.000
x g durante 15 min, los sobrenadantes se sometieron a un análisis de
concentración de glucosa para evaluar la relación de hidrólisis de la
lactosa láctea; Cada prueba se llevó a cabo en 3 pruebas separadas.
Transglicosilación de lactosa por la β-galactosidasa y el ensayo GOS
Se agregaron cuarenta y cinco unidades de la β-galactosidasa
purificada a 5,0 ml de solución de lactosa (300 mg / ml). La solución se
incubó a 40 ° C durante 12 h. Después de eso, se retiraron 0,5 ml de la
parte alícuota y se incubaron en agua hirviendo durante 2 minutos para
inactivar la enzima, seguido de la detección de GOS con LC-MS.
Clonación de la secuencia de codificación para la β-galactosidasa de
Erwinia sp. E602
El ADN genómico completo de la cepa E602 se extrajo utilizando el
método del bromuro de cetil trimetilamonio (Healey et al., 2014). El ADN
extraído fue parcialmente digerido con la enzima de restricción Sau3AI.
Los fragmentos de ADN en la digestión con Sau3AI se recuperaron
mediante la recuperación del gel con longitudes de 2 a 4 kb y luego se
subclonaron al plásmido pUC19 y al huésped de E. coli transformado
DH5α. Se seleccionaron y secuenciaron aproximadamente 1.000
transformantes positivos (de aproximadamente 3.500 colonias) de la
subclonación, en la que se seleccionaron los fragmentos de inserción de
aproximadamente 3 kb para el análisis de marco de lectura abierto (ORF).
El ORF de aproximadamente 3 kb de longitud luego se amplificó
respectivamente con PCR y se clonó en el plásmido de expresión inducible
pET28a (+) con el sitio de restricción NcoI y XhoI. Los plásmidos
recombinantes se transformaron luego en el hospedador de E. coli BL21
(DE3) y los transformantes se colocaron en placas de agar Luria-Bertani
(LB) suplementadas con kanamicina (50.0 µg / mL), isopropil-β-d-
tiogalactopiranósido (1,0 mmol / L ), y X-gal (1.0 mg / mL). Las colonias
azules se recogieron para secuenciar y verificar las secuencias de
inserción.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento e identificación de β-galactosidasa que produce Erwinia sp.
E602
El aislamiento de la cepa productora de β-galactosidasa se llevó a cabo
mediante el análisis de colonias azules de las muestras diluidas colocadas
en placas de agar selectivas, seguido de una nueva prueba de la actividad
enzimática de las colonias y las identificaciones de cepas. Un total de 80
aislados microbianos que mostraron colonias azules en placas de TSA
suplementadas con lactosa y X-gal se recogieron para los ensayos de β-
galactosidasa; 15 aislamientos produjeron β-galactosidasa activa a bajas
temperaturas (0–12 ° C). La cepa con la mayor actividad de β-
galactosidasa a 10 ° C se denominó E602. Las células de la cepa E602
tenían forma de barra, de 0,5 a 1,0 µm de ancho y de 1,0 a 2,0 µm de largo,
apareciendo individualmente o en pares, gramnegativas y no formadoras
de endoesporas. Esta cepa mostró una colonia blanca lechosa con un
poco de brillo metálico en medio TSA y tuvo un rango de temperatura de
crecimiento de 4 a 30 ° C con un crecimiento óptimo a 26 ° C. Para la
identificación de esta cepa, la secuencia codificante de su ARNr 16S se
amplificó por PCR a partir del ADN genómico de la cepa E602. El
fragmento amplificado de 1,5 kb se sometió a alineación BLAST con la
secuencia de ADNr 16S bacteriana en línea (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
El árbol filogenético (Figura 1) se obtuvo utilizando los algoritmos de
unión de vecinos en el software MEGA7. Los resultados del análisis 16S
rDNA sugirieron que la cepa E602 pertenece al género Erwinia. Para
identificar la cepa E602 a las especies, se realizaron experimentos
fisiológicos y bioquímicos para probar la utilización de varias fuentes de
carbono y la producción de ácido de varios azúcares. Los resultados se
enumeraron en la Tabla 1. Según las características diagnósticas
publicadas por estudios previos (Hauben y Swings, 2005; Thapa et al.,
2012), se sugirió que la cepa E602 era Erwinia rhapontici. Esta especie es
una bacteria patógena condicional de la nucleación del hielo para las
plantas, y rara vez se informa en China (Wang et al., 2017). Como la
relación filogenética entre E602 y E. rhapontici no fue tan obvia, la cepa
E602 todavía no se puede determinar finalmente como una especie de E.
rhapontici. Sin embargo, este trabajo podría ser el primer estudio
enzimático detallado sobre la β-galactosidasa obtenido del género
Erwinia.
Producción y purificación de β-galactosidasa de Erwinia sp. E602
Cultivamos la cepa E602 con inducción de lactosa para la producción
de β-galactosidasa. La enzima producida se trató primero con
precipitación con sulfato de amonio y luego la enzima diana se purificó
aún más mediante separaciones en 2 etapas: cromatografía de
intercambio aniónico y cromatografía de filtración en gel (los resultados
se enumeran en las Figuras Suplementarias S1 y S2; https://doi.org/
10.3168 / jds.2018-14605). La elución correspondiente al pico único se
recogió para el ensayo de actividad enzimática β-galactosidasa. Los
procedimientos de purificación y los resultados de la enzima se
resumieron en la Tabla 2, que representó las actividades específicas y
los pliegues de purificación en los pasos. Después de estos
procedimientos de purificación, la actividad enzimática final alcanzó
177.00 U / mg de proteína con una pureza de más de 100 veces la
muestra original. Las muestras de enzimas de cada etapa de purificación
se sometieron a un análisis de SDS-PAGE al 12% y la β-galactosidasa
final purificada mostró una banda única de aproximadamente 110 kDa
(Figura 2).
Perfiles de temperatura y pH de β-galactosidasa
El efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática se estudió a
temperaturas que oscilan entre 0 y 60 ° C a pH 7.0. La enzima purificada
mostró la actividad máxima a 40 ° C (Figura 3A), que es similar a la
temperatura de reacción óptima de la β-galactosidasa adaptada al frío
de Pseudoalteromonas sp. 22b (Turkiewicz et al., 2003). Además, la
enzima en este trabajo retuvo cerca del 10% de la actividad a 0 ° C y
aproximadamente el 15% de la actividad a 10 ° C (Figura 3A), lo que
sugiere una propiedad adaptada al frío de esta enzima. La
termoestabilidad de la enzima se determinó mediante incubación a 10,
20, 30 y 40 ° C durante 6 h (Figura 3B). Los resultados mostraron que
más del 85% de la actividad enzimática permaneció después de 6 h de
incubación a 10 ° C, y aproximadamente el 85% permaneció después de
1 h de incubación a 40 ° C. La semivida enzimática de la β-galactosidasa lactosa era el sustrato natural de esta enzima. La Ki para lactosa y
a 10, 20, 30, 40 ° C fue de 13, 11, 8 y 7 h, respectivamente. También se galactosa fue de 7.00 y 36.84 mmol / L, respectivamente.
probó la termoestabilidad de la enzima a 50 ° C (figura no mostrada) y
Prueba de hidrólisis de lactosa en leche y transglicosilación por β-
la vida media de la enzima a esta temperatura fue de 2 min. Después
galactosidasa
de la incubación de la enzima a 50 ° C durante 15 min, la enzima se
inactivó casi por completo. La capacidad de hidrólisis de la lactosa de la β-galactosidasa purificada
de la cepa E602 se probó con leche fresca a diferentes temperaturas
Los perfiles de pH de la enzima se muestran en la Figura 4.mLa enzima
(Figura 6). Los resultados mostraron que la relación de hidrólisis de
mostró su actividad enzimática máxima cerca de pH 7.0 y retuvo más
lactosa en la leche alcanzó el 60% después de 12 h de hidrólisis a 30 °
del 80% de su actividad en el rango de pH de 6.5 a 7.5 (Figura 4A), lo
C. Cuando la reacción se llevó a cabo a 40ºC, se necesitaron 8 h para
cual es una buena propiedad con respecto al procesamiento de leche
hidrolizar el 50% de la lactosa. La velocidad de hidrólisis fue lenta a
porque el pH de la leche está cerca de 6.7. El ensayo de estabilidad del
temperaturas por debajo de 20 ° C, pero la relación de hidrólisis de
pH mostró que esta enzima era estable en el rango de pH de 5.0 a 8.0
lactosa a 4 ° C todavía alcanzó el 5,4% después de 12 h de reacción, lo
(Figura 4B). La actividad enzimática relativa se mantuvo
que indica que la reacción de hidrólisis se puede realizar durante las
aproximadamente 55% a pH 4.0 y más de 80% a pH 9.0, que es
etapas de transporte y almacenamiento de la cadena de frío de la leche,
ligeramente mejor que la β galactosidasa adaptada al frío nativa de
que Podrían realizar partes de las tareas de hidrólisis de la lactosa. En
Pseudoalteromonas sp. 22b (Cieśliński et al., 2005). Una comparación en
consideración a la rápida inactivación de la enzima a 50 ° C, la capacidad
la actividad específica, la temperatura y los perfiles de pH de esta
de hidrólisis de la lactosa a temperaturas más bajas es una buena
enzima con los de las otras β-galactosidasas adaptadas al frío (incluida
propiedad para el proceso de hidrólisis de la lactosa real. La reacción
una enzima comercial utilizada en la planta lechera local) se incluye en
de hidrólisis se puede realizar a temperaturas moderadas y se puede
la Tabla 3. Los resultados mostraron que la β- La galactosidasa obtenida
terminar por completo en los procesos de pasteurización o UHT; por lo
en nuestro trabajo tenía propiedades similares a las otras enzimas
tanto, la relación de hidrólisis se puede controlar fácilmente para
enumeradas y fue incluso ligeramente mejor que la comercial.
mantener la calidad uniforme de la leche procesada.

La β-galactosidasa purificada de la cepa E602 se usó para la prueba de

Efectos sobre la actividad enzimática de la β-galactosidasa reacción de trans-glicosilación con el sustrato lactosa y el GOS
producido se analizó mediante LC-MS. La muestra de estándar de
De acuerdo con los resultados enumerados en la Tabla 4, los cationes
lactosa y la solución de hidrólisis de lactosa se mostraron en las Figuras
Li +, K + y Mg2 + activaron la actividad enzimática, mientras que Cu2
suplementarias S3 y S4, respectivamente
+, Fe2 + y Pb2 + inhibieron la actividad enzimática. Los inhibidores de
(https://doi.org/10.3168/jds.2018-14605). Se determinó que el
la enzima mostraron inhibición contra la enzima, mientras que los
componente que mostró un pico a las 12.46 min en la Figura S4 es un
reactivos de tiol revelaron algunos efectos de promoción. El agente
tipo de trisacárido, y su peso molecular fue 504 (Figura Suplementaria
quelante EDTA también inhibió la actividad enzimática. Los parámetros
S5; https://doi.org/10.3168/jds.2018 -14605). Estos resultados mostraron
de la enzima cinética para ONPG y otros inhibidores de tipo sustrato se
que esta β-galactosidasa puede transformar efectivamente la lactosa en
calcularon a partir del gráfico de Lineweaver Burk (Figura 5). Los valores
GOS.
de Km y Vmax para ONPG fueron 0.18 mmol / L y 263.16 µmol / mg por
minuto, respectivamente. Los inhibidores de tipo sustrato, la lactosa (10 Clonación de genes de β-galactosidasa de Erwinia sp. E602
mmol / L), la glucosa (100 mmol / L) y la galactosa (100 mmol / L) se
De acuerdo con los resultados del análisis SDS-PAGE, la β-galactosidasa
agregaron a la solución del sustrato para determinar los valores de Ki
tenía un peso molecular de aproximadamente 110 kDa (Figura 2), que
de la constante de inhibición. Los resultados mostraron que la lactosa y
correspondía a las bases de ADN de aproximadamente 3 kb. La
la galactosa tenían efectos inhibidores competitivos contra ONPG,
biblioteca de digestión de restricción parcial se construyó para probar
mientras que la glucosa tenía poco efecto. La actividad inhibitoria de la
el gen codificador de la β-galactosidasa. Las secuencias de codificación
lactosa fue mayor que la galactosa, lo que podría deberse a que la
obtenidas (ORF de aproximadamente 3 kb de longitud) se verificaron
mediante prueba de expresión recombinante en agar selectivo. El gen
de codificación de la enzima se obtuvo, se secuenció y se envió a
GenBank (Número de acceso: MG822787). Los resultados mostraron
que el gen codificador de la β-galactosidasa, denominado lacZ en este
trabajo, tenía una longitud de 3.084 pb. Analizado con la herramienta
NCBI Blast, este gen compartió como máximo el 81% de identidad con
otros genes en la base de datos, y su secuencia AA expresada (putativa)
solo compartió el 77% de identidad con la β-d-galactosidasa de E. coli
K-12 subs. MG1655. Estos resultados indicaron que este gen es
completamente nuevo; Así, la β-galactosidasa obtenida en nuestro
trabajo es nueva.

CONCLUSIONES

Erwinia es una bacteria gramnegativa que puede utilizarse para la

producción de enzimas y aditivos para la industria alimentaria (Ren et
al., 2011); Este género no es patógeno para animales y seres humanos.
En este trabajo, una cepa productora de β-galactosidasa, Erwinia sp.
E602, se aisló del suelo congelado en el noreste de China, lo cual fue
sorprendente porque el género Erwinia rara vez se reporta en China. La
β-galactosidasa producida por Erwinia sp. E602 se purificó
eficientemente y se estudió exhaustivamente. El gen de codificación
para esta enzima tenía 3.084 pb de longitud, y el análisis genético
mostró que el gen y la enzima eran completamente nuevos. La
temperatura de reacción óptima de la enzima es de 40 ° C y su pH
óptimo es de 7.0. La termoestabilidad de la enzima fue buena de 10 a
40 ° C, y esta enzima fue estable en el rango de pH de 5.0 a 8.0. Esta
enzima mostró propiedades adaptadas al frío en las reacciones y se
pudo inactivar inmediatamente a 50 ° C. Los iones metálicos Li +, K + y
Mg2 + activaron la actividad de la enzima y Cu2 +, Fe2 + y Pb2 +
inhibieron la actividad de la enzima. La Km y Vmax de esta β-
galactosidasa fueron 0.184 mmol / L y 263.16 µmol / mg por minuto,
respectivamente, utilizando ONPG como sustrato. Otros resultados
experimentales también indicaron que esta enzima es adecuada para la
hidrólisis de la lactosa y la producción de productos lácteos bajos en
lactosa. El trisacárido se formó de manera eficiente durante el proceso
de hidrólisis de la lactosa, de modo que esta enzima también se puede
aplicar para la producción de GOS. En general, esta nueva β-
galactosidasa tiene potencial para ser utilizada en el procesamiento de
lácteos y alimentos.