EXTRACCIÓN DE ADN Y ESTUDIO DE ALGUNAS DE SUS PROPIEDADES

RESUMEN

En esta práctica se realizó la extracción de ADN a partir de un material vegetal (levadura de trigo).
El material se maceró utilizando arena y fue tratado con una solución salina con EDTA y SDS más
calentamiento, perclorato de sodio y una mezcla cloroformo-alcohol isoamilico. Además, se
analizaron los fenómenos de desnaturalización (parcial o total) del ADN por efecto del pH y la
temperatura, seguido por espectroscopia de absorción UV a una longitud de onda de 260 nm. Se
encontró que al aumentar la temperatura, se generó una degradación (total o parcial) del material
genético reflejado en un aumento de las medidas de absorbancia. Sin embargo al estudiar el efecto
del pH sobre la estabilidad del ADN, no se visualizó un fenómeno acorde a lo reportado en la
literatura (efecto hipercrómico).

FUNDAMENTO TEÓRICO

DESNATURALIZACIÓN DEL ADN

Un comportamiento característico observado en las disoluciones de ADN, cuando son calentadas a

partir de 80º o sometidos a pH alcalino o ácido, es una repentina pérdida de viscosidad, acompañada
de un aumento de la absorbancia a 260 nm. Este fenómeno se denomina desnaturalización o fusión
porque tiene lugar bruscamente, a partir de una temperatura determinada. Se produce a causa de
la rotura de los enlaces de hidrógeno que mantienen apareadas a las bases nitrogenadas, y de la
alteraciones hidrofóbicas entre ellas, lo que conduce a una separación total o parcial de los
filamentos de ADN, obteniéndose hebras separadas en toda su extensión (desnaturalización total)
o en parte (desnaturalización parcial), sin que se vea alterado el esqueleto covalente formado por
lo enlaces entre el ácido fosfórico y la desoxirribosa.

Se denomina temperatura de fusión, Tm, a la temperatura que provoca, en una disolución de ADN,
la desnaturalización de la mitad de la doble cadena, proceso que puede seguirse, midiendo el
incremento de la absorbancia que tiene lugar (efecto hipercrómico), a medida que van
desapareándose las bases. No todas las moléculas de ADN experimentan el fenómeno de
desnaturalización de igual manera, por el contrario, depende de la composición de bases. Las
cadenas con una alta proporción de pares G-C muestran temperatura de fusión más elevada que las
que poseen proporciones inferiores. La temperatura de fusión del ADN, en la mayoría de las
especies, varía linealmente entre 70-100º, cuando la proporción de G-C sobre el total de
nucleótidos aumenta entre el 20-80%. La explicación a este comportamiento en la mayor estabilidad
de las uniones G-C con tres puentes de hidrógeno, frente a las de A-T que poseen dos. De ello se
deduce que las regiones en la cadena de ADN, ricas en pares A-T son las primeras en
desnaturalizarse. Estos fenómenos de separación de filamentos tienen lugar, en las células vivas,
durante los procesos de transcripción o replicación del ADN, y su iniciación debe coincidir con
secuencias ricas en pares A-T. Por lo tanto, la absorbancia de un polinucleótido totalmente
desordenado no es muy diferente de la suma de las absorbancias de sus constituyentes purínicos y
pirimidínicos.
El ADN también puede desnaturalizarse a valores de pH superiores a 11.3, pues la desprotonación
de los grupos N-H impide su participación en enlaces de hidrógeno. A menudo se prefiere la
desnaturalización alcalina en lugar de la desnaturalización térmica para evitar la ruptura de enlaces
fosfodiésteres que puede producirse a elevadas temperaturas o a bajo pH. También puede
inducirse desnaturalización a bajas fuerzas iónicas, a causa del aumento de la repulsión entre los
fosfatos cargados negativamente de las dos hebras, y por la acción de diversos compuestos
desnaturalizantes, (compuestos que pueden formar eficazmente enlaces de hidrógeno con las bases
y a la vez impedir las interacciones de apilamiento hidrofóbicas) puede obtener una curva de
desnaturalización completa, similar a la que se muestra en la figura 1, a temperatura constante
relativamente baja aumentando la concentración de un desnaturalizante tal como la urea.

Figura 1. Perfil de temperatura-densidad óptica del ADN

Si la desnturalización no es completa, es decir, si permanecen algunas bases formando puentes de

hidrógeno entre las dos hebras, la transición de hélice a ovillo puede revertir rápidamente. La
renaturalización es posible incluso después de la separación completa de las dos hebras
complementarias, en estas condiciones el proceso de renaturalización depende la coincidencia
exacta entre las hebras complementarias del ADN de modo que se puede volver a formar la
estructura original.

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PROCEDIMIENTO
Se pesó 5 gramos de germen
de trigo y 10 g de arena lavada
y se colocó en un mortero
previamente enfriado y se pasó
a moler vigorosamente
durante 5 minutos
Se transfirió esta mezcla a dos
tubos de centrifuga a una
velocidad de 5000 rpm por 10
minutos.
Se retiró con cuidado la capa
acuosa superior con una pipeta
Pasteur, procurando no tomar
el precipitado presente en la
interface.
Esquema 1. Proceso de extracción de ADN a partir de una muestra de levadura
Se vertió el homogenizado en
un erlemeyer con tapa y se
agregó 30 ml de solución salina
con EDTA
Se agregó 40 ml de
Cloroformo: Alcohol isoamílico
(24:1) y se agitó por 15
minutos con el erlemeyer
tapado.
Se colocó en un erlemeyer de
250 ml y se agregó lentamente
70 ml de etanol a la solución
Se leyó la absorbancia de la
soluciòn a 260 nm, realizando
las diluciones necesarias
Se agitó y agregue 2 ml de
dodecil sulfato de Sodio (SDS) y
se llevó rápidamente a un baño
maría a 60°C durante 10
minutos
Se enfrió a temperatura
ambiente), y se agregó 5 ml de
perclorato de Sodio
sobresaturado (6M),
mezclando continuamente
Se mezcló, suavemente con
una varilla de vidrio,
recolectando el material
fibroso.
Se disolvió el ADN en 2-4 ml de
agua con 0.2 ml de buffer
salino EDTA. Mida el volumen
final.
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 Se preparó una dilución de
la muestra de ADN,
tomando 2 mL de solución
de ADN y aforando a a un
volumen final de 20mL
Se midió la absorbancia a
260 nm, empleando un
blanco para ajustar el 0% de
absorbancia
Esquema 2. Estudio del Efecto del pH en la estabiliadad del ADN
Se preparó una dilución de
la muestra de ADN,
tomando 2 mL de solución
de ADN y aforando a a un
volumen final de 20mL
Esquema 3. Estudio del Efecto del pH en la estabilidad del ADN
CÁLCULOS Y RESULTADOS
A partir de la solución
preparada, tomo 1,5 mL y se
vertió en 6 tubos de ensayo
cada uno con 1,5 mL de
buffer borato 0,05M
Finalmente a cada tubo se
añadió una buffer pH de 8,5
hasta 12,5 mL
A partir de la solución
preparada, tomo 1,5 mL y
se vertió en 6 tubos de
ensayo cada uno con 1,5 mL
de buffer borato 0,05M y
Se midió la absorbancia a
260 nm de cada una de las,
empleando un blanco para
ajustar el 0% de
absorbancia
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Cálculo de la concentración de ADN

µ𝑔𝐴𝐷𝑁
50
𝐶 = 𝐴260𝑛𝑚 ∗ 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 ∗ 𝑚𝐿
1 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐴260𝑛𝑚

µ𝑔𝐴𝐷𝑁
50
𝐶 = 1,242 ∗ 10 ∗ 𝑚𝐿
1 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐴260𝑛𝑚

µ𝑔𝐴𝐷𝑁
𝐶 = 621
𝑚𝐿

Cálculo de la Cantidad de ADN

µ𝑔
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐴𝐷𝑁 = [𝐴𝐷𝑁] × 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑚𝑙)
𝑚𝐿

µ𝑔𝐴𝐷𝑁
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐴𝐷𝑁 = 621 × 3,2 𝑚𝑙
𝑚𝐿
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐴𝐷𝑁 = 1987.2 µ𝑔

Cálculo de pureza

𝐴260𝑛𝑚
𝑝𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 =
𝐴280𝑛𝑚

1.242
𝑝𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 =
0.618

𝑝𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = 2.009

EFECTO DEL CALENTAMIENTO

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 Absorbancia Vs Temperatura

0,85
0,8
Absorbancia

0,75
0,7
0,65
0,6
0,55
65 70 75 80 85 90
Temperatura °C

Figura 2. Variación de la absorbancia en función de la temperatura (λ=260 nm)

EFECTO DEL PH

Absorbancia Vs pH

1,5
Absorbancia

0,5

0
7 8 9 10 11 12 13
pH

Figura 3. Variación de la absorbancia en función del pH (λ=260 nm)

ANÁLISIS DE RESULTADOS

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En la figura 2 se puede observar el efecto de la temperatura sobre la estabilidad del ADN extraído,
observando que a medida que se aumentaba la temperatura se aumentaba igualmente la
absorbancia. Este incremento en los valores de absorbancia, es producto de la degradación (parcial
o total) de la estructura del ADN, rompiendo los puentes de hidrógeno que mantenían unidas las
dos hebras complementarias, este fenómeno se conoce como fusión del ADN.

A partir de los resultados obtenidos no se pudo establecer con certeza el valor de la temperatura
de fusión debido al bajo control de la temperatura de los baños termostatados. Es posible que la
temperatura descendiera antes de producirse la completa separación de las dos hebras,
recuperando la estructura nativa del material genético.

Por otro lado, al estudiar el efecto del pH sobre la estructura del ADN, (ver figura 3) no se pudo
visualizar el fenómeno de desnaturalización de ADN a partir de los datos obtenidos. Esto se debe
principalmente a errores en la medición de la absorbancia, generando inconsistencia con los
valores reportados en la literatura. Se esperaba que al llegar a valores de pH superiores a 11,3 la
desprotonación de los grupos N-H impidiera su participación en los enlaces de hidrógeno y
generara así un aumento en los valores de absorbancia. Este fenómeno es llamado efecto
hipercrómico.

PREGUNTAS

1. Diga cual ADN tiene mayor Tm? ADN con GC = 63% o ADN con GC =41%

Se tiene en cuenta que en el ADN con GC=63% las dos bases nitrogenadas forman tres puentes
de hidrógeno los cuales aumentan la interacción intermolecular significativamente por lo que se
incrementa la Tm siendo así el ADN con mayor Tm el de GC 63%.

2. ¿Qué función desempeña el SDS, Cloroformo, Alcohol isoamílico, Perclorato de Sodio, EDTA en
la extracción de ADN?

El SDS es un tensoactivo el cual se utiliza para desnaturalizar proteínas posibilitando la extracción y

purificación del ADN con solventes orgánicos. El EDTA es un agente quelante el cual quela los iones
de los cofactores y demás iones asociados tanto de la célula como de las proteínas.

3. Como se puede purificar el ADN de un extracto de levadura?

La purificación del ADN puede realizarse usando métodos variados como métodos
cromatográficos, ya sea cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía por afinidad o

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cromatografía de intercambio iónico. Otra técnica de purificación es la electroforesis la cual no solo
se puede emplear para la purificación sino también para la caracterización del ADN.

CONCLUSIONES

 Se pudo solubilizar el ADN en forma de sal sódica utilizando una solución de perclorato de sodio.
Igualmente se logró precipitar el ADN extraído por adición de etanol en forma de micelas elásticas
blancas, obteniendo una concentración final de 621 μg/mL .

 Se observó un aumento de los valores de absorbancia mientras aumentaba la temperatura. Sin

embargo no se pudo establecer con exactitud la temperatura de fusión del ADN extraído.

 Se valoró la pureza del ADN en la disolución calculando el cociente de absorbancia a 260

nm/280nm. Se considera que el valor de pureza calculado se encuentra muy cerca al rango
óptimo de pureza (1.7-2); dicho valor fue de 2.009 lo que indicaría que se realizó una buena
extracción pero posiblemente se encontraba contaminada por algunas sustancias como el etanol.

BIBLIOGRAFÍA

 DEVLIN, Thomas M. Bioquímica, libro de texto con aplicaciones químicas. 4 ed. Barcelona:
Editorial Reverté, 2004, pag. 41-43

 GARRIDO PERTIERRA, Amando. TEIJÓN RIVERA, José María. BLANCO GAITAN, Dolores.
VILLAVERDE GUTIÉRREZ, Carmen. MENDOZA OLTRAS, Carlos. RAMÍREZ RODRIGO, Jesús.
Fundamentos de Bioquímica Estructural. 2 ed. Madrid. Editorial Tébar, 2006, pag. 278-279

 CANO, Herminsul. Manual de Laboratorio de Bioquímica. Universidad Industrial de Santander.

2008. Pags 41-45.