Imunologie curs 7

Populatiile limfocitare si markerii lor de suprafata

Exista 2 tipuri de limfocite:

1. Mici -> 80-85% din limfocitele periferice. Acestea sunt de fapt LB si LT.

Diametru intre 6-9 microni, nucleu voluminos, raport nucleocitoplasmatic supranumerar.

2. Mari -> 15-20% din total.

Nuclei voluminosi, citoplasma abundenta. Prezinta granulatii abundente si foarte voluminoase, motiv
pentru care, ele au primit initial si numele de LGL(Large Granular Lymphocytes). Diametru intre 10-16
microni. Sunt de fapt limfocitele NK si K implicate in raspunsurile innascute in special.

MO nu permite diferentiere.

Prin anii 70-80 a fost descoperit Testul Rozetarii, ce permitea diferentierea intre LT si LB -> Se separa
limfocitele sangvine printr-un anumit regim de centrifugare. Apoi sunt puse in contact cu eritrocite de la
oaie. Aceste eritrocite vor forma legaturi doar cu limfocitele T, mai exact, eritrocitele se vor aseza pe
suprafata LT precum petalele unei flori(rozete => numele sugestiv). Aceasta se datoreaza faptului ca LT
are receptorul CD2 (pentru adeziune), spre deosebire de LB care nu au.

Test sigur, simplu, ieftin.

Ulterior,s-a descoperit ca LT separate din testul rozetarii au roluri diferite =>

subtipuri(heterogenitatea).

Pentru a face diferenta intre subtipuri => Anticorpi monoclonali specifici pentru fiecare tip de
receptor de pe membrana limfocitului. Acesti anticorpi monoclonali sunt obtinuti in prealabil prin
hibridizare si ulterior marcati cu o substanta fluorescenta => Pusi in contact cu limfocitele => Marcarea
proteinei specifice de pe limfocit => Microscopie imunofluorescenta.

Aceasta tehnica se numeste citometrie in flux(flowcitometry).

Prin aceasta => Existenta Th, Tc, Treg(Tsupresoare si Tcontrasupresoare).

Caracteristici

- Limfocitele T sunt intens recirculante => Mult mai circulante decat LB. Undeva in jur de 60% din
limfocitele circulante sunt LT
- Au o durata lunga de viata(de la ani, la zeci de ani sau chiar toata viata, daca LT respectiv are
memorie).
- Se diferentiaza de LB prin testul rozetarii si se diferentiaza intre ele prin citometrie in flux.
Markerii(sau receptorii) de suprafata = Caracteristicile fenotipice LT

In functie de acestea, exista 3 categorii mari de receptori:

1. Receptorii de recunoastere antigenica

a. Complexul TCR-CD3
b. Receptorii CD4 sau CD8
2. Receptori cu rol accesor in activarea metabolica
a. Receptorii CD28
b. Receptorii CD45
3. Receptorii de adeziune intercelulara
a. Receptorii CD2
b. Receptorii LFA1

Complexul TCR-CD3(Recunoastere antigenica)

Un LT in repaus are in jur de 60000 cupluri TCR-CD3. Acest numar creste foarte mult cand LT a
fost activat.

TCR este un heterodimer, glicoproteina transmembranara formata din 2 lanturi diferite(alfa si

beta). Aceste lanturi sunt asezate paralel(au extremitatile NH2 afara si –COOH in interior)

Lantul alfa are cca 45kDa(nu trebuie sa retinem asta). Gena pentru lantul alfa este pe
cromozomul 14.

Lantul beta are cca 40kDa, iar gena este pe cromozomul 7.

Aceste lanturi alfa si beta trebuie sa fie bine legate intre ele => Legaturi covalente de sulf(Punti
disulfidice intre cele doua lanturi).

Fiecaruia dintre lanturi i se descride un segment extracelular, transmembranar si intracelular.

Segmentul extracelular => Formeaza doua domenii asezate fata in fata(formeaza “cavitate”).
Aminoacizii sunt variabile => segmente hipervariabile numite Valfa si Vbeta. Acestea sunt urmate de a
doua cavitate cu aminoacizi constanti => segmente constante numite Calfa si Cbeta.

In prima cavitate(Valfa-Vbeta) va intra epitopul cu MHC prezentat de pe APC(Fig. 1).

 Fig. 1(TCR) Fig. 2(TCR marit => structuri noi vizibile)

S-a observat ca aminoacizii continuti in buclele variabile nu sunt asezati liniari, ci in interiorul
lantului mai exista 3 foldari(impachetari). Toti acesti aminoacizi sunt aproximativ 110 atat in Valfa cat si in
Vbeta.

Uimitor ca legatura cu epitopii si MHC nu se face cu toti 110 aminoacizi, ci cu aminoacizii din
varfurile plicaturii(Fig. 2, hasurat). Acestia sunt intre 8-15AA.

Toti 110 de AA de pe alfa + cei de pe beta se numesc Situs Combinativ pentru antigen(SGAg).

Fiecare spatiu dintre plicaturi se numeste CDR. Totalitatea celor 6 CDRuri constituie Paratopul.
Acesta este partea din situsul combinativ implicat in recunoasterea antigenica.

De pe APC vine “cosuletul” reprezentat de MHC si se fixeaza pe CDR1 si CDR2 din TCR de pe
fiecare lant(alfa si beta). Se fixeaza prin complementaritate structurala.

Se vor fixa aici domeniile variabile ale moleculelor MHC. Adica, domeniile alfa1, alfa2 din MHC I
si alfa1, beta1 din MHC II.

Epitopul va fi prezentat aici si se va lega de CDR3.

Valfa contine 110AA dintre care (8-15)x3 si 65 AA fara legaturi cu rol structural(au cu certitudine
un rol functional, dar nu stim.. ce pacat..).

Buclele Calfa si Cbeta au o constanta relativa in LT si iarasi nu stim prea multe despre functia lor.
 Zona de la sfarsitul domeniilor constante pana la membrana se numeste zona balama din TCR. E
dotata cu o maxima flexibilitate in asa fel incat TCR e o structura care baleiaza in toate structurile
spatiului cautand antigene si epitopi.

Segmentul transmembranar => Intre 20-25 AA si are rol de transmitere a informatiei prin
structurile membranare si citoschelet. Informatia disemineaza spre plutele lipidice.

Segmentul intracelular => Neasteptat de scurt, 5-12 AA . Nu se poate articula pe enzimele

citosolice. Nu poate transmite singur informatia catre enzime => e nevoie de CD3.

Functiile receptorului TCR

- Face recunoasterea antigenica asociativa intrareceptoriala(= dubla restrictie)

- Genereaza niste semnale activatoare, care sunt permanent modulate(modulare realizare prin
adaptare permanenta a celor 6 CDRuri la conformatia MHC + epitop)
- Semnalele generate prin TCR pot sa ajunga la membrana(preluate de membrana LT), dar nu pot
ajunge la enzimele din citosol => E nevoie de structura CD3.

Exista o diferenta de flexibilitate intre Hinge-ul de la BCR(mai mare) fata de TCR. Daca nu ar fi
flexibil TCR, s-ar rupe imediat de pe membrana. Nu uita ca TCR poate recunoaste si MHC II(studii din
ultimii ani).Nici o proteina nu e fixa!

Structura CD3

Este un heteropentamer, are un manunchi de 5 lanturi ce inconjura TCR-ul. Prezinta lanturile

gama, delta, epsilon, zeta1, zeta2.

Gama, delta, epsilon sunt scurte. Zeta sunt cele mai adanci. Toate aceste lanturi sunt solidarizate
intre ele si cu lanturile alfa si beta din TCR prin punti disulfidice(covalent).

S-a constituit in acest moment un ansamblu heptameric. Gama, delta si epsilon din CD3 + doua
lanturi zeta lungi care intra cel mai mult in citosol.

Pe lanturile din CD3 exista niste regiuni(domenii) numite ITAM(motive imunomodulatoare ale
LT). Aceste ITAM sunt domenii bogate in tirozina. Sunt mai frecvente pe lanturile zeta.

“Imaginati-va niste beculete care sunt ba aprinse ba stinse. Cand MHC nu face contact cu TCR => nu se
transmite nici un semnal prin TCR-CD3 => Beculete stinse. Invers => Beculete aprinse. NU SCRIETI ASA
LA EXAMEN!”

Domeniile ITAM preiau aceasta schimbare de oscilatie. Activarea ITAM este imediat sesizata in
citosol de enzime => Semnalizarea intracelulara. Rol de amplificare a semnalului.

Concluzie: Prin numarul mare de lanturi si de domenii ITAM, CD3 realizeaza o amplificare a
semnalului venit prin TCR si o transmitere spre enzimele citosolice.
Receptorii CD4/CD8 (Recunoasterea antigenului)

Sunt glicoproteine transmembranare, care vor recunoaste doar moleculele MHC.

Receptorii CD4 -> Glicoproteine transmembranare, mai mari, in jur de 60kDa, gena lor este
aflata pe cromozomul 12. Acest CD4 e localizat pe membranele tuturor LTh => Marker pentru LTh.

Acest CD4 e prezent si pe 10% din LTc(dar NU e definitoriu!).

Are extremitatea –NH2 la exterior si –COOH la interior. In segmentul extracelular e un singur lant,
care face 4 bucle(domenii), notate de la amino(D1, D2, D3, D4).

Pe D1 se fixeaza moleculele MHC II. Mai exact pe domeniul monomorf(constant) alfa2.

Daca molecula MHC II este vida(nu are epitopi), prin receptorul CD4 se transmite un semnal
inhibitor spre interiorul LT.

Daca molecula MHC II este ocupata(cu un epitop specific pentru LT), semnalul care porneste prin
CD4 doar asigura LT ca MHC II este self. Dupa acest semnal urmeaza semnalul prin TCR care va activa
celula.

Receptorii CD8 -> Glicoproteina transmembranara de 78kDa, gena este pe cromozomul 2.

Acest receptor CD8 e prezent pe celelalte 90% din LTc. Marker definitoriu pentru LTc.

Format din 2 lanturi, alfa si beta. La extremitate constituie o cavitate(bucla din alfa si beta) in
care va intra domeniul monomorf alfa3 din MHC I.

Daca MHC I e vid => LTc e blocat. Daca MHC I e ocupat => se stabileste gradul de self al moleculei
MHC I.

Concluzii

- Receptorii TCR-CD3 si CD4/CD8 realizeaza o recunoastere asociativa de 2 tipuri:

a. Intrareceptoriala(TCR-CD3)
b. Interreceptoriala(TCR-CD4 recunosc simultan moleculele MHC, iar TCR recunoaste si epitopul)
- Receptorii TCR stabilesc 4 contacte cu moleculele MHC prin doua CDR1 si doua CDR2 si stabilesc
doua contacte cu epitopii prin cele doua CDR3. Receptorii CD4/CD8 mai stabilesc cate un contact
cu MHC => 5 contacte cu moleculele MHC si 2 contacte cu epitopul.
- Prin recunoasterea riguroasa a moleculelor MHC, LT exerseaza permanent toleranta imunologica
fata de self.
- Recunoasterea antigenica a LT este MHC restrictiva.

In ultimii ani au fost descoperite LT fara memorie cu o actiune limitata.

Receptorii cu rol accesor in activarea metabolica(2)

Receptorul CD28 este si el o glicoproteina transmembranara ce are in jur de 58kDa si e format

din 2 lanturi identice(homodimer). E localizat doar pe membranele Th si Tc. NU e prezent pe Treg.

Cand APC-ul a fost activat prin receptor Toll => B7 de pe APC recunoscut de CD28 => Co-
stimularea.

Primul semnal e prin TCR, dar e insuficient => acest al doilea semnal pentru activarea completa a
LT.

Singura diferenta a acestui cuplu este urmatoarea – B7 nu e de la inceput(apare doar prin

stimularea cu Toll).

Receptorul CD45 este o glicoproteina transmembranara foarte mare, 150-170kDa. E prezent

pe toate limfocite, dar in special pe membranele LT.

Acest receptor e important prin SIC. Aceasta structura uriasa e importanta prin regiunea
intracelulara care are rol de PTP(protein-tirozin-fosfataza). Se leaga pe domeniile ITAM(cele cu tirozina
precizate mai sus), mai ales pe lanturile zeta din CD3.

Rol esential in activarea stimulului in momentul de declansare.

Receptorii de adeziune intercelulara(3)

Acesti receptori actioneaza permanent(si cand MHC nu are epitopi).

Receptorul CD2 e o glicoproteina de 50kDa, prezent pe toate LT. In numarul cel mai mare e pe
LTnaive.

Ligandul acesteia este LFA3(CD58) de pe APC. Aceasta legatura constituie cuplul de adeziune
intercelulara de linia I (CAIC I). Aceste cupluri au afinitate medie si se formeaza oricum, deoarece
membranele “se cauta”.

Receptorul LFA1 e in numar mic pe limfocitele naive, numarul crescand cand limfocitele se
activeaza metabolic.

Ligandul este ICAM de pe APC => Cuplul de adeziune intercelulara de linia a II-a(CAIC II) ce sunt
mai puternice, cu afinitate mai mare intre cele doua celule.

Functii(sistematizare)

- Prin aceste cupluri de adeziune se realizeaza o supraveghere imunologica permanenta de catre

LT asupra APCului
- Aceste cupluri permit contacte foarte apropiate intre cele doua membrane, pe modelul
“efectului de fermoar”
 - Aceste cupluri de adeziune sunt implicate in constituirea sinapsei imune(asemanata ochiului de
bou)

Desen sinapsa imuna:

- Daca epitopul n-a gasit => La mijloc sunt CAIC I si II, iar la periferie, receptorii TCR legati de MHC
- Daca gaseste epitopul potrivit => Forma ramane aceeasi, dar dispozitia se inverseaza =>
Conturul orbitei se va face prin cuplul de adeziune, iar in mijloc vor fi legaturile intre TCR si
epitopi MHC.
- Trebuie aceste cupluri de adeziune sa reziste minim o ora. Altfel, “nu se lasa” LT.

Pentru desene mai clare(.jpg) vezi anexa 1.