PUBLISHED BY

World's largest Science,

Technology & Medicine
Open Access book publisher

98,000+
2,850+ INTERNATIONAL 91+ MILLION
AUTHORS AND EDITORS
OPEN ACCESS BOOKS DOWNLOADS

AUTHORS AMONG
BOOKS 12.2%
DELIVERED TO TOP 1% AUTHORS AND EDITORS
15 1 COUNTRIES FROM TOP 5 0 0 UNIVERSITIES
MOST CITED SCIENTIST
 Selection of our books indexed in the
Book Citation Index in Web of Science™

Core Collection (BKCI)

Chapter from the book Biosensors for Health, Environment and Biosecurity
Downloaded from: http://www.intechopen.com/books/biosensors-for-health-
environment-and-biosecurity

Interested in publishing with InTechOpen?

Contact us at book.department@intechopen.com
Biosenzori electrochimici microfaradaici pentru studiul
acțiunii anticancer a medicamentului ce interpolează AND-
ul: Epirubicin
Sweety Tiwari and K.S. Pitre
Dr. Harisingh Gour University

India

1. Introducere
În ultimele două decenii, electrozi modificați chimic (EMC) au atras interesul
cercetătorilor în mod considerabil de a exercita un control direct asupra naturii
chimice a electrozilor. EMC au un număr mare de aplicații utile în diferite
domenii, cumr ar fi sinteza electro-organică selectivă, analiza biomedicală,
electroanalize etc. Abilitatea de a manipula arhitectura moleculară a matricei
voluminoase a electrodului, în special a suprafeței sale, a condus la o gamă
largă de aplicații analitice ale EMC și a creat oportunități pentru electroanaliști
pentru fabricarea biosenzorilor utili.
EMC au demonstrat o specificitate remarcabilă pentru procesele de
recunoaștere biologică care au dus la dezvoltarea unor dispozitive biosensibile
cu un grad ridicat de selectivitate. Biosenzorii electrochimici ocupă o poziție
importantă printre bioprobele disponibile în prezent și sunt promițătoare
pentru sarcinile de studiu a mecanismului in vivo de acțiune al unui număr mare
de medicamente. Acești biosenzori electrochimici constau din două
componente (1) o entitate biologică care recunoaște analitul țintă și (2)
traductorul de electrod care traduce evenimentul de biorecunoaștere într-un
semnal electric util.
Metodele moderne de analiză special concepute pentru descoperirea de
medicamente sunt, în principal, sisteme high-through put. Probele țintă sunt
fie obținutee la originea naturală generată de chimie combinată, fie obținute
prin metode biochimice. Sute și mii de compuși sintetici sunt disponibili în
bibliotecile de substanțe moderne, care trebuie testate individual pentru
utilizarea lor ca medicamente utile. În plus, unele resurse naturale, inclusiv
pădurile tropicale și mediul marin, prezintă un interes deosebit pentru
dezvoltarea de noi potențiale medicamente. În trecut, un număr mare de
plante și mostre obținute din surse biologice ale acestor habitate au fost
folosite ca medicamente tradiționale ale populației autohtone. Cunoștințele
științifice despre aceste medicamente tradiționale au atras atenția oamenilor
 de știință care lucrează în domeniul dezvoltării medicamentelor derivate din
natură.
1.1 Biosenzori
În prezent, majoritatea sistemelor de screening folosite sunt enzime sau celule
și aceste substanțe biologice au fost de asemenea utilizate ca elemente de
recunoaștere biologică ale biosenzorilor. Putem considera un biosenzor ca un
dispozitiv constând dintr-o parte biologică și un traductor fizic (Figura 1).

Figura 1. Funcția tipică a unui biosenzor. Unul dintre compușii unui amestec de
substanțe interacționează cu partea biologică a biosenzorului. Semnalul biologic
astfel produs este transformat în semnal fizic (optic, electric) de către traductor.
Compușii care nu interacționează cu partea biologică nu produc nici un semnal.
Conform unui document recent IUPAC, un biosenzor este definit ca un tip specific
de senzor chimic care cuprinde un element de recunoaștere biologică și un
traductor fiziochimic. Elementul biologic este capabil să recunoască prezența
activității sau a concentrației analitului specific în soluție. Recunoașterea poate fi
fie un proces de legare, adică biosenzor bazat pe ligand afinitate atunci când
elementul de recunoaștere este un segment de anticorp / ADN / receptor de celule
sau o reacție biocatalitică, adică biosenzori pe bază de enzime.
Ambele componente ale biosenzorului sunt în contact direct și pot fi utilizate
pentru mai multe măsurători. Selectivitatea biosenzorului depinde de componenta
biologică integrată. Substanțele care au o tendință specifică interacționează cu
partea biologică a biosenzorului produc semnale optice sau electrice ale
traductoarelor. În plus față de celulă și enzimă, alți compuși, cum ar fi ADN,
receptori și anticorpi, au fost, de asemenea, frecvent utilizați ca componente ale
biosenzorilor.
Nevoia de a dezvolta biosenzori specifici pentru măsurători rapide de rutină în mai
multe domenii de analiză a generat interesul unui număr mare de oameni de știință
în domeniul cercetării biosenzorilor. Ca rezultat, un număr destul de mare de
biosenzori specifici recent dezvoltați sunt utilizați pentru detectarea și analiza a
sute de compuși din analiții de origine diferită, de ex. zaharuri, aminoacizi și
cofactori enzimatici care au cea mai mare relevanță biologică (Paddle, 1996,
Meadows, 1996, Bousse, 1996, Ziegler și colab., 1998).
Unele dispozitive electrice, cum ar fi semiconductorii și electrozii, unele
componente optice, cum ar fi fibră optică, microbalanțe de cuart au fost, de
asemenea, utilizate ca parte a traductorului biosenzorului. Aceste traductoare au
fost miniaturizate pentru a obține senzori pe bază de cipuri. Deși inițial biosenzorii
au fost dezvoltați cu scopul de diagnostic clinic, de ex. în determinarea nivelului
zahărului din sânge, dar în ultimii ani biosenzorii au fost fabricați pentru posibila
lor aplicare în industria alimentară pentru scopuri de control al calității, analize de
mediu și analize biomedicale etc.
1.2 Biosenzori electrochimici
Primii biosenzori propuși și comercializați cu succes au fost cei bazați pe senzori
electrochimici pentru analize multiple. Mai mult de 50% dintre senzorii menționați
în literatură sunt electrochimici și pot fi clasificați ca senzori amperometrici,
potențiometrici sau conductometrici (Meadows, 1996).
Biosenzorii electrochimici au fost studiați mult timp. Acestea au făcut obiectul de
cercetare de bază și cercetare aplicată tde aproape cincizeci de ani. Leland C Clark
a introdus principiul primului electrod enzimatic cu glucozoxidază imobilizată (Clark
et al., 1962).
Primul biosenzor produs în comerț a fost introdus pe piață în 1975. Acest biosenzor
a fost utilizat pentru analiza rapidă a glucozei în probele de sânge de la diabetici.
Astăzi există un număr mare de dispozitive propuse și deja comercializate pe baza
principiului biosensorului, inclusiv cele pentru analiza agenților patogeni și a
toxinelor.
1.2.1 Biosenzori amperometrici
În senzorii amperometrici, o enzimă este de obicei imobilizată la suprafața unui
electrod amperometric; această enzimă imobilizată reacționează cu substratul (de
exemplu compușii fenolici / zahăr) și produce curent care depinde de concentrația
analitului (Figura 2).
Figura 2. Un senzor tipic amperometric pentru analiza fenolilor și a zaharurilor:
Enzima este imobilizată în partea superioară a electrodului, curentul dintre
electrozi oferă informații despre analit.
Într-un biosenzor simplu de tipul de mai sus, o enzimă consumatoare de oxigen
(fenolază / glucozoxidază) este imobilizată pe un electrod platină, iar reducerea
oxigenului la electrod are ca rezultat un curent invers proporțional cu concentrația
analitului.
1.2.2 Biosenzori potențiometrici
Acest tip de biosenzor se bazează pe proprietatea electrozilor selectivi ionici și a
tranzistorilor cu efect de câmp sensibil la ioni. Eventual, semnalul primar de ieșire
se datorează ionilor acumulați la interfața de membrană selectivă ionică. Prezența
ionului monitorizat ca urmare a reacției la suprafața electrodului este indicată prin
modificarea unor parametri fizici cum ar fi pH-ul etc. De exemplu, enzima glucoza
oxidază poate fi imobilizată la suprafața electrodului de pH. Glucoza compusă are
o influență minimă asupra pH-ului în mediul de lucru, dar formarea gluconatului
datorită interacțiunii sale la electrodul pH-ului enzimei imobilizate, soluția devine
acidă, care poate fi detectată cu ușurință. În general, un biosenzor potențiometric
poate fi reprezentat ca în figura 3.
Unii traductori fizico-chimici pe bază de semiconductori sunt utilizați în mod
obișnuit pentru construirea biosenzorilor. Tranzistorii cu efect selectiv pe câmp
(ISFET) și senzorii potențiometrici luminoși (LAPS) sunt materiale biosenzor
convenabile. Principiul de funcționare al ISFET se bazează pe generarea de
potențial de ioni de suprafață într-o soluție (Yuging și colab., 2003, 2005).
Potențialul generat modulează fluxul curent pe semiconductori de siliciu. O
membrană selectivă fabricată din compuși, Si3N4 (nitrit de siliciu), Al2O3
(Alumina), ZrO2 (oxid de zirconiu), Ta2O5 (oxid de tantal) este folosit pentru a
acoperi suprafata portii tranzistorului pentru a permite masurarea pH-ului. Cu
toate acestea, lucrările LAPS se bazează pe activarea semiconductorului prin dioda
emițătoare de lumină (LED). Ambele tipuri de biosenzori și-au dovedit
aplicabilitatea pentru biotest.

Figura 3. Principiul funcționării unui senzor potențiometric pentru analiza

aminoacizilor, a zaharurilor și a esterilor. Enzimele sunt imobilizate la suprafața
electrodului pH și se înregistrează modificarea pH-ului cauzată de conversia
enzimatică a substratului, care este proporțională cu concentrația analitului
1.2.3 Biosenzori conductometrici/impedimetrici
Aceste tipuri de biosenzori măsoară fie impedanța, fie rezistența / conductivitatea
și capacitatea componentelor sale. Aceste biosenzori au fost utilizați pentru analiza
ureei, utilizând ureaza ca componentă biorecunoaștere. Cu toate acestea,
utilizarea biosenzorului impedimetric este mai puțin frecvent comparativ cu
biosenzorii potențiometrici și amperometrici, dar utilizarea lor în studiul hibridizării
fragmentelor ADN amplificate anterior printr-o reacție în lanț a polimerazei și, de
asemenea, în monitorizarea creșterii microorganismelor datorită producerii de
metaboliți conductivi Silley și colab., 1996) și alte studii au produs rezultate
promițătoare.
1.3 Biosenzorii electrochimici în analiza biomedicală
Având în vedere cererea din ce în ce mai mare de dezvoltare a tehnicilor analitice
low cost pentru analiza selectivă și precisă a medicamentelor și a altor substanțe
analitice, precum și pentru sugerarea mecanismului de acțiune al medicamentelor,
oamenii de știință care lucrează în domeniul chimiei electroanalitice au proiectat
biosenzori electrochimici.
Biosenzorii dezvoltați au fost utilizați cu succes pentru analiza farmaceutică (Gil et
al., 2010) și, de asemenea, pentru scopuri biomedicale. Deoarece o mare varietate
de sisteme biologice poate fi utilizată ca agenți de recunoaștere, ea permite
fabricarea de biosenzori specifici pentru o mare varietate de analiti, iar
traductoarele electrochimice conferă sensibilitate ridicată la aceste dispozitive
(Lojou et al., 2006). Interacțiunea dintre agentul analit bio-identificator este
monitorizată de traductor și în cazul unui biosenzor electrochimic, detecția
semnalului are loc la interfața cu soluția de electrod, care poate fi dinamică sau
statică. În cazul metodelor anterioare, de exemplu în voltammetrie, se folosesc
biosenzori amperometrici, interacțiunea implică procesul redox urmat de
transferul de electroni. Întrucât, în metode statice, biosenzorii potențiometrici sunt
utilizați pentru a monitoriza concentrația speciilor încărcate în funcție de
potențialul electrochimic (Ravishanker, et al 2001). Alegerea corectă a unui
biosenzor pentru studiul unui anumit analit depinde de selecția agentului de
recunoaștere și a traductorului, ambele potrivite moleculei țintă.
Astfel, selectarea biosenzorilor de mai sus depinde de caracteristicile analitului,
adică în timp ce se utilizează biosenzori amperometrici, speciile organice /
anorganice trebuie supuse unui proces redox la potențialele de lucru. Totuți,
metodele statice (folosind biosenzori potențiometrici) implică specii încărcate. În
analiza farmaceutică, agenții de recunoaștere utilizați în mod obișnuit sunt
enzimele, anticorpii, ADN-ul, receptorii de medicamente etc. Pentru fabricarea
biosenzorilor electrochimici principalele elemente de transducție utilizate sunt
unele metale nobile, Pt și Au și, de asemenea, unele materiale pe bază de carbon
pe bază de carbon, carbon sticlos, pastă de carbon. Acești electrozi, după o
modificare adecvată, sunt utilizați pe scară largă în domeniul analizelor
farmaceutice și biomedicale.
În plus față de materialele de mai sus, progresul făcut în domeniul științei
materialelor și nanotehnologiei a dus la dezvoltarea semnificativă a multor
traductoare electrochimice, cum ar fi polimerii conducători cu caracteristici
adecvate pentru senzori electrochimici, nanotuburi de carbon, nanomateriale cu
dimensiuni moleculare (particule poroase și monodispersive argilă cu suprafață
superficială ridicată etc.).
Cu toate acestea, imobilizarea eficientă a agenților de recunoaștere pentru
traductor este încă o sarcină dificilă în tehnologia electrochimică a biosenzorilor.
Unele tehnici de imobilizare au fost raportate în literatură (Nakamura et al., 2003).
Domeniul de cercetare și dezvoltare a analizelor biomedicale și farmaceutice
cuprinde proceduri cuprinzătoare în încercarea de a îndeplini cerințele analizei,
adică acuratețea, selectivitatea, precizia, simplitatea și costul redus. Deoarece
biosenzorii îndeplinesc cerințele de mai sus, utilizarea lor posibilă în domeniul
analizelor biomedicale, farmaceutice, alimentare și de mediu etc este propusă
adeseori.
1.4 Biosenzorii electrochimici în chimioterapie
Chimioterapia este o armă importantă pentru tratamentul cancerului. Un număr
mare de compuși au fost dezvoltați ca potențiali candidați pentru medicamentele
anticanceroase, dar numai câțiva dintre ei au devenit eficienți în protocoalele
clinice. Ca atare, nevoia de a dezvolta medicamente care pot trata în mod eficient
diverse forme de cancer este larg recunoscută. Dezvoltarea de noi medicamente
antineoplazice (medicamente anticanceroase) necesită o înțelegere clară a
mecanismului de acțiune al medicamentului la nivel celular și molecular. Cancerul
(neoplazia) sunt bolile în care creșterea celulelor depășește cea a țesuturilor
sănătoase, suprimând rezervele organice care înconjoară țesutul normal. Țintele
potențiale pentru medicamentele antineoplazice sunt, în esență, cei patru acizi
nucleici, enzime specifice, microtubuli și receptori pentru hormoni / factori de
creștere. Atunci când țintă a medicamentului sunt acizi nucleici, daunele ADN
provoacă moartea celulară (medicamente citotoxice și genotoxice).
Medicamentele antineoplazice pot lega ADN-ul prin mai multe mecanisme. Unul
dintre mecanisme sugerează alchilarea siturilor nucleofile cu în helixul dublu.
Agenții de alchilare eficienți clinic au două fragmente capabile să producă carbocări
tranzitorii, care se combină covalent cu situsurile bogate în electroni ale ADN-ului,
cum ar fi poziția N7 a guaninei. Agenții de alchilare bifuncționali produc reticularea
a două fire de ADN care împiedică utilizarea ADN-ului ca șablon pentru sinteza
suplimentară de ADN și ARN, determinând inhibarea replicării și transcripției
conducând la moartea celulelor. Un număr mare de agenți de alchilare sunt
cunoscute care au demonstrat activitate antitumorală. Acestea includ azot iperită
(mechloretamină, ciclofosfamidă etc.), aziridine și epoxizi (tiotepa, mitomicină C
etc), alchilsulfonați (busulfan și analogii săi), triazene, hidrazine și compuși
asemănători etc.
Un alt mecanism al legării medicament-ADN este intercalarea adică inserția unei
molecule plane (în general aromatice) între două nucleotide adiacente ale ADN-
ului. Multe antibiotice antitumorale lucrează prin acest mecanism. Moleculele
antibiotice (doxorubicina, daunorubicina etc.) sunt necovalent, dar ferm legate de
ADN, distorsionând forma dublului helix ADN. Astfel, inhibarea replicării ADN și a
transcrierii ARN.
Bleomicinele provoacă, de asemenea, deteriorări ADN prin intercalare. Aceste
glicopeptide intercalate între perechile de guanină, citozină, baze ADN și capătul
peptidei se leagă de Fe (II), care este capabil să catalizeze reducerea oxigenului
molecular la radicalii superoxid sau hidroxil, ceea ce determină scindarea stâlpului
ADN datorită stresului oxidativ.
Deoarece efectul antitumoral al unui medicament depinde de eficiența acestuia de
a interacționa cu ADN-ul. Prin urmare, recunoașterea moleculară a acizilor nucleici
de compuși cu masă moleculară mică este o zonă de interes fundamental. Acest
fapt a încurajat oamenii de știință care lucrează în domeniul analizei farmaceutice
și biomedicale să elaboreze experimente utilizând o tehnică fiziochemică adecvată
pentru studiul interacțiunii moleculelor mici cu ADN.
1.5 Metode electrochimice pentru analiza biomedicală
Printre tehnicile fizico-chimice, unele metode electrochimice moderne au atras
interesul oamenilor de știință care lucrează în domeniul analizelor biomedicale și
farmaceutice. Datorită simplității și fiabilității metodelor electrochimice, acestea
oferă avantaje față de testele biologice și chimice. Deoarece un număr mare de
molecule organice au o tendință de a prezenta activitate redox, metodele
microelectroanalitice au un potențial util metodelor de investigare enumerate
anterior în domeniu. Utilizarea tehnicilor electrochimice se bazează în principal pe
diferențele în comportamentul redox al moleculelor organice, adică moleculele de
legare a acidului nucleic în absența și prezența ADN-ului. Modificarea
comportamentului redox al moleculei studiate are ca rezultat schimbarea
potențialului formal al cuplului redox și scăderea curentului de vârf, care rezultă
din schimbarea dramatică a coeficientului de difuzie după combinarea moleculei
cu ADN. Pe de altă parte, deoarece ADN-ul este de asemenea activ din punct de
vedere electrochimic (Palacek, 1983) interacțiunea medicament-ADN poate fi de
asemenea descrisă prin variația comportamentului redox al nucleobazelor (ADN),
cum ar fi guanina și adenina, în prezența moleculei .
Pentru fabricarea unui biosenzor electrochimic, este o cerință principală o legătură
de succes între traductor, în general o microelectrod (electrod de fibră de carbon
sticlos, electrod de pastă de carbon, electrod de nanotuburi de carbon etc.) și
elementul biologic / substanța chimică. Interacțiunile analitului țintă cu receptorii
de pe suprafața traductorului (electrod) produc semnale caracteristice (curent /
potențial). Sensibilitatea, selectivitatea, timpul de răspuns și stabilitatea
biosenzorului electrochimic sunt parametrii importanți care determină utilitatea
practică a biosenzorului dezvoltat pentru analiza biomedicală și, de asemenea,
studiul mecanismului in vivo de acțiune al medicamentului. Este o sarcină dificilă
înainte ca oamenii de știință care lucrează în domeniu să elaboreze proceduri
analitice cuprinzătoare care să stabilească experimente care să fie paralele cu
condițiile de interacțiune in-vivo așteptate.
Un număr destul de mare de compuși au tendința de a interacționa cu ADN-ul,
determinând modificări în structura și secvența de bază a acestuia, ceea ce duce la
tulburarea reticulării ADN-ului. Ca atare, în domeniul științei medicinale,
interacțiunea medicament-ADN poate fi foarte utilă pentru evaluarea daunelor
cauzate ADN-ului de către agenți cancerigeni și substanțe oxidante (Perry, 1996,
Blackburn, 1996).
În ultimii ani, utilizarea biosenzorilor microfaradici modificați s-a dovedit a fi foarte
semnificativă pentru studiul mecanismului de interacțiune între substanțele de
importanță medicală (Brett, 1999). De asemenea, ele funcționează ca biosenzori
electrochimici (Niu, 2006) ca o tehnologie simplă și ieftină pentru diagnosticarea
bolilor genetice și detectarea speciilor patogene biologice (Erdem, 2005, Rauf,
2005). Știm că unele intercalatoare de ADN (Ozkan, 2004, Karadeniz, 2003, Pang,
2000, Ju, 2003, Girousi, 2004), care în general funcționează ca medicamente
anticanceroase, sunt utile în detectarea hibridării secvențiale specifice a acizilor
nucleici.

1.6 Epirubicina - un medicament anticancer

Epirubicina, un medicament antibiotic din familia antracicline, posedă un spectru
larg de aplicații chimioterapeutice și acțiune antineoplazică. Proprietățile
antitumorale ale Epirubicinei sunt cunoscute de mai mult de două decenii, însă
studiile farmacocinetice și biochimice pentru stabilirea mecanismului său de
acțiune in-vivo și îmbunătățirea administrării și a activității sale anticanceroase
sunt în continuare obiective importante. Un studiu al literaturii evidențiază faptul
că Epirubicin și alte antracicline analogice se comportă ca intercalatori ai ADN-ului
și activitatea lor se acumulează în genomul nuclear (Ozkan, 2003, Martinez, 2005).
De la mijlocul anilor 1980, epirubicina a fost utilizată pe scară largă atât pentru
cancerul de sân în stadiu incipient, cât și pentru cancerul mamar metastatic.
Epirubicina este epimerul 4'-al antibioticului antraciclinic antitumoral popular,
doxorubicina. Au fost sugerate mai multe mecanisme pentru a explica efectul
antineoplazic al epirubicinei; Mai întâi se intercalează între perechile de nucleotide
ADN care conduc la inhibarea sintezei ADN, ARN și proteinei. În al doilea rând,
intercalarea duce la scindarea topoizomerazei II a ADN-ului, rezultând o activitate
citocidică, iar al treilea mecanism sugerează că epirubicina inhibă activitatea
helicazei ADN care în cele din urmă interacționează cu replicarea și transcripția
ADN-ului, ARN.
Datorită reorientării grupării hidroxil în poziția 4 'a daunosaminei (Figura 4) inel
ecuatorial pentru epirubicină și axial pentru doxorubicină, epirubicina posedă mai
multe proprietăți farmacologice diferite în comparație cu doxorubicina. Valoarea
sa pKa este mai mică decât cea a doxorubicinei. În consecință, este mai lipofilă și
poate să penetreze mai bine celulele. În plus, glucuronidarea epirubicinei și
epirubicinolului pentru a inactiva metaboliții are ca rezultat o perioadă de
înjumătățire terminală mai scurtă pentru epirubicină în comparație cu
doxorubicina.
Diferența structurală de mai jos între epirubicină și doxorubicină este responsabilă
de diferite profiluri de siguranță pentru cele două medicamente antineoplazice.
Doze mai mari de epirubicină sunt necesare pentru a produce același grad de
toxicitate ca și doxorubicina. Ratele de dozaj pentru toxicități similare pentru
doxorubicină: epirubicină sunt 1: 1,8 pentru cardiacă, 1: 1,5 pentru
nonhematologic și 1: 1,2 pentru hematologice. Ca atare, profilul de siguranță
superior al epirubicinei în comparație cu cel al doxorubicinei permite o creștere
mai mare a dozelor care poate fi realizată în condiții de siguranță, ceea ce înseamnă
clar că epirubicina are o fereastră terapeutică mai mare.
Electrozii modificați chimic (CME) ca biosenzori voltammetrici (Shrivastava, 2004)
acumulează selectiv analiții și îi protejează de interferența altor ioni / specii
electrochimice, au jucat un rol de lider în analiza polinucleotidelor biosintetice care
conțin reziduuri de adenină / guanină, metodă. (Palacek, 1983). Ca atare, studiind
importanța utilizării epirubicinei, ca tratament anticancer și utilitatea biosenzorilor
electrochimici, am fabricat ADN modificat și epirubicin adsorbit biosenzori GCFE și
am studiat interacțiunea epirubicinei in situ cu ds-ADN la suprafața sa. Deoarece
literatura de specialitate arată, de asemenea, că interacțiunea in vivo a
medicamentului anticancer epirubicin cu ADN are loc la membranele și proteinele
fosfolipide încărcate, interacțiunea studiată ar fi paralelă cu situația in-vivo ADN-
epirubicină complexă, în care ADN-ul se află în apropiere contact cu membranele
și proteinele fosfolipide încărcate. A fost propus un mecanism potrivit pentru
reacția de mai sus.

Figura 4. Structuri chimice ale doxorubicinei și doxorubicinei

 2. Faza experimentală
2.1 Substanțe și instumente necesare
A fost utilizată apă deionizată pentru a prepara soluțiile de ADN de timus de vițel
(Himedia ltd. Mumbai) și clorhidrat de epirubicină (eșantion de cadou furnizat de
M / S, Dabur Pharma, Ltd. Baddi dist. Solan H.P.).
Pentru toate studiile voltammetrice a fost utilizat modelul CL-362 al modelului
ELICO (Hyderabad, India) μp-polarografic. S-au utilizat fibre de carbon sticloase
(NF-12, Sigity Elititigoitit, U.K.) pentru fabricarea electrodului din fibră de carbon
sticlos (GCFE) ca electrod de lucru, un electrod calomel saturat și respectiv un
electrod de fir platină. Măsurătorile de pH au fost efectuate pe un sistem systronic
(India) μ-pH-361. Toate experimentele au fost efectuate la temperatura camerei și
oxigenul dizolvat a fost eliminat prin trecerea azotului pur prin soluții.
Pentru toate experimentele DPV (voltammetrie puls diferențială) parametrii
instrumentali au fost utilizați după cum urmează: rata de scanare 12mV / s,
sensibilitatea 10μA și amplitudinea pulsului 50mV.

2.2 Fabricarea electrozilor

2.2.1 Epirubicina adsobită în GCFE
Epirubicina adsorbită în GCFE a fost fabricată prin scufundarea electrodului într-o
celulă voltammetrică conținând soluție de medicament (80 pg / ml) timp de zece
minute, la un potențial de depunere de + 0,40V. Electrodul a fost scos din soluție,
clătit bine cu apă distilată și apoi utilizat pentru măsurători voltammetrice. Pentru
a studia interacțiunea medicament-ADN, electrodul modificat a fost scufundat într-
o celulă voltammetrică conținând 80 ug / ml ADN și tampon acetat de 0,1 M la pH
4,5 ± 0,1 și a fost înregistrată Voltamograma DP.
2.2.2 GCFE modificate cu strat subțire ds-ADN
Pentru fabricarea GCFE modificat cu strat subțire ds-ADN, electrodul a fost imersat
în soluție de 80 pg / ml ds-ADN la potențial aplicat de + 0,40V timp de zece minute.
Acest GCFE modificat ds-ADN a fost spălat cu apă distilată și apoi înmuiat în soluție
de epirubicină timp de trei minute. Apoi a fost clătită cu apă și transferată într-o
celulă voltammetrică conținând soluție tampon acetat la pH 4,5 ± 0,1 și s-a
înregistrat voltamograma pulsului diferențial.
2.2.3 GFCE modificate cu strat gros ds-ADN
Pentru fabricarea GCFE modificat cu strat gros ds-ADN, electrodul a fost scufundat
în soluție de ds-ADN de 25 mg / ml timp de zece minute. A fost scos din soluție și
lăsată să se usuce. Electrodul a fost apoi înmuiat în soluție (20 pg / ml) de
epirubicină pentru diferite intervale de timp. De fiecare dată când electrodul a fost
scos din soluție, a fost spălat cu apă distilată și uscat. Electrodul uscat se înmoaie
într-o soluție de tampon acetat (0,1 M) la pH 4,5 ± 0,1 și se înregistrează
voltamograma.

3. Rezultate
3.1 Analiza DPV a epirubicinei
Epirubicina produce două vârfuri de reducere (Tabelul 1) la valoarea Ep -0,46 V și -
0,62 V (Figura 5) datorită reducerii grupelor sale 5,12-dichinone pentru a produce
un radical semichinon cu reacție ridicată. Cu toate acestea, dacă soluția este
electrolizată efectuând o scanare potențială pozitivă a electrodului de lucru,
voltamograma puls diferențială rezultată a produs un vârf bine definit la + 0,54V
(Figura 6), datorită oxidării 6,11-dihidrochinonei de epirubicină. La înregistrarea
voltamogramei DP (vârf de oxidare) pentru concentrații variabile de epirubicină (de
la 5μg / ml la 120μg / ml) în condițiile experimentului de mai sus, sa observat o
relație liniară între înălțimea vârfului voltamogramei și concentrației de
epirubicină. Astfel, determinarea determinării cantitative a epirubicinei. Limita
minimă de detecție a fost găsită a fi de 5 pg / ml de analit, cu o precizie și o precizie
de determinare.
Figura 5. Voltamograma pulsului diferențial pentru 80 ug / ml epirubicină
(reducere) în tampon acetat de 0,1 M la pH 4,5 ± 0,1 la GCFE gol.

Figura 6. Voltamograma pulsului diferențial pentru 80 ug / ml epirubicină

(oxidare) în tampon acetat de 0,1 M la pH 4,5 ± 0,1 la GCFE gol.
 S. Medicament/ Electrod Secventa Voltaică Ep V vs SCE
No Soluție ADN experimentală I II III
80µg/ml Scanarea potențială catodică
1 GCFE -0.46 -0.62 --
Epirubicină (reducere)
80µg/ml Scanarea potențială anodică
2 GCFE +0.54 -- --
Epirubicină (oxidare)
Applying a potential -0.60V for 60 s,
80µg/ml ds- Epirubici
3 followed by anodic potential +0.45
DNA nă
scanning
modificată
cu GCFE
GCFE Aplicarea unui potențial de -0.60V
20µg/ml
4 modificate timp de 60 de secunde, urmată de +0.54
Epirubicină
cu strat scanarea potențialului anodic
subțire ds-
ADN
GCFE
20µg/ml Aplicarea unui potențial de -0,60V +0.40 +0.54
5 modificate
Epirubicină timp de 60 de secunde, urmată +0.90
cu strat
de scanarea anodică
subțire ds-
ADN
GCFE Scanarea potențialului
20µg/ml
6 modificate electrodului de lucru de la -0,70V -0.45 -0.60
Epirubicină
cu strat la -00V
gros ds-ADN
Electrodul a fost scufundat în
GCFE
20µg/ml soluție Epirubicin timp de 300 s, +0.54 +0.80
7 modificate
Epirubicină apoi a aplicat un potențial de - +1.1
cu strat
0,60V timp de 60 de secunde,
gros ds-ADN
urmat de scanarea anodică

Tabelul 1. Rezumatul condițiilor experimentale voltammetrice și datele observate

(în tampon acetat 0,1 la pH 4,5, rata de scanare 12mV / S, amplitudinea pulsului -
50mV)
3.2 Analiza DPV a interacțiunilor epirubicină-ADN pe GCFE
Primul set, adică fără ADN, a produs un vârf de oxidare DPV pentru epirubicină la +
0,54V, care a fost mutat la un potențial mai electro-pozitiv cu o concentrație
crescătoare de ADN și curentul de vârf a fost scurtat. Schimbarea în valoarea Ep și
scurtarea curentului de vârf poate fi explicată pe baza schimbării speciei care este
oxidată la suprafața GCFE, adică datorită formării complexului medicament-ADN.
Deși rezultatele experimentale de mai sus confirmă formarea complexului
Epirubicin-ADN, dar pentru a avea o înțelegere clară asupra mecanismului
interacțiunii medicament-ADN la suprafețele încărcate, GCFE a fost modificat în
trei moduri diferite:
 3.3 Interacțiuni epirubicină-ADN pe GCFE cu epirubicină adsorbită
Se observă un vârf mare la + 0,54V datorită oxidării adsorbite de epirubicină, iar
celelalte vârfuri pot fi datorate oxidării bazelor purinice ale ADN-ului. Această
explicație a voltamogramei observate se bazează pe prezumția că ADN difuzează
de la cea mai mare parte a soluției la suprafața electrodului, iar epirubicina
chemisorbită este intercalată în spirala dublă. Ca atare, are loc distorsiunea dublei
fire, ceea ce permite oxidarea bazelor purinice. Cu toate acestea, după prima
scanare, dacă a fost aplicat un potențial de -0,60V timp de 60 de secunde și apoi
voltamograma a fost înregistrată, acesta a generat un vârf la + 0,45V (Figura 7).
Apariția acestui vârf se datorează interacțiunii epirubicinei cu ADN-ul ds-ului prin
regiunea bogată în guanină.

Figura 7. Voltamograma pulsului diferențial pentru soluție de 80 ug / ml ds-ADN în

tampon acetat de 0,1 M la pH 4,5 ± 0,1, după aplicarea unui potențial de -0,60 V
pe parcursul a 60 de secunde, la GCFE modificat cu epirubicină.
 3.4 Interacțiunea epirubicină- ADN la GCFE modificați cu strat subțire ds-ADN
DPV pentru oxidarea epirubicinei a arătat un vârf bine definit, cu potențial de vârf
+ 0.54V. Maximul poate fi atribuit oxidării grupării 6,11-dihidrochinone a moleculei
de epirubicină.
Cu toate acestea, după înregistrarea vârfului de oxidare, a fost aplicat un potențial
negativ de -0,60V pe electrodul modificat timp de 60 s, urmată de înregistrarea
voltamogramei DP cu scanare potențial pozitivă a electrodului de lucru.
Voltammograma rezultată a arătat două vârfuri noi pe lângă vârful de oxidare a
epirubicinei. Vârful la + 0,90 V (Figura 8) poate fi atribuit datorită oxidării 8-oxo-
guaninei (8-oxo-G) și că la + 0,40 V poate fi datorată oxidării bazelor purinice ale
ADN-ului. O separare clară a vârfului datorată 8-oxo-G și epirubicinei poate fi
explicată pe baza unei acoperitori neuniforme a suprafeței GCFE prin ADN și a
adsorbției epirubicinei la aceste suprafețe neacoperite. [Rezultatele sunt în
concordanță cu cele observate folosind GCFE modificat cu strat ADN gros). Această
schimbare a vârfului de 8-oxo- G la potențial mai puțin pozitiv informează despre
interacțiunea ADN-epirubicină (deteriorarea ADN-ului).

Figura 8. Voltamograma pulsului diferențial în tampon acetat de 0,1 M la

pH 4,5 ± 0,1, obținut cu un strat subțire ds-ADN modificat GCFE după ce a fost
imersat în soluție de epirubicină 20 ug / ml timp de 180 s, după aplicarea unui
potențial de -0,60 V pe parcursul a 60 s.
 3.5 Interacțiunea epirubicină- ADN la GCFE modificați cu strat gros ds-ADN

Epirubicina a produs un vârf de oxidare voltammetric bine definit cu valoarea Ep +

0,54V. Se investighează înălțimea vârfului de oxidare a epirubicinei în ceea ce
privește timpul de imersare a GCFE modificat GCFE în stratul gros de epirubicină.
Rezultatele au arătat o relație liniară între înălțimea vârfului și timpul de imersiune
a electrodului în soluția de epirubicină, de ex. 0,00 la 60 min, și apoi a atins o
valoare constantă. Astfel, indicând preconcentrarea epirubicinei la suprafața
electrodului modificată ds-ADN cu strat gros.
Este important de observat că curenții de vârf reproductibili s-au observat pentru
perioada similară de imersare a stratului gros ds-ADN modificat GCFE în soluția de
epirubicină doar pentru prima scanare. Cu toate acestea, dacă voltamograma
diferențială a pulsului este înregistrată utilizând același electrod modificat, sa
observat o scădere bruscă a curentului de vârf. Acest lucru sugerează un consum
rapid de medicament neoplazic la suprafața modificată a electrodului.
Cu toate acestea, la efectuarea experimentelor voltammetrice de mai sus folosind
GCFE goale și stratul gros ds-ADN modificat GCFE ca electrod de lucru și scanarea
potențialului de la -0,70V la -0,00V, curba DPV rezultată cu GCFE goală a produs
numai un vârf la
-0.56V. În timp ce, folosind stratul gros ds-ADN modificat GCFE s-au observat două
vârfuri la
-0,60 V și, respectiv, -0,45 V. Noul vârf observat la -0,45 V vorbește despre un
mecanism de interacțiune diferit de ADN-ul epirubicinei, la suprafața modificată
GCFE.
Deoarece epirubicina este adsorbită ireversibil la suprafața GCFE goală, devine
necesar să se curețe electrodul de fiecare dată înainte de utilizare. În timp ce stratul
gros ds-ADN modificat GCFE nu a necesitat curățare. Acest lucru demonstrează clar
că epirubicina este intercalată în interiorul peliculei ds-ADN și nu poate atinge
suprafața electrodului. Pe baza observațiilor de mai sus s-ar putea concluziona că
vârfurile voltametrice sunt observate datorită epirubicinei care este intercalată în
strat gros de ds-ADN. Deoarece voltamogramele s-au înregistrat numai în soluție
de tampon acetat de electroliți, este exclusă posibilitatea oricărei contribuții la
vârfurile voltammetrice din epirubicina prezentă în soluție. Ca atare, vârful nou
observat la -0,45 V poate fi atribuit interacțiunii site-ului epirubicină-guanină (în
ADN) care conduce la o reacție de transfer de sarcină de la semichinonă de
epirubicină și de cation de radicali de guanină. Cu toate acestea, vârful la -0,60 V
poate fi atribuit reducerii epirubicinei. Așa cum am menționat mai devreme,
epirubicina la GCFE gol produce un vârf la -0,56 V, schimbarea în potențialul de vârf
pentru reducerea epirubicinei la cele două suprafețe diferite ale electrodului poate
fi explicată datorită modificării suprafețelor electrodului.
Totuși, în cazul în care GCFE modificat ds-ADN după ce a fost scufundat în
epirubicină timp de 300 de secunde, clătit și scufundat într-o soluție tampon la pH
4,5 ± 0,1, a fost supus unui potențial de -0,60 V timp de aproximativ 60 de secunde
și apoi voltamograma a fost înregistrată cu scanarea potențială a electrodului
modificat, voltamograma rezultată a produs două vârfuri noi, una la + 0,80V și una
la + 1,1V (Figura 9). Ultimul vârf poate fi atribuit oxidării guaninei și mai târziu
datorită oxidării adeninei.

Fig. 9. Voltamograma pulsului diferențial în tampon acetat 0,1M la pH 4,5 ± 0,1

obținut cu un GCFE modificat mai târziu ds-ADN după ce a fost imersat în soluție
de epirubicină 20 ug / ml timp de 60 s la potențial de -0,60V.
 4. Mecanismul
Epirubicina transferă un electron la porțiunea de chinonă (Perry, 1996) pentru a
genera un radical liber. Radicalul liber reactiv, format la -0.60 V, poate oxida situsul
guaninei al ds-ADN în care este intercalat în dublul helix, formând complexul
medicament-ADN. În plus, studiul privind interacțiunea ADN-medicament la GCFE
gol a arătat că vârful la + 0,54V, așa cum s-a observat în cazul oxidării epirubicinului
pur, la GCFE gol, se deplasează la o parte mai puțin pozitivă, adică + 0,45V, la
complexarea sa cu ds- care poate fi explicată ca urmare a interacțiunii dintre
epirubicină și 8-oxo-G care se formează ca urmare a interacțiunii epirubicinei cu
regiunea bogată în guanină a ds-ADN. Ca atare, un transfer de electron de la
porțiunea de guanină la chinonă care conduce la formarea de cationi de guanină
pare a fi reacția probabilă. Cu toate acestea, datorită tendinței cationului de
guanină de a se supune hidrolizei, în cele din urmă semichinona este redusă în
continuare pentru a forma epirubicină și 8-oxo-G.
Modelul mecanismului
Modelul mecanismului: Mecanismul distrugerii oxidative a epirubicinei
electrochimice la ADN sau reducerea și reacționarea specifică cu fragmentul de
guanină și astfel formează restul 8-oxo-G mutagenic. Se poate propune un model
de mecanism pentru reacție. Biosenzorii microfaradici fabricați sunt de o
importanță deosebită deoarece mecanismul de interacțiune a ADN-epirubicinei la
interfețele încărcate este paralel cu reacția in-vivo a ADN-medicament complex, în
care ADN-ul este în contact strâns cu membranele și proteinele fosfolipide
încărcate mai degrabă atunci când intercalarea este soluţie. De asemenea, promite
utilizarea tehnicilor voltammetrice pentru generarea in situ a intermediarilor de
reacție. Ca atare, este un instrument complementar pentru studiul mecanismului
de interacțiune biomoleculară cu relevanță medicală.

6. Mulțumiri

Comisia pentru granturi universitare, New Delhi, India, pentru sprijin financiar în
cadrul programului său special de asistență (SAP) nivelul 1.

7. Referințe

Blackburn, GM. & Gair, MJ. (1996). Nucleic acids in chemistry and biology, Oxford
University Press, UK.
Brett. OM.; Serrano, SP., & Piedade, JP. (1999). Comprehensive chemical kinetics compton,
R.G. Hancock (Eds), Elsevier, Amsterdam.
Bousse, L. (1996). Whole cell biosensors. Sensors Actuators, Vol. B34, pp. 270–275.
Clark, LC. & Lyons, C. (1962). Electrode systems for continuous monitoring of
cardiovascular surgery. Ann. NY. Acad. Sci., Vol. 102, pp. 29–35.
Erdem, A.; Kosmider, B.; Osiecka, R.; Zyner, E.; Ochocki, J., & Ozsoz, M. (2005).
Electrochemical genosensing of the interaction between the potential
chemotherapeutic agent, cis-bis (3-aminoflavone) dichloroplatinum (II) and DNA in
comparison with cis-DDP. J. Pharm. Biomed. Anal., Vol. 38, pp. 645-652.
Gil, ES. & Melo GR. (2010). Electrochemical biosensors in pharmaceutical analysis. Brazilian
J. Pharma. Scien., Vol. 46, pp. 375-391.
Girousi, ST.; Gherghi, IC., & Karava, MK. (2004). DNA-modified carbon paste electrode
applied to the study of interaction between rifampicin (RIF) and DNA in solution
and at the electrode surface. J. Pharm. Biomed. Anal., Vol. 36, pp. 851-858.
Ju, HX.; Ye, YK.; Zhao, JH., & Zhu, YL. (2003). Hybridization biosensor using di (2,2′-
bipyridine) osmium (III) as electrochemical indicator for detection of polymerase
chain reaction product of hepatitis B virus DNA. Anal. Biochem., Vol. 313, pp. 255-
261.
Karadeniz, H.; Gulmez, B.; Sahinci, F.; Erdem, A.; Kaya, GI.; Unver, N.; Kivcak, B., & Ozsoz,
M. (2003). Disposable electrochemical biosensor for the detection of the
interaction between DNA and lycorine based on guanine and adenine signals.
J. Pharm. Biomed. Anal., Vol. 33, pp. 295-302.
Lojou, E. & Bianco, P. (2006). Application of the electrochemical concepts and techniques to
amperometric biosensor devices. J. Electroceram., Vol. 16, pp. 79-91.
Martínez, R. & Chacón-García, L. (2005). The search of DNA-intercalators as antitumoral
drugs: What it worked and what did not work. Curr. Med. Chem., Vol. 12, pp. 127-
151.
Meadows, D. (1996). Recent developments with biosensing technology and applications in
the pharmaceutical industry. Adv. Drug Deliv. Rev., Vol. 21, pp. 179–189.
346 Biosensors for Health, Environment and Biosecurity

Nakamura, H. & Karube, I. (2003). Current research activity in biosensors. Anal. Bioanal.
Chem., Vol. 377, pp. 446-468.
Niu, S.; Li, F.; Zhang, S.; Wang, L.; Li, X., & Wang, S. (2006). Studies on the interaction
mechanism of 1,10-phenanthroline cobalt (II) complex with DNA and preparation
of electrochemical DNA biosensor. Sensor, Vol. 6, pp. 1234-1244.
Ozkan, A. & Fiskin, K. (2003). Cytotoxicity of low dose epirubicin-HCI combined with
lymphokine activated killer cells against hepatocellular carcinoma cell line
hepatoma G2. Turk. J. Med. Sci., Vol. 34, pp. 11-19.
Ozkan, D.; Karadeniz, H.; Erdem, A.; Mascini, M., & Ozsoz, M. (2004). Electrochemical
genosensor for Mitomycin C–DNA interaction based on guanine signal. J. Pharm.
Biomed. Anal., Vol. 35, pp. 905-912.
Paddle, BM. (1996). Biosensors for chemical and biological agents of defence interest.
Biosens. Bioelectron., Vol. 11, pp. 1079–1113.
Palacek, E. (1983). Modern polarographic (voltammetric) techniques part (ii) in biochemistry
and molecular biology, In: Topics in Bioelectrochemistry and Bioenergetics, G.
Milazzo (Eds), John Wiley & Sons, New York.
Pang, DW. & Abruna, HD. (2000). Interactions of benzyl viologen with surface-bound single
and double-stranded DNA. Anal. Chem., Vol. 72, pp. 4700-4706.
Perry, MC. (1996). The Chemotherapy Source Book, Williams and Wilkins, Baltimore, USA.
Rauf, S.; Gooding, JJ.; Akhtar, K.; Ghauri, MA.; Rahman, M.; Anwar, MA., & Khalid, AM.
(2005). Electrochemical approach of anticancer drugs–DNA interaction. J.
Pharm. Biomed. Anal., Vol. 37, pp. 205-217.
Ravishankara, MN.; Pillai, AD., & Handral, RD. (2001) Biosensor and its application. East.
Pharm., Vol. 44, pp. 21-25.
Shrivastava, AK. (2004). Electrochemical sensors based on macrocyclic compounds in
International Conference on electroanalytical chemistry and allied topics, January
18-23, 2004 Dona Paula, Goa (India), Indian Soc. Electroanal. Chem., Mumbai
(India).
Silley, P. & Forsythe, S. (1996). Impedance microbiology: a rapid change for microbiologists.
J. Appl. Bacteriol., Vol. 80, pp. 233–243.
Yuqing, M.; Jianquo, G., & Jianrong C. (2003). Ion sensitive field effect transducer-based
biosensors. Biotechnol. Adv., Vol. 21, pp. 527–534.
Yuqing, M.; Jianrong, C., & Keming, F. (2005). New technology for the detection of pH. J.
Biochem. Biophys. Methods, Vol. 63, pp. 1–9.
Ziegler, C. & Göpel, W. (1998). Biosensor development. Curr. Opin. Chem. Biol., Vol. 2, pp.
585–591.
 Biosensors for Health, Environment and Biosecurity

Edited by Prof. Pier Andrea Serra

ISBN 978-953-307-443-6

Hard cover, 540 pages

Publisher InTech

Published online 19, July, 2011

Published in print edition July, 2011

Un biosenzor este un dispozitiv de detectare care combină un traductor cu o componentă sensibilă din punct de vedere
biologic și selectivă. Biosensorii pot măsura compușii prezenți în mediul înconjurător, procesele chimice, alimentele și corpul
uman la un cost redus în comparație cu tehnicile analitice tradiționale. Această carte acoperă o gamă largă de aspecte și
aspecte legate de tehnologia biosenzorilor, reunind cercetători din 16 țări diferite. Cartea este compusă din 24 de capitole
scrise de 76 de autori și divizate în trei secțiuni: Tehnologia și materialele biosenzorilor, Biosenzorii pentru sănătate și
biosenzori pentru mediu și biosecuritate.

How to reference

In order to correctly reference this scholarly work, feel free to copy and paste the following:

Krishna Pitre and Sweety Tiwari (2011). Microfaradaic Electrochemical Biosensors for the Study of Anticancer Action of DNA
Intercalating Drug: Epirubicin, Biosensors for Health, Environment and Biosecurity, Prof. Pier Andrea Serra (Ed.), ISBN:
978-953-307-443-6, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/biosensors-for-health-environment-and-
biosecurity/microfaradaic- electrochemical-biosensors-for-the-study-of-anticancer-action-of-dna-intercalating-dru

InTech Europe

University Campus STeP Ri Slavka Krautzeka 83/A 51000 Rijeka, Croatia

Phone: +385 (51) 770 447

Fax: +385 (51) 686 166

www.intechopen.com