1.

INDICE

1. INDICE ................................................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 2
3. FUNDAMENTO TEÓRICO................................................................................................. 2
3.1. Extracción .......................................................................................................................... 2
3.2. Pigmentos fotosintéticos .................................................................................................... 2
3.2.1. Clorofilas ..................................................................................................................... 2
3.2.2. Carotenoides ................................................................................................................ 3
4. DATOS ................................................................................................................................. 6
5. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO .......................................................................... 9
6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ...................................................................................... 10
7. RESULTADOS ................................................................................................................... 12
8. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 12
9. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 13
10. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 13
11. ANEXOS......................................................................................................................... 14
11.1. Aplicación industrial ...................................................................................................... 14

Índice de figuras
Figura 1: Estructura de la clorofila……………………………….......………………….3
Figura 2: Estructura de la clorofila b. ............................................................................... 3
Figura 3: Principales carotenos y xantófilas presentes en los pigmentos fotosintéticos. . 4
Figura 4: Líquido amarillento obtenido de la maceración de espinaca con metanol-ét..10
Figura 5: Formación de dos fases en el proceso de extracción. El círculo rosado encierra
la fase hexánica y el circulo amarillo la fase alcohol-agua. ........................................... 11
Figura 6: Límite entre la fase hexánica y la fase alcohol- agua. .................................... 12

Índice de tablas
Tabla 1: Datos generales y hoja de seguridad del Etanol. ................................................ 6
Tabla 2: Datos generales y hoja de seguridad de n- hexano. ............................................ 7
Tabla 3: Datos generales y hoja de seguridad de Sulfato de sodio................................... 8
 PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 03
“EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS”

2. OBJETIVOS

 Aprender y desarrollar habilidades en cuanto a técnicas de extracción y

separación de pigmentos naturales de la espinaca por procesos de
extracción sólido- líquido y líquido-líquido.

 Comprender y asimilar fundamentos implicados con los procesos de

extracción, como las propiedades fisicoquímicas y la interacción entre el
producto y los disolventes a utilizar.

 Conocer e informarnos sobre los pigmentos naturales contenidos en el

producto a analizar (espinaca).

3. FUNDAMENTO TEÓRICO
3.1. Extracción
Es la separación de un componente (del seno de una mezcla), por acción de un
solvente que lo disuelve selectivamente, se basa sólo en el fenómeno de partición el
cual se diferencia del fenómeno de adsorción en que esta última indica una
adherencia selectiva, con desorciones diferentes, para una sustancia entre la fase
sólida del adsorbente y la fase líquida del eluyente.
El solvente utilizado en la extracción no debe alterar la estructura del compuesto a
extraer. (Galagovsky Kurman)
3.2. Pigmentos fotosintéticos
En las plantas superiores, la fotosíntesis es posible debido a la presencia en el
cloroplasto, concretamente en las membranas tilacoidales, de una serie de pigmentos
que tienen capacidad para captar la luz.
Estos pigmentos no están libres en el aparato fotosintético, sino que se encuentran
engarzados dentro de las proteínas fotosintéticas formando los complejos pigmento
proteína. La asociación de estos pigmentos con los polipéptidos es de tipo no
covalente, por lo que, al desnaturalizarse la proteína, los pigmentos se liberan.
(Azcón Bieto & Talón, 2000)
Existen dos tipos básicos de pigmentos fotosintéticos:

3.2.1. Clorofilas
Compuestas por una porfirina que lleva incorporado un átomo de magnesio en
el centro del núcleo tetrapirrólico. El ión Mg2+ está coordinado con los cuatro
átomos de nitrógeno centrales, lo que hace de la clorofila un complejo
extraordinariamente estable. La "cabeza", está unida a una "cola", el fitol, que es
un alcohol de 20 átomos de carbono. Cabeza y cola se unen a través de un enlace
éster en el que intervienen el grupo alcohólico del fitol y el grupo carboxilo de
un ácido propiónico que está unido al anillo IV del núcleo tetrapirrólico.
Existen varios tipos de clorofilas, las más importantes de las cuales son la "a", y
la "b". La clorofila a tiene un grupo -CH3 en el anillo II mientras que la clorofila
b tiene un grupo -CHO en esa misma posición.
Esta sutil diferencia no solo se traduce en cambios de coloración, una verde
azulado para la clorofila a y verde amarillento para la b, sino, además, en una
mayor polaridad de esta última con respecto a la primera.
La polaridad de la molécula está dada por el núcleo tetrapirrólico mientras que
su naturaleza hidrofóbica, esta originada por la presencia de la larga cadena de
fitol. (Torossi Baudino, 2007)
Existen plantas que contienen solamente clorofila "a", como las algas azules, las
diatomeas, las algas rojas y las pardas. Sin embargo muchas de ellas contienen
en los plastidios, pigmentos adicionales tales como otras clorofilas (c, d, e),
fucoxantinas (amarillo pardo) y ficocianina (azulado), que comunican sus
respectivos colores a las algas.

Figura 1: Estructura de la clorofila a. Figura 2: Estructura de la clorofila b.

3.2.2. Carotenoides
Estos pigmentos no sólo son responsables del color de flores (colza, caléndula,
diente de león, crisantemo, etc.) y frutos (tomates, naranjas, pimientos,
albaricoque, melocotón, etc.) para favorecer la polinización y dispersión de
semillas, o de estructuras animales como las plumas y picos de algunos pájaros,
el exoesqueleto de crustáceos y el músculo o la piel de algunos peces para otros
fines, sino que realizan otras funciones que los hacen pigmentos especiales.
Así, son considerados compuestos indispensables para la vida,
fundamentalmente debido a las funciones que llevan a cabo en relación con la
fotosíntesis (captación de luz, fotoprotección, disipación de excesos de energía,
desactivación de oxígeno singlete, etc.), hasta el punto de que, sin ellos, la
fotosíntesis, tal y como se conoce hoy en día, sería inviable. Actúan como
agentes fotoprotectores de la clorofila.
Los carotenoides son compuestos lipídicos, aunque existen algunas excepciones,
por lo que son insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos como
acetona, metanol, éter dietílico, hexano, cloroformo y piridina, entre muchos
otros. Debido a su carácter hidrofóbico se encuentran normalmente en ambientes
lipófilos, como en membranas, si bien su asociación con proteínas o reacciones
de glicosilación les permiten también estar presentes en medios acuosos.
(Meléndez Martínez, Vicario, & Heredia, 2007)

Actúan como pigmentos accesorios en el proceso de la fotosíntesis. Existen dos

tipos de pigmentos carotenoides: carotenos y xantófilas.

 Carotenos

Los carotenos son hidrocarburos isoprenoides que no contienen oxígeno y están

formados por largas moléculas con un sistema de enlaces conjugados
alternantes, dobles y sencillos, rematados en cada extremo por un anillo de
ciclohexano insaturado- tienen color amarillo-anaranjado. (Prácticas de
fisiología Vegetal , s.f.)
Son solubles en disolventes no polares, y los más abundantes son el β- caroteno
y el α- caroteno.
 Xantófilas

Las xantófilas en cambio son derivados oxigenados de los anteriores, solubles

en alcohol, con coloraciones generalmente amarillas y las más abundantes son
la luteína y violaxantina.

Figura 3: Principales carotenos y xantófilas presentes en los pigmentos fotosintéticos.

Clorofilas y carotenoides se encuentran en estrecha asociación entre sí y con
proteínas y lípidos de las membranas en la grana de los cloroplastos. Los pigmentos
fotosintéticos pueden extraerse de los tejidos gracias a su solubilidad en disolventes
orgánicos como éter y benceno. Sin embargo, para que su extracción sea completa,
el primer paso - la trituración – no se realiza con estas sustancias sino con otras que
además de disolver los pigmentos sean solubles en agua, como acetona o alcohol
etílico, ya que gran parte del peso fresco de los tejidos vegetales corresponde al
agua. Posteriormente el extracto acetónico o alcohólico se mezcla con éter o
benceno, en los que se disuelven las clorofilas y parte de los carotenos y xantófilas.
4. DATOS

 ETANOL

Tabla 1: Datos generales y hoja de seguridad del Etanol.

 N – HEXANO

Tabla 2: Datos generales y hoja de seguridad de n- hexano.

 SULFATO DE SODIO

Tabla 3: Datos generales y hoja de seguridad de Sulfato de sodio.

5. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO
 6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 Se lavó los 8 gramos de espinaca, para luego dejarlas secar,

posteriormente se separó las hojas del tallo, desmenuzando estas últimas
en porciones muy pequeñas. Luego añadimos agua caliente para quitar
posibles impurezas.
 Al añadir 10 mL de la mezcla de metanol-éter a las hojas de espinaca,
esta se movió con una bagueta y al observar cambio de coloración se
decantó de inmediato, se obtuvo un líquido amarillo el cual se recogió en
un matraz Erlenmeyer.
Por el color de la solución suponemos que puede
contener una pequeña porción de uno de los
pigmentos de la espinaca, el cual puede ser la
xantofila ya que esta es soluble en metanol-éter.

Figura 4: Líquido amarillento obtenido de la maceración de espinaca con metanol-éter.

  Antes de iniciar con el reflujo se introdujo en el balón un pedacito de
porcelana.
 Durante el proceso de reflujo y a medida que pasaba el tiempo
observamos que las hojitas (desmenuzadas) de espinaca perdían su color
y caso contrario ocurría con la emulsión agua- alcohol etílico- pigmentos,
el cual iba adoptando un color verde intenso.
Esto lo explicamos con el hecho de que al calentar las hojas estás van
perdiendo el líquido contenido en ellas junto con sus pigmentos ya que
estas según la teoría no se encuentran libres en el aparato fotosintético,
pero al nosotros otorgarles calor (agente físico) ocasionamos que se
desnaturalicen las proteínas y como consecuencia se da la liberación de
los pigmentos.
 Después de unos minutos de reposo (emulsión con los 5mL de agua y
10mLde hexano) en la pera de decantación, se observó la formación de
dos fases; en la parte superior un color verde oscuro de un volumen
mucho menor a la parte inferior el cual tenía un color verde claro con
subtonos amarillos (pueden ser porciones de pigmentos ya que el alcohol
etílico disuelve pigmentos).
La separación de la emulsión en dos fases lo asociamos a que el alcohol
es miscible en agua porque los dos son compuestos polares con enlaces
puente de hidrógeno por lo que ellos forman la fase inferior, y la fase
superior se debe a que los pigmentos como la clorofila tienen una larga
cadena hidrófoba de fitol, además los carotenoides se disuelven
perfectamente en n-hexano y en parte las clorofilas.

Figura 5: Formación de dos fases en el proceso de extracción. El círculo rosado encierra la fase hexánica y el circulo
amarillo la fase alcohol-agua.
  El límite de las dos fases mencionadas
anteriormente solo se observaba con claridad al
poner una luz detrás de la pera.

Figura 6: Límite entre la fase

hexánica y la fase alcohol- agua.

 Luego de agregar la salmuera a la fase orgánica, separada anteriormente,

se volvieron a formar dos fases, separando así por completo toda la fase
únicamente orgánica. Esto se explica porque al agregar la solución salina,
este disminuye la tensión superficial del agua y permite que las gotas
colapsen ocasionando la formación de una capa.
 Para asegurarnos de extraer todas las moléculas de agua del producto, no
perceptibles al ojo humano, se usó sulfato de sodio anhidro el cual
cumple la función de un agente desecante (no reacciona con el compuesto
orgánico), tiene alta capacidad, baja intensidad y muy rápida acción;
obteniéndose así el total de pigmentos contenidos en la espinaca.

7. RESULTADOS

 La fase de color verde oscuro obtenida en la pera de decantación es de

procedencia orgánica y se debe a los pigmentos de la espinaca, por sus
características podemos asumir que en su mayoría hay presencia de
Clorofila, pero del tipo a el cual según la teoría es de un color verde
azulado y menos polar que la clorofila b, por lo que se disuelve en el n-
hexano.

8. RECOMENDACIONES

 Al momento de hacer el reflujo y prender el mechero debemos mantener

el fuego suave por precaución, ya que, nos permite tener controlado la
ebullición del sistema con la espinaca.
  Se empieza a tomar tiempo (10 min o 15 min) a partir de que se forman
vapores en el balón.
 Antes de usar el matraz para colocar el pigmento verde extraído es muy
importante lavar con etanol y luego secarlo en el horno para evitar
contaminación del producto obtenido y poder agregar el sulfato de sodio
anhidro.
 Al momento de decantar para separar las fases es conveniente alumbrar la
pera para poder ver el límite de fases y poner hacer una eficiente
separación de estas.

9. CONCLUSIONES

 Los solventes a usar deben tener bajo punto de ebullición para que puedan
ser calentados a temperaturas bajas y deben estar libres de presencia de
ácidos, peróxidos y otros agentes oxidantes.
 Se puede extraer los pigmentos naturales de las plantas con técnicas de
separación como solido-liquido con mezclas de solventes.
 La técnica para extraer solventes se basa en la diferencia de solubilidad de
los pigmentos en alcoholes e hidrocarburos.
 Se logró la extracción de los pigmentos fotosintéticos de la espinaca mas
no una identificación definitiva y total de cada uno de ellos.

10. BIBLIOGRAFÍA

Azcón Bieto, J., & Talón, M. (2000). Fundamentos de Fisiología Vegetal . Mc Graw Hill
Education .

Galagovsky Kurman, L. (s.f.). Química Orgánica- Fundamentos teóricos prácticos para el

laboratorio . Buenos Aires: EUDEBA .

Meléndez Martínez, A., Vicario, I., & Heredia, F. (2007). Pigmentos carotenoides:
consideraciones estructurales y fisicoquímicas. Archivos Latinoamericanos de
Nutrición, Volumen 7, 109-113.

Prácticas de fisiología Vegetal . (s.f.). Obtenido de Extracción de pigmentos fotosintéticos

mediante disolventes químicos:
http:/http://www4.ujaen.es/~amocana/F.V/separacion%20de%20pigmentos%20medi
ante%20disolventes.pdf
Torossi Baudino, F. (2007). Una experiencia sencilla con fundamentos complejos . Anales de
Química , 45-51.

11. ANEXOS
11.1. Aplicación industrial

Diversas aplicaciones de los carotenoides obtenidos de las microalgas

En las microalgas los carotenoides pueden encontrarse en las membranas tilacoidales de

los cloroplastos o en el interior de cuerpos lipídicos.

De los más de 600 carotenoides conocidos, sólo un número reducido se utiliza

comercialmente. Entre estos se encuentran 8-caroteno, licopeno, astaxantina,
cantaxantina, criptoxantina, zeaxantina y luteína. La limitación en el número de
carotenoides disponibles comercialmente se debe a la dificultad y elevado costo de su
síntesis, más que a una falta de aplicación práctica. Las aplicaciones comerciales de los
carotenoides son variadas. Se emplean como colorantes en industrias alimentarias.
Algunas xantofilas, como luteína, cantaxantina y astaxantina se utilizan como aditivos en
piensos para incrementar la pigmentación de pollos y yemas de huevos, así como para
aumentar la fertilidad del ganado.

También se utilizan en acuicultura para incrementar el color de salmónidos y crustáceos.

Los carotenoides tienen también aplicación en la industria cosmética.

Por otro lado, se han descrito diversas propiedades terapéuticas para los carotenoides.
Numerosos estudios epidemiológicos han demostrado que un alto consumo de
carotenoides en la dieta disminuye el riesgo de contraer determinadas enfermedades
asociadas con la formación de radicales libres. Entre dichas enfermedades se encuentran
diversos tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares, cataratas y otros procesos
degenerativos asociados con el envejecimiento.

Se cree que el papel antioxidante de los carotenoides podría ser responsable de su acción
anti-cáncer. El B-caroteno también se utiliza en el tratamiento médico de diversas
enfermedades de la piel, en enfermedades hereditarias relacionadas con la síntesis del
grupo hemo y además estimula la respuesta inmune.

La mayoría de los carotenoides utilizados comercialmente se obtienen mediante síntesis

química. Los seis carotenoides sintéticos de importancia comercial son: B-apocarotenal,
éster etílico del ácido B-apo8' -carotenoico, citranaxantina, B-caroteno, cantaxantina y
astaxantina.

El incremento en el uso comercial de carotenoides naturales durante los últimos años se

debe a las regulaciones, cada vez más restrictivas, sobre el uso de aditiyos sintéticos en
la industria alimentaria y al gran desarrollo de la acuicultura.
Todo ello ha impulsado el desarrollo del cultivo de microalgas para la obtención de
carotenoides, habiéndose registrado numerosas patentes. Sin embargo, en la actualidad,
sólo dos microalgas unicelulares clorofíceas son fuentes comerciales reconocidas de
carotenoides: la microalga flagelada halofílica Dunaliella salina, que acumula B-caroteno
y el alga verde de agua dulce Haematococcus pluvialis que acumula astaxantina.

Las condiciones extremas requeridas para la producción de β- caroteno por Dunaliella

permiten que se pueda cultivar a la intemperie con fines comerciales en sistemas abiertos
simples, sin agitación o agitados por paletas. Se han establecido plantas de producción
para el cultivo de esta microalga como fuente de β-caroteno en Australia, Estados Unidos
e Israel. Las dos industrias australianas, Western Biotechnology Ltd. y Betatene Ltd.,
utilizan sistemas de cultivo extensivo muy simples, con estanques de 5 a más de 50 Ha.

El β-caroteno de Dunaliella se comercializa actualmente de dos formas: cápsulas o

tabletas del alga desecada, como suplemento dietético; y extracto de B-caroteno en aceite,
que contiene del 1,5 al 30% de Bcaroteno, para su uso como colorante alimentario en
sustitución del Bcaroteno sintético. En los últimos años el sector de mayor expansión en
la comercialización del B-caroteno ha sido como suplemento dietético, sólo o en
combinación con otros antioxidantes y vitaminas

Haematococcus es un alga biflagelada, que pierde la movilidad y forma aplanosporas

provistas de una gruesa pared en condiciones desfavorables de crecimiento. Este cambio
morfológico va acompañado por la acumulación de grandes cantidades de astaxantina en
la región que rodea al núcleo, llegando a acumular hasta un 5% del peso seco de esta
xantofila, en su mayor parte esterificada. En cultivos estancos de Haematococcus las
células móviles predominan durante la fase exponencial de crecimiento, mientras que las
aplanosporas ricas en astaxantina se forman en la fase estacionaria.

La empresa Microbio Resources Inc., en California, ha desarrollado un proceso para la

producción comercial de astaxantina por Haematococcus pluvialis. (Guerrero, y otros)