Efecto de xenoesteroides sobre la

determinación y diferenciación sexual en

larvas de pejerrey
Anelisa González; Lucila Elordi; Melina Barrionuevo
Disruptores/Desorganizadores endocrinos
“Una sustancia exógena o mezcla de sustancias que altera una función o
varias del sistema endocrino, y consecuentemente produce efectos
adversos en un organismo, en su progenie o en poblaciones” OMS 2002.
Eje:

Hipotálamo

Hipofisario

Retroalimentación positiva y negativa

Gonadal
Pejerrey: Odontesthes bonariensis
(Mariano Elisio, 2013)
 Etapa reproductiva
Desoves

Junio Octubre-Enero Marzo-Mayo

(Strussmann et, al 1996, 1997, 2002, 2003, 2005; Elisio, 2012; Fernandino et,
al 2008ª, 2008b)
 (Chalde et al, 2012)

10 días

10 semanas
Objetivo general

Evaluar los mecanismos de acción y la relevancia ambiental de

xenoesteroides sobre la determinación y diferenciación sexual en larvas de
pejerrey (Odontesthes bonairiensis)

Objetivos específicos

1.Mecanismos de Acción
- Hallar el LC50 y NOEC para cada xenoesteroide.
- Estudiar los efectos de la exposición a xenoesteroides en agua
sobre:
a)la expresión de genes específicos, b) la diferenciación gonadal, c) la
relación de sexos y d) el crecimiento de las larvas.

durante el período de determinación y diferenciación
sexual .

2.Relevancia Ambiental
- Evaluar los efectos de xenoesteroides provenientes de los desagües
cloacales vertidos en la laguna de Chascomús sobre la determinación y la
diferenciación sexual de larvas.
MECANISMO DE ACCIÓN
 Bioensayo en Laboratorio

• Curva de Decaimiento (E2, EE2, T, MeT): Me permite establecer cada cuánto

tiempo será necesario renovar la concentración del tóxico deseada en la
unidad de ensayo (pecera).

Agua + vehículo para esteroides (DMSO)/ Temp 25 ± 0,5°C/

L16:O8.

Determinación de la [xenoesteroides] cada 24 hs durante 96

hs.

• Ensayo exploratorio (Range Finding Test): 1-10-100 mg/l.

• CL50 (Concentración Letal sobre el 50% de la población): Se realizará para

cada xenoesteroide con 5 concentraciones por triplicado durante 96 hs.
Temp 25 ± 0,5°C. L16:O8.
 Bioensayo en Laboratorio

• NOEC (Non Observed Effect Concentration): es la máxima

concentración de xenobiótico para la cual la respuesta de los
organismos no es significativamente diferente del control.

Para el caso de aquellos ensayos de toxicidad en los que se evalúan por

ejemplo la inhibición de parámetros como crecimiento, reproducción,
elongación de raíz, las respuestas se analizan mediante test de hipótesis.
Los datos se analizan para determinar si la respuesta en cada
concentración ensayada es significativamente diferente de la obtenida
para el control.

Bioensayo en larvas de Medaka (Oryzias latipes)

NOEC (reversión
Xenoesteroide CL50
sexual)
E2 0,1 µg/l 3,9 mg/l
EE2 0,03 µg/l 1,5 mg/l
MeT >0,1 µg/l >10 mg/l

Hagino et al., 2001

 No-Monotónicas
Curvas dosis-respuesta
Monotónicas

(Vanderverg et al, 2012)

Exposición de larvas Bioensayo en Laboratorio

Modelo de exposición para cada xenoesteroide: E2, EE2, T y MeT. 5

concentraciones, más el control. Por triplicado.

* Renovación del esteroide de acuerdo a la curva de decaimiento

previamente estudiada

Fotoperiodo L16:O8 Temperatura: 25ºC ± 0.5 ºC

400 c/ 200L
Metodología de Muestreo Bioensayo en Laboratorio
RA RE
cyp19a1a
amh
hsd11b2
Semanas pos-eclosión

0 2 6 10

Determinación y diferenciación sexual

Exposición

10
2 4 6

Se toman 10 individuos de cada tratamiento

- Se miden y pesan
- Se separa el tronco para extracción de RNA y subsecuente
determinación de la expresión génica por RTqPCR.

Se toman 5 individuos de cada tratamiento para determinación del

sexo y evaluación del desarrollo gonadal por histología
Estadística: ANOVA EN BLOQUE

 Crecimiento somático
 Expresión relativa de cyp19a1a, hsd11B2, amh, RE y RA

Estadística: Binomial Test

 Proporción de sexos

RESULTADOS ESPERADOS

 Esperamos que los compuestos estrogénicos promuevan la formación

de hembras, y por lo tanto durante la formación del ovario veríamos
dicho comportamiento en los bioindicadores seleccionados. Y de lo
contrario, para los compuestos androgénicos con la promoción de
machos.
RELEVANCIA AMBIENTAL
Hipótesis: Los xenoesteroides vertidos por el efluente cloacal a la laguna de
Chascomús afectan a la diferenciación y a la determinación de las larvas de
pejerreyes.
Sitio de estudio: Laguna de Chascomús, Pcia. de Buenos Aires
Diseño experminetal

400 larvas cultivadas

en bioterio en la 2da
semana de
desarrollo Permite el
intercambio
UNIDAD EXPERIMENTAL (UE): la bolsa con el medio
RÉPLICAS: 3 bolsas por cada sitio
(salida del efluente-control)

En la semana 2-4 y 6 sacamos 10 larvas de

cada UE para medir los bioindicadores

Además, sacamos muestra de agua de cada sitio para medir: turbidez,

oxígeno disuelto, conductividad y PH

 Colocamos sensores de temperatura data loggers en una bolsa del

efluente y en otra del control para controlar la temperatura del agua, ya que
afecta la determinación sexual de las larvas.

 En la 10ma semana sacamos las larvas para hacer histologia (N = 5).

Análisis estadístico:

 Evaluar si hay diferencias en las concetraciones de xenoesteroides,

temperatura, calidad del agua (turbidez, oxígeno disuelto, PH y
conductividad) entre el grupo del efluente y el control y a lo largo del
desarrollo de las larvas.
 Diseño en bloque: Comparar la concentración de los bioindicadores entre
las larvas expuestas al agua a la salida del efluente y las expuestas en la
zona control.
 Comparar mediante un analísis Binomial la proporción de sexos en el sitio
control y a la salida del efluente.

Resultados esperados:

Esperamos que el sitio del efluente tenga mayores concentraciones de

xenoesteroides que el sitio control.

 Esperamos encontrar resultados diferentes a los hallados en el laboratorio

debido a que aquí los compuestos se encuentran en una mezcla y en
consecuencia podríamos hallar efectos de sinergismo y/o antagonismos, los
cuales serán dirimidos a partir de los resultados anteriores.