Dozarea creatininei

Creatinina reprezintă un deşeu metabolic care se găseşte în cantitate mai mare în urină
decât în plasmă. Ea se formează la nivelul ficatului şi rinichiului şi se elimină prin urină.
Creatinina este cel mai constant constituent azotat din sânge, deoarece nu este influenţat
de regimul alimentar, efortul fizic sau starea altor organe; variază doar în funcţie de eliminarea sa
renală. Concentraţia serică a creatininei este un bun indicator al filtrării glomerulare şi creşte
atunci când mai mult de 50% din funcţia renală este pierdută.

Determinarea creatininei serice (metoda Jaffė)

Principiul metodei
Creatinina, în mediu puternic alcalin, reduce acidul picric la acid picramic de culoare
galben – portocalie, fotometrabil. Intensitatea culorii este direct proporţională cu concentraţia
creatininei.

Materiale necesare
eprubete de centrifugă
stativ cu eprubete
pipete de sticlă
pipete semiautomate
conuri
vase cu dezinfectant
centrifugă
spectrofotometru
cuve 1 cm
tifon
reactivi

Reactivi
Soluţie saturată de acid picric 1,2 g %
NaOH 10%
Soluţie standard stoc de creatinină 100 mg % ml HCl 0,1N
Soluţie standard de lucru de creatinină 1mg/100 ml. Se diluează 1 ml stoc de creatinină la
100 ml de apă distilată.

Proba
Ser nehemolizat

Tehnica de lucru
 Deproteinizarea
Se pipetează în două eprubete de centrifugă conform tabelului următor:

Tabelul XXII

Reactivi Proba Standard

Sol acid picric 3 ml 3 ml
Standard de lucru 1 ml
Ser 1

Se omogenizează conţinutul eprubetelor şi se centrifughează timp de 5 minute la 3000

turaţii/minut.
Reacţia de culoare
Se pregătesc trei eprubete: martor, standard, probă
Se pipetează în eprubete conform tabelului următor:

Tabelul XXIII

Reactivi Martor Standard Proba

Supernatant probă 2 ml
Supernatant standard 2 ml
Apă distilată 0,5 ml
Sol acid picric 1,5 ml
Sol NaOH 10% 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml

Se agită şi după 20 de minute se citesc extincţiile probei (Ep) şi standardului (Es) faţă de
martor la lungimea de undă de 530 nm, în cuve de 1cm.

Calcul

Cp = Ep / Es × Cs
mg creatinină /100 ml ser = Ep / Es × 1

unde:
Cp = concentraţia probei
Ep = extincţia probei
Es = extincţia standardului
Cs = concentraţia standardului (1mg/100 ml)

Valori normale creatinină

În sânge: bărbaţi 0,6 – 1,1 mg %

femei 0,5 – 0,9 mg %
 În urină: 1 – 1,5 g / 24 ore

Întrucât eliminările de creatinină sunt în legătură cu greutatea corporală (şi mai ales cu
masa musculară), valorile normale pot fi exprimate sub formă de coeficient creatininic,
reprezentând eliminările de creatinină pe kg corp şi pe 24 de ore.
Calculate astfel, valorile normale ale creatininei urinare devin:

bărbaţi: 20 – 26 mg/kg/24 ore

femei: 14 – 22 mg/kg/24 ore
copii: 6,4 – 21 mg/kg/24 ore

Variaţii patologice

Valori crescute:
Creatinemia rămâne constantă atât timp cât factorul renal de eliminare nu este afectat.
Modificările acesteia, chiar minore, pot fi semnificative pentru diagnostic deoarece creşterea
acestor valori este direct proporţională cu severitatea bolii.
 cauze prerenale:
insuficienţa cardiacă congestivă;
deshidratări masive prin:
vărsături incoercibile;
diaree;
administrare excesivă de diuretice;
transpiraţii abundente;
diabet zaharat;
diabet insipid;
gută;
afecţiuni hepatice;
miopatii;
polimiozite, etc.
 cauze renale:
insuficienţă renală acută sau cronică;
 cauze postrenale:
obstrucţii ale căilor urinare:
neoplasm;
litiază renală;
adenom de prostată.

În cazul transplantului renal, creşteri cât de mici ale creatininei faţă de valorile normale
ne indică respingerea grefei.
Valori scăzute:
insuficienţă renală cronică.
 Metoda de dozare enzimatică a ureei cu urează
(metodă specifică)

Principiul metodei
Ureea este hidrolizată sub acţiunea ureazei şi este transformată în amoniac şi dioxid de
carbon.
În mediu alcalin ionii de amoniu împreună cu salicilatul şi hipocloritul de sodiu, formează
un compus de culoare verde, fotometrabil. Intensitatea culorii este direct proporţională cu
concentraţia ureei.

urează
Uree + H2O 2NH3 + CO2

Ureaza este o amidază, enzimă care catalizează hidroliza legăturilor C – N, altele decât
cele peptidice. Ea scindează hidrolitic legăturile amidice din uree.

Materiale necesare
eprubete
stativ pentru eprubete
pipete de sticlă
pipete semiautomate
conuri
termostat
spectrofotometru
cuve 1 cm
vase cu soluţie dezinfectantă
apă distilată
tifon
reactivi

Reactivi
Reactiv R1:
urează
soluţie tampon fosfat
salicilat de sodiu
nitroprusiat de sodiu
Reactiv R2:
hipoclorit de sodiu
NaOH
Standard uree 8,325 mmol/l (50 mg/dl)

Proba
Ser sau plasmă heparinizată (nu se utilizează anticoagulant ce conţine fluorură sau ioni de
amoniu)
 Urină diluată cu apă distilată 1:100 (rezultatul se înmulţeşte cu 100)

Tehnica de lucru
Se pregătesc trei eprubete: martor, standard, probă.
Se pipetează în eprubete conform tabelului XVIII.

Tabelul XVIII

Reactivi Martor Standard Proba

Reactiv R1 1 ml 1 ml 1 ml
Apă distilată 10 μl − −
Standard − 10 μl −
Probă − − 10 μl
Se agită şi se incubează timp de 5 minute la 37ºC apoi se adaugă
Reactiv R2 1 ml 1 ml 1 ml

Se agită din nou şi se incubează timp de 5 minute la 37ºC.

Se citesc extincţiile probei (Ep) şi standardului (Es) faţă de martor la lungimea de undă de
578 nm, în cuve de 1cm.

Calcul (pentru ser şi plasmă)

Cp = Ep / Es × Cs
mg uree / 100 ml ser = Ep / Es × Cs

unde:
Cp = concentraţia probei
Ep = extincţia probei
Es = extincţia standardului
Cs = concentraţia standardului (50 mg/dl)

Valori normale uree

sânge: 20 − 40 mg % (2,49 −7,47 mmol/l)

urină: 24 − 30 g / 24 ore

Variaţii fiziologice

Concentraţia sanguină a ureei are variaţii strâns legate de vârstă, cu creşteri până la 50
mg/100 ml ser la subiecţi peste 60 de ani.
Alimentaţia bogată în proteine determină valori la limita superioară a normalului.
În ultimul trimestru de sarcină se constată valori mai scăzute, deoarece fătul creşte rapid
folosind aminoacizii materni.
Variaţii patologice ale ureei în sânge

Valori crescute
 cauze renale:
glomerulonefrite acute şi cronice;
nefroangioscleroze benigne sau maligne;
nefropatii tubulare toxice;
TBC renală;
tumori renale;
rinichi polichistic;
hidronefroze;
hipertrofia prostatei;
calculoză renală;
insuficienţă renală acută sau cronică (permite aprecierea gradului leziunilor
parenchimatoase).
 cauze extrarenale:
hipercatabolism proteic ce asociază obligatoriu o componentă renală de origine
ischemică;
stările de toxicoză şi şoc datorate hemoragiilor, arsurilor, traumatismelor.

Valori scăzute
insuficienţa hepatică gravă.
 Dozarea proteinelor totale prin metoda biuretului

Reacţia biuretului este comună tuturor proteinelor, deoarece pune în evidenţă prezenţa
legăturilor peptidice din structura moleculară a acestora. Ea este pozitivă şi în cazul oligo şi
polipeptidelor. Aminoacizii în general nu dau această reacţie de culoare, cu excepţia serinei şi
treoninei.
Cel mai simplu compus care produce această reacţie este biuretul, care se obţine prin
încălzirea ureei la 180°C cu eliminarea unei molecule de amoniac.

Principiul metodei
Reacţia biuretului se bazează pe formarea unor compuşi de tip chelalic între legătura
peptidică şi ionul de Cu²+, în mediu alcalin, cu apariţia unei culori violet sau albastră.

Valori normale

nou-născuţi: 5,2 – 9,0 g/100 ml ser

copii sub 3 ani: 5,6 – 8,6 g/100 ml ser
copii peste 3 ani şi adulţi: 6,6 – 8,6 g/100 ml ser

Variaţii patologice

Valori scăzute ale proteinelor totale (hipoproteinemii):

malnutriţie;
malabsorbţie;
maldigestie;
ciroză hepatică;
sindrom nefrotic;
glomerulonefrită;
insuficienţă renală cronică;
ileus mecanic;
hemoragii cronice;
arsuri întinse;
amiloidoză;
peritonită;
hipertiroidie;
hiperhidratare.
Valori crescute ale proteinelor totale (hiperproteinemii):
ciroză hepatică în stadiul compensat;
sarcoidoză;
paraproteinemii;
deshidratare („pseudohiperproteinemie”);
diaree;
stări febrile;
diabet insipid;
tuberculoză
 Determinarea activităţii peptidice
Teste de disproteinemie

Echilibrul dinamic normal al proteinelor sanguine poartă denumirea de euproteinemie şi

priveşte atât cantitatea totală de proteine cât şi raporturile cantitative dintre fracţiunile proteice.
Prin disproteinemie se înţelege o modificare cantitativă şi calitativă a proteinelor
plasmatice, care apare ca urmare a unui mecanism fiziopatologic declanşat de o serie de
afecţiuni. Disproteinemia reprezintă incapacitatea organismului de a menţine constante şi în
limite normale fracţiunile sale proteice. Paraproteinemia presupune apariţia de proteine atipice
(paraproteine), absente în plasma normală şi este subordonată disproteinemiei (fiecare
disproteinemie este însoţită de apariţia de paraproteine).
În ser, în condiţii fiziologice, proteinele reprezintă un sistem coloidal stabilizat prin
moleculele de albumină. În cazul modificării raportului normal albumină/globuline, ca urmare a
unor stări patologice însoţite de scăderi ale factorilor stabilizanţi (albuminele) sau creşteri ale
factori precipitanţi (globulinele), se produce un dezechilibru în sistemul coloidal al serului
(instabilitate/labilitate coloidală).
Testele de disproteinemie (testele de labilitate serică) alcătuiesc un ansamblu de reacţii în
care apare o turbiditate sau o floculare prin adăugarea diferiţilor reactivi în ser, punând astfel în
evidenţă existenţa dezechilibrului între diferitele fracţiuni proteice (modificarea raportului
albumină/globuline).
În principiu, la pH = 7,4, stabilitatea coloidală a globulinelor devine mai mică decât a
albuminei. Această labilitate particulară a serului se poate pune în evidenţă prin adăugarea
următorilor reactivi: săruri ale metalelor grele – HgCl2 (test Takata-Ara, reacţia Gross), CaCl2
(test Weltmann), ZnSO4 (test Kunkel); substanţe organice – timol (metoda Mac Lagan), etc.
Denumite impropriu probe funcţionale hepatice (sunt incluse în testele de investigare a
sindromului de hiperactivitate mezenchimală hepatică dar nu sunt specifice ficatului), testele de
disproteinemie permit evidenţierea modificării stării coloidale a proteinelor plasmatice atât în
afecţiunile hepatice, cât şi într-o serie de alte afecţiuni extrahepatice. Testele de disproteinemie
oferă indicaţii orientative (în special asupra funcţiei hepatice), iar în cazul în care aceste teste
sunt modificate, se impune şi efectuarea de determinări cu metode specifice.

VIII.3.1 Testul timol (metoda Mac Lagan)

Principiul metodei
Prin adăugarea soluţiei tampon saturată de timol (pH = 7,4) la o probă de ser apare o
turbiditate în cazul în care globulinele sunt crescute (în special α2-globulinele) sau albuminele
sunt scăzute. Turbiditatea se datorează apariţiei unui complex timol – globulinic – fosfolipidic.
Gradul de turbiditate se determină fotometric la 660 nm, în cuve de 1 cm.

Materiale de lucru
eprubete
stativ eprubete
pipete de sticlă
pipete semiautomate
 conuri
spectrofotometru
cuve 1 cm
vase cu substanţă dezinfectantă
tifon
reactivi
Reactivi
Reactiv timol

Proba
Ser

Tehnica de lucru
Într-o eprubetă cu 0,05 ml de ser proaspăt se adaugă 3 ml de reactiv timol în tampon -
veronal.
Se agită şi se lasă timp de 30 de minute în repaus la temperatura camerei.
Se evaluează turbiditatea prin comparare cu o scală de etalonare sau fotometric prin citire
la Spekol faţă de apă distilată (λ = 660 nm, factor de pantă 35).
Rezultatul testului se exprimă în unităţi Mac Lagan (UML).

Figura 55 Testul timol

Valori normale

0 – 4 UML
Variaţii patologice

Valori crescute se înregistrează în:

hepatopatii difuze (infecţioase, toxice);
ciroză hepatică;
inflamaţii cronice (poliartrita reumatoidă, reumatismul articular acut);
colagenoze;
endocardita subacută;
TBC pulmonar;
 nefropatii;
mielom multiplu;
infecţii virale;
neoplasm.

VIII.3.2 Testul cu sulfat de zinc (testul Kunkel)

Principiul metodei
O soluţie tamponată de sulfat de zinc (pH = 7,4) adăugată la o probă de ser determină
creşterea turbidităţii serului în cazul prezenţei γ-globulinelor în cantitate crescută (direct
proporţional cu concentraţia acestora). Turbiditatea apărută se datorează formării unui complex
metal – γ-globuline şi urme de β-globuline (complex insolubil).

Materiale de lucru
eprubete
stativ eprubete
pipete
pipete semiautomate
conuri
spectrofotometru
cuve 1 cm
vase cu substanţă dezinfectantă
tifon
reactivi

Reactivi
Reactiv Kunkel (sulfat de zinc tamponat)

Proba
Ser

Tehnica de lucru
Într-o eprubetă cu 0,05 ml de ser proaspăt se adaugă 3 ml de reactiv Kunkel (sulfat de
zinc tamponat).
Se amestecă conţinutul eprubetei prin răsturnare de câteva ori.
Se lasă timp de 30 de minute în repaus la temperatura camerei.
Se evaluează turbiditatea prin comparare cu scala turbidimetrică de etalonare de la timol
sau fotometric, prin citire la Spekol faţă de apă distilată (λ = 650 nm, factor de pantă 40).
Rezultatul testului se exprimă în unităţi turbidimetrice.
 Figura 56 Testul cu sulfat de zinc

Valori normale

2 – 9 unităţi turbidimetrice

Variaţii fiziologice

Valorile apar crescute la persoanele vârstnice (până la 12 unităţi) şi scăzute în primele 6

luni de viaţă extrauterină.

Variaţii patologice

Testul Kunkel este mai specific ca testul timol şi mai selectiv pentru γ-globuline, punând
în evidenţă variaţia acestora şi prezintă interes în ceea ce priveşte prognosticul şi evoluţia unei
hepatite infecţioase.