Las pautas de MIQE: Información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR

en tiempo real
Actualmente, existe una falta de consenso sobre la mejor manera de realizar e interpretar experimentos
cuantitativos de PCR en tiempo real (qPCR). El problema se ve agravado por la falta de suficientes
detalles experimentales en muchas publicaciones, lo que impide la capacidad del lector para evaluar
críticamente la calidad de los resultados presentados o para repetir los experimentos.
RESUMEN:
Seguir estas pautas fomentará una mejor práctica experimental, permitiendo una interpretación más
confiable e inequívoca de los resultados de qPCR.
CONTENIDO:
Información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real (MIQE)
se centran en la fiabilidad de los resultados para ayudar a garantizar la integridad de la literatura
científica, promover la coherencia entre laboratorios y aumentar la transparencia experimental. MIQE
es un conjunto de directrices que describen la información mínima necesaria para evaluar los
experimentos de qPCR. Se incluye una lista de verificación para acompañar el envío inicial de un
manuscrito al editor. Al proporcionar todas las condiciones experimentales relevantes y las
características del ensayo, los revisores pueden evaluar la validez de los protocolos utilizados. La
divulgación completa de todos los reactivos, secuencias y métodos de análisis es necesaria para
permitir que otros investigadores reproduzcan los resultados. Los detalles de MIQE deben publicarse
en forma abreviada o como un suplemento en línea.
La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), basada en la fluorescencia, con su capacidad para detectar
y medir cantidades diminutas de ácidos nucleicos en una amplia gama de muestras de numerosas
fuentes, es la tecnología habilitadora por excelencia del diagnóstico molecular, las ciencias de la vida
y la agricultura. y la medicina.
Su simplicidad conceptual y práctica, junto con su combinación de velocidad, sensibilidad y
especificidad en un ensayo homogéneo, lo han convertido en la piedra de toque para la cuantificación
de ácidos nucleicos. Además de su uso como herramienta de investigación, se han desarrollado
muchas aplicaciones de diagnóstico, incluida la cuantificación microbiana, la determinación de la
dosificación genética, la identificación de transgenes en alimentos modificados genéticamente, la
evaluación del riesgo de recurrencia del cáncer y las aplicaciones para uso forense. Esta popularidad
se refleja en la prodigiosa cantidad de publicaciones que informan datos de qPCR, que invariablemente
utilizan diversos reactivos, protocolos, métodos de análisis y formatos de informes. Esta notable falta
de consenso sobre la mejor manera de realizar los experimentos de qPCR tiene la consecuencia
adversa de perpetuar una serie de fallas graves que gravan su estado como criterio independiente.
Las deficiencias técnicas que afectan el rendimiento del ensayo incluyen las siguientes: (a)
almacenamiento, preparación y calidad de los ácidos nucleicos inadecuados de la muestra, que
producen resultados altamente variables; (b) mala elección de cebadores de transcripción inversa y
cebadores y sondas para la PCR, lo que lleva a un rendimiento de ensayo ineficiente y menos robusto
y (c) datos inapropiados y análisis estadísticos, generando resultados que pueden ser altamente
engañosos. En consecuencia, existe el peligro real de que la literatura científica se corrompa con una
multitud de publicaciones que informan resultados inadecuados y conflictivos. La publicación y
retractación de un informe de “Avance del año 2005” de Science proporciona una advertencia
inquietante. El problema se ve agravado por la falta de información que caracteriza a la mayoría de los
informes de los estudios que han utilizado esta tecnología, ya que muchas publicaciones no
proporcionan detalles experimentales suficientes para permitir al lector evaluar críticamente la calidad
de los resultados presentados o repetir los experimentos. Específicamente, la información sobre
adquisición y manejo de muestras, calidad e integridad del ARN, detalles de transcripción reversa,
eficiencias de PCR y parámetros de análisis se omiten con frecuencia, mientras que la normalización
de la muestra se realiza habitualmente contra genes de referencia únicos sin una justificación
adecuada.

a Toda la información esencial (E) debe enviarse junto con el manuscrito. La información deseable (D) debe ser presentada si está disponible. Si los cebadores son de
RTPrimerDB, la información sobre el objetivo de qPCR, los oligonucleótidos, los protocolos y la validación están disponibles en esa fuente.

b FFPE, fijados con formalina, embebidos en parafina; RIN, número de integridad del ARN; RQI, indicador de calidad de ARN; GSP, cebado específico de genes; dNTP,
desoxinucleósido trifosfato.

c La evaluación de la ausencia de ADN con un ensayo de transcripción sin reversión es esencial cuando se extrae el ARN por primera vez. Una vez que la muestra se haya
validado como libre de ADN, la inclusión de un control de transcripción no inversa es deseable pero ya no es esencial.

d La divulgación de la secuencia de la sonda es altamente deseable y se recomienda encarecidamente; sin embargo, dado que no todos los proveedores de ensayos
comerciales prediseñados proporcionan esta información, no puede ser un requisito esencial. Se desaconseja el uso de tales ensayos.
El objetivo de este documento es proporcionar a los autores, revisores y editores especificaciones para
la información mínima, establecida en la Tabla 1, que se debe informar para un experimento de qPCR
para garantizar su relevancia, precisión, interpretación correcta y repetibilidad. MIQE (Información
mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real, pronunciado mykee)
se basa en pautas similares elaboradas para el análisis de micro matrices de ADN, experimentos de
proteómica, especificación de la secuencia del genoma y las que están en discusión para el trabajo de
interferencia de ARN y la metabolómica, todo lo cual son iniciativas coordinadas bajo el paraguas de
MIBBI (Información mínima para investigaciones biológicas y biomédicas, http://www.mibbi.org). No se
propone la inclusión obligatoria de un lenguaje de informe común para permitir el intercambio de datos,
aunque se prevé que una actualización futura de estas directrices podría incluir dicha recomendación.
Más bien, estas directrices apuntan a la fiabilidad de los resultados para ayudar a garantizar la
integridad de la literatura científica, promover la coherencia entre los laboratorios y aumentar la
transparencia experimental. Deben leerse junto con las publicaciones recientes que tratan en
profundidad el tema de la estandarización de qPCR.
1. Nomenclatura
Algunos términos requieren estandarización para garantizar la aclaración:
1.1 Proponemos que se utilice la abreviatura qPCR para la PCR cuantitativa en tiempo real y que se
use RT-qPCR para la transcripción inversa – qPCR. La aplicación de la abreviatura RT-PCR a qPCR
causa confusión y es inconsistente con su uso para la transcripción inversa (PCR) convencional
(heredada).
1.2 Los genes utilizados para la normalización deben denominarse genes de referencia, no genes de
mantenimiento.
1.3 Las sondas TaqMan deben denominarse sondas de hidrólisis.
1.4 El término sonda FRET (sonda de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) se
refiere a un mecanismo genérico en el que la emisión / extinción se basa en la interacción entre los
estados de excitación de electrones de 2 moléculas de colorante fluorescente. Las sondas de tipo
LightCycler deben denominarse sondas de doble hibridación.
1.5 El Oxford English Dictionary enumera solo la cuantificación, no cuantificacion por lo tanto, el
primero es la palabra adecuada.
1.6 La nomenclatura que describe el ciclo de PCR fraccional utilizado para la cuantificación es
inconsistente, con el ciclo de umbral (Ct), el punto de cruce (Cp) y el punto de despegue (TOP)
actualmente utilizados en la literatura. Todos estos términos se refieren al mismo valor del instrumento
en tiempo real y fueron acuñados por fabricantes competidores de instrumentos en tiempo real por
razones de diferenciación del producto, no por precisión científica o claridad. Proponemos el uso del
ciclo de cuantificación (Cq), de acuerdo con el estándar de datos RDML (Lenguaje de marcado de
datos de PCR en tiempo real) (http://www.rdml.org).

Consideraciones conceptuales
Para explicar y justificar las directrices, nos parece útil revisar una serie de cuestiones clave
relacionadas con los experimentos de qPCR:
2.1 La sensibilidad analítica se refiere al número mínimo de copias en una muestra que se puede medir
con precisión con un ensayo, mientras que la sensibilidad clínica es el porcentaje de individuos con un
trastorno dado que el ensayo identifica como positivo para esa condición. Por lo general, la sensibilidad
se expresa como el límite de detección (LOD), que es la concentración que se puede detectar con una
certeza razonable (comúnmente se usa el 95% de probabilidad) con un procedimiento analítico
determinado. El LOD más sensible posible teóricamente es 3 copias por PCR, suponiendo una
distribución de Poisson, un 95% de probabilidad de incluir al menos 1 copia en la PCR y detección de
copia única. Los procedimientos experimentales suelen incluir pasos de procesamiento de muestras
(es decir, extracción) y, cuando sea necesario, la transcripción inversa. Si los cambios de volumen y
las eficiencias de estos pasos se tienen en cuenta, la LOD más sensible posible teóricamente se puede
expresar en unidades relevantes para el experimento, como copias por nanogramo de tejido. Los
resultados experimentales menores que el LOD teóricamente posible nunca deben ser reportados.
También se deduce que los resultados de "0" no tienen sentido y son engañosos. Las estimaciones
de LOD en los análisis de qPCR se complican por la naturaleza logarítmica de Cq, porque Cq no está
definido cuando la concentración de la plantilla es cero. La determinación y el modelo apropiados del
LOD en la qPCR son el foco de la investigación continua.
2.2 La especificidad analítica se refiere al ensayo de qPCR que detecta la secuencia objetivo apropiada
en lugar de otras dianas no específicas que también están presentes en una muestra. La especificidad
diagnóstica es el porcentaje de individuos sin una condición dada a quienes el ensayo identifica como
negativos para esa condición.
2.3 La precisión se refiere a la diferencia entre las concentraciones medidas y experimentales de forma
experimental, presentadas como cambios en el pliegue o estimaciones del número de copias.
2.4 La repetibilidad (precisión a corto plazo o varianza intraensayo) se refiere a la precisión y robustez
del ensayo con las mismas muestras analizadas repetidamente en el mismo ensayo. Puede
expresarse como la desviación estándar para la varianza de Cq. Alternativamente, se puede usar el
SD o el CV para el número de copias o la variación de concentración. Sin embargo, los CV no deben
usarse con Cqs.
2.5 La reproducibilidad (precisión a largo plazo o variación entre ensayos) se refiere a la variación en
los resultados entre ejecuciones o entre diferentes laboratorios y se expresa típicamente como la SD
o CV de los números de copia o concentraciones. Los valores Cq generados a partir de diferentes
ejecuciones están sujetos a una variación intrínseca inherente; por lo tanto, no es apropiado informar
la variación de Cq entre procesos
Las publicaciones que describen las concentraciones de ARNm para los genes objetivo deberían
aclarar con precisión cuáles son los objetivos. Las transcripciones de la mayoría de los genes humanos
y muchos genes en otros organismos multicelulares se empalman alternativamente, y estas variantes
de empalme especifican isoformas de proteínas alternativas, con una variación en los patrones de
empalme informados en diferentes tejidos o en diferentes etapas de desarrollo. En consecuencia, los
ensayos de RT-qPCR basados en exones individuales pueden detectar varias variantes de empalme,
mientras que los cebadores que abarcan el intrón pueden ser más selectivos, pero pueden pasar por
alto algunas variantes de empalme.
Más recientemente, se han descrito genes autosómicos no impresos que muestran desequilibrio
alélico en su expresión. En conjunto, estos hallazgos implican que el uso de un ensayo RT-qPCR que
simplemente se dirige a uno o, a lo sumo, 2 exones de un ARNm ya no es suficiente para describir el
nivel de expresión de un gen en particular. En consecuencia, la información de secuencia para los
cebadores se debe proporcionar junto con una evaluación de su especificidad con respecto a las
variantes de empalme conocidas y las posiciones del polimorfismo de un solo nucleótido
documentadas en las bases de datos de transcripción y polimorfismo de un solo nucleótido.
Para los conjuntos de cebadores seleccionados de la base de datos RTprimerDB, esto se hace
fácilmente consultando el sitio web de RTprimerDB (http: // www. Rtprimerdb.org), que contiene toda
la información relevante.
Para los ensayos comerciales, se requiere la información del lote y los criterios de validación
experimental de los proveedores. Los informes de resultados para ensayos comerciales no validados
y ensayos que han sido validados solo en silico están fuertemente desaconsejados. Debe recordarse
que la detección de la presencia de un ARNm no proporciona información sobre si ese ARNm se
traducirá en una proteína o, de hecho, si una proteína funcional se traduce en absoluto. La
inmunohistoquímica, la transferencia Western u otros métodos de cuantificación de proteínas no
siempre son capaces de corroborar los datos cuantitativos de ARNm celular. Ahora está bien
establecido que a menudo hay una falta de concordancia entre los datos de ARNm y de concentración
de proteínas, lo que es particularmente cierto para los ARNm que especifican proteínas que forman
parte de complejos de proteínas multifuncionales.
Finalmente, ha quedado claro que el conocimiento de la presencia y función de microARN específicos
es tan importante para entender la expresión génica como poder cuantificar las especies de ARNm.
También es necesario tener en cuenta que la mayoría de los datos cuantitativos de ARN no son
absolutos, sino relativos. Por lo tanto, los genes o materiales de referencia utilizados para la
estandarización son críticos, y cualquier evaluación de la validez de un experimento RT-qPCR también
debe considerar la conveniencia de la referencia de cuantificación relativa. Por lo tanto, el desarrollo
de materiales de calibración de ADN y ARN de referencia universales, aunque es muy útil, no será una
panacea universal.
Gran parte de la varianza en los valores de expresión informados producidos en los experimentos RT-
qPCR no se debe simplemente a la variación en los protocolos experimentales, sino que está causada
por correcciones aplicadas por varios algoritmos de procesamiento de datos, cada uno de los cuales
hace sus propias suposiciones acerca de los datos. En consecuencia, aunque la qPCR se ha
proclamado frecuentemente como una piedra de toque o un estándar de oro, en la práctica este
"estándar" es variable, y el informe de los resultados requiere una considerable complejidad de análisis
e interpretación.
3. Investigación y aplicaciones de diagnóstico.
Las aplicaciones de la tecnología qPCR se pueden dividir ampliamente en aplicaciones de
investigación y diagnóstico. Las aplicaciones de investigación generalmente analizan una amplia gama
de objetivos con un rendimiento bastante bajo y muchos tipos de muestras diferentes. Los principales
parámetros que deben abordarse se relacionan con la sensibilidad y especificidad analíticas del
ensayo, que en este contexto se refieren a cuántas copias de destino puede detectar el ensayo y si
los controles sin plantilla (NTC) son confiablemente negativos, respectivamente.
En contraste, las aplicaciones de diagnóstico generalmente analizan un número limitado de objetivos,
pero requieren protocolos de alto rendimiento que están dirigidos a solo unos pocos tipos de muestras.
Aunque todas las consideraciones que se aplican a las aplicaciones de investigación también se
aplican a los ensayos de diagnóstico, los ensayos de diagnóstico clínico tienen una serie de requisitos
adicionales que deben tenerse en cuenta. Estos requisitos incluyen información sobre sensibilidad y
especificidad analítica que, en este contexto, se refiere a la frecuencia con la que el ensayo arroja un
resultado positivo cuando un objetivo está presente y la frecuencia con la que es negativo en ausencia
del objetivo. Además, la precisión y la precisión dentro y entre los laboratorios a menudo son
monitoreadas por programas de control de calidad externos. Los requisitos adicionales de laboratorio
clínico incluyen criterios para generar resultados notificables, si se realizan mediciones repetidas en
muestras, datos sobre la resolución de datos falso-positivos / falso-negativos y la similitud de los
resultados de múltiples laboratorios que utilizan la misma y diferentes tecnologías. Hasta ahora, solo
se han realizado un par de comparaciones entre laboratorios, y ambos estudios enfatizaron la
necesidad de la estandarización de los análisis de diagnóstico de qPCR. Se planea otro ejercicio
interlaboratorio dentro del proyecto Marco Europeo 7: SPIDIA (Estandarización y Mejora de
Herramientas y Procedimientos Genéricos Pre-analíticos para Diagnóstico In Vitro; http: // www.
Spidia.eu).
4. Adquisición, manejo y preparación de muestras.
La adquisición de muestras constituye la primera fuente potencial de variabilidad experimental,
especialmente para experimentos dirigidos a ARN, porque los perfiles de ARNm se perturban
fácilmente con los métodos de recolección y procesamiento de muestras.
Existe alguna sugerencia de que el tejido fresco puede almacenarse en hielo sin efectos importantes
en la calidad y concentración del ARN, pero, aunque esta suposición puede ser cierta para algunos
ARNm y tejidos, puede no ser universalmente aplicable. Por lo tanto, es mejor ser cauteloso. Por
consiguiente, es importante informar en detalle dónde se obtuvo la muestra de tejido y si se procesó
de inmediato. Si la muestra no se procesó de inmediato, es necesario informar cómo se conservó,
durante cuánto tiempo y bajo qué condiciones se almacenó.
También es esencial una breve descripción de la muestra. Por ejemplo, el examen microscópico de
una biopsia de tumor revelará qué porcentaje de la biopsia está formada por células tumorales, y esta
información debe informarse.
La extracción de ácido nucleico es un segundo paso crítico. La eficiencia de la extracción depende de
la homogeneización adecuada, el tipo de muestra (por ejemplo, tejido in situ frente a las células
cultivadas de la fase log), la densidad objetivo, el estado fisiológico (por ejemplo, sano, canceroso o
necrótico), la complejidad genética y la cantidad de biomasa procesada.
Por lo tanto, es necesario que se proporcionen detalles del método de extracción de ácido nucleico y
que se describan los métodos utilizados para medir la concentración de ácido nucleico y evaluar su
calidad. Tales detalles son particularmente cruciales para el ARN extraído de muestras de biopsia
micro diseccionadas con láser recién congeladas, porque las variaciones en los procedimientos de
preparación de tejidos tienen un efecto sustancial tanto en el rendimiento como en la calidad del ARN.
5. QC de los ácidos nucleicos
5.1. Muestras de ARN
La cuantificación del ARN en las muestras extraídas es importante, porque es aconsejable que se
usen aproximadamente las mismas cantidades de ARN cuando se comparan diferentes muestras. Sin
embargo, hay varios procedimientos de cuantificación de uso común, que incluyen espectrofotometría
(NanoDrop; Thermo Scientific), análisis microfluídico (Bioanalizador de Agilent Technologies, Experion
Laboratorios Bio-Rad), electroforesis en gel capilar (QIAxcel de Qiagen) o detección de tinte
fluorescente (Ambion / RiboGreen de Applied Biosystems). Los métodos producen resultados
diferentes, por lo que no es aconsejable intentar comparar los datos obtenidos con los diferentes
métodos. El método preferido para cuantificar el ARN usa tintes fluorescentes de unión al ARN (por
ejemplo, RiboGreen), que son los mejores para detectar concentraciones objetivo bajas. En cualquier
caso, es recomendable medir todas las muestras con un solo método e informar esta información.
También es importante probar y reportar el grado de contaminación del ADN genómico y registrar los
criterios de umbral de corte para las cantidades de dicha contaminación que son tolerables. Es esencial
informar si la muestra de ARN ha sido tratada con ADNasa (incluido el tipo de ADNasa utilizada y las
condiciones de reacción) y reportar los resultados de una comparación de Cqs con controles de
transcripción positivos y no reversos para cada diana de ácido nucleico. También es esencial
documentar la evaluación de la calidad de las plantillas de ARN. La única situación en la que este
requisito no se aplica es cuando la cantidad de ARN total extraído es demasiado baja para permitir la
evaluación de la calidad. Esta situación surge cuando se extrae ARN de células individuales, plasma,
otros fluidos corporales libres de células, algunas muestras capturadas con láser o medio de cultivo
de tejido clarificado. También se aplica en los casos en que los pasos de extracción y RT-qPCR se
realizan como un experimento continuo de un solo canal.
La información clave a reportar incluye datos sobre la cantidad de ARN, la integridad y la ausencia de
transcripción inversa o inhibidores de la PCR. Vale la pena recordar que el ARN se degrada
notablemente en vivo, debido a la regulación natural de los ARNm en respuesta a los estímulos
ambientales. Esta fuente de degradación del ARN está fuera del control del investigador; Una de sus
manifestaciones es que incluso las muestras de ARN de alta calidad pueden mostrar una degradación
diferencial de los ARNm individuales.
La relación A260 / A280 debe medirse en un tampón a pH neutro, pero dicha medición no es suficiente
si el ácido nucleico se va a usar para el análisis cuantitativo, especialmente cuando el objetivo es medir
diferencias menores (<10 veces) en células Concentraciones de ARNm.
La relación de absorbancia proporciona una indicación de la pureza del ARN, porque la presencia de
ADN o fenol residual altera la relación. En su lugar, uno debería proporcionar evidencia de
electroforesis en gel al menos o, mejor aún, los resultados de un análisis de ARNr basado en
microfluídico o un gen de referencia / gen diana 3´: 5´ Ensayo de integridad. La ventaja del uso de un
sistema Bioanalyzer / Experion para calcular un número de integridad de ARN o un número indicador
de calidad de ARN es que estas medidas proporcionan información cuantitativa sobre el estado general
de la muestra de ARN. Sin embargo, es importante tener en cuenta que estos números se relacionan
con la calidad del ARNr y no se puede esperar que sean una medida absoluta de la calidad. Uso de
un 3´: 5´ el ensayo requiere que las eficiencias de PCR de ambos ensayos sean virtualmente idénticas
y no estén sujetas a inhibición diferencial. Este ensayo también requiere el establecimiento de un
criterio de umbral que delimita la calidad del ARN suficiente para obtener resultados confiables.
Idealmente, el ensayo debería dirigirse a un panel de “genes de referencia de integridad”,
probablemente sin intrones, con un 3´: 5´ relación de umbral de aproximadamente 0,2-5. Claramente,
se requiere más trabajo para generar un protocolo universalmente aplicable, rentable y simple para
evaluar la integridad del ARN. La inhibición de la actividad de transcripción inversa o PCR debe
verificarse mediante la dilución de la muestra (preferiblemente) o mediante el uso de un ensayo de
inhibición universal como el SPUD. Si se muestra que la muestra de ARN está parcialmente
degradada, es esencial que se informe esta información, ya que la sensibilidad del ensayo para
detectar un transcrito de bajo nivel puede reducirse y las diferencias relativas en la degradación de los
transcritos pueden producir proporciones diana incorrectas.
5.2. Muestras de ADN
En general, la degradación es un problema mucho menor con el ADN; sin embargo, es importante
poder evaluar el alcance de la degradación del ADN para aplicaciones forenses, es decir, en los casos
en que las condiciones ambientales adversas en escenas de delitos o desastres masivos o en sitios
que involucran casos de personas desaparecidas pueden haber degradado la estructura química de
ADN. El pequeño tamaño del amplicón de los ensayos de qPCR ayuda a minimizar los problemas
relacionados con el ensayo, pero se han desarrollado métodos que proporcionan una medida
cuantitativa de la calidad del ADN y deben considerarse para dichos fines especializados. El potencial
de inhibición es una variable de aplicación más general que debe abordarse en una publicación, y es
importante asegurarse de que ningún inhibidor copurificado con el ADN distorsione los resultados, por
ejemplo, la detección de patógenos y su cuantificación. Aunque se pueden usar enfoques tales como
muestras de picos con controles positivos para detectar la inhibición, diferentes reacciones de PCR
pueden no ser igualmente susceptibles a la inhibición por sustancias copurificadas en extractos de
ácido nucleico. En consecuencia, es mejor usar rutinariamente diluciones de ácidos nucleicos para
demostrar que las disminuciones observadas en los Cqs o los números de copias son consistentes con
el resultado anticipado y para reportar estos datos.
6. Transcripción inversa
La etapa de transcripción inversa introduce una variación sustancial en un ensayo RT-qPCR. Por lo
tanto, es esencial que se proporcione una descripción detallada del protocolo y los reactivos utilizados
para convertir el ARN en ADNc. Esta documentación debe incluir la cantidad de ARN transcrito a la
inversa, la estrategia de cebado, el tipo de enzima, el volumen, la temperatura y la duración de la etapa
de transcripción reversa. Se recomienda que la etapa de transcripción reversa se realice por duplicado
o por triplicado y que la concentración total de ARN sea la misma en cada muestra.
7. qPCR
Se debe proporcionar la siguiente información para los ensayos de qPCR: números de acceso a la
base de datos de cada gen diana y de referencia, las ubicaciones de los exones de cada cebador y
cualquier sonda, las secuencias y concentraciones de cada oligonucleótido, incluidas las identidades,
posiciones y enlaces de cualquier colorante y / o bases modificadas. También se requieren la
concentración y la identidad de la polimerasa, la cantidad de plantilla (ADN o ADNc) en cada reacción,
la concentración de Mg2+, las composiciones químicas exactas del tampón (sales, pH, aditivos) y el
volumen de reacción. Los investigadores también deben identificar el instrumento que utilizaron y
documentar todas las condiciones de los ciclos de PCR. Debido a que los consumibles utilizados
afectan el ciclo térmico, es necesario identificar el uso de tubos individuales, tiras o placas y sus
fabricantes. El grado de transparencia del material plástico utilizado, por ejemplo, blanco o
transparente, también es importante, ya que diferentes plásticos muestran diferencias sustanciales en
la reflexión de fluorescencia y la sensibilidad. Cuando se usan las placas, el método de sellado (unión
por calor frente a los adhesivos) puede afectar la evaporación de las muestras en el perímetro de la
placa y, por lo tanto, debe documentarse. Debido a que la eficiencia de la PCR es altamente
dependiente de los cebadores utilizados, sus secuencias deben publicarse. Este requisito es
perfectamente factible incluso con cebadores comerciales, ya que existe un precedente para que las
compañías pongan a disposición sus secuencias de cebadores y sondas
(http://www.primerdesign.co.uk/ research_with_integrity.asp). Además, se recomienda
encarecidamente el envío a bases de datos públicas como RTprimerDB; Con el tiempo, estas bases
de datos podrían convertirse en centros de información universales.
7.1. ESTRUCTURA SECUNDARIA
La estructura de la diana del ácido nucleico (por ejemplo, la estructura del ARN secundario del tallo y
el bucle) tiene un impacto sustancial en la eficiencia de la transcripción inversa y la PCR. Por lo tanto,
las posiciones de los cebadores, las sondas y los amplicones de PCR deben tener en cuenta el
plegamiento de las plantillas de ARN. Las secuencias deben verificarse con el software de plegamiento
de ácido nucleico, por ejemplo, mfold forDNA (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi) o RNA
(http: //frontend.bioinfo.rpi .edu / applications / mfold / cgi-bin / rna-form1-2.3.cgi). Lo ideal es que las
estructuras de plegado estén disponibles para los revisores.
7.2. ESPECIFICIDAD
Las herramientas in silico como BLAST o búsquedas de especificidad equivalentes son útiles para el
diseño de ensayos. Cualquier homología apreciable con pseudogenes u otros objetivos inesperados
debe documentarse y proporcionarse como secuencias alineadas para su revisión; sin embargo, la
especificidad debe validarse empíricamente con evidencia experimental directa (gel de electroforesis,
perfil de fusión, secuenciación de ADN, tamaño del amplicón y / o digestión con enzimas de
restricción). Los algoritmos para predecir la temperatura de disociación del oligonucleótido (Tm) son
útiles para el diseño inicial, pero la temperatura óptima práctica para el recocido se debe determinar
experimentalmente. Aunque la optimización del cebador se ha dejado de moda, está claro que una
optimización de recocido pobre tiene un gran efecto en la calidad del ensayo. La presencia marcada
de dímeros de cebadores produce una menor eficiencia de PCR en los ensayos basados en sondas y
puede generar falsos positivos en los ensayos basados en SYBR Green I. Se debe proporcionar a los
revisores cierta evidencia de optimización del cebador, idealmente en forma de temperatura de
recocido o gradientes de Mg2+. y presentarse como valores de Cq, gráficos de fluorescencia frente a
número de ciclo y / o curvas de fusión.
7.3. CONTROLES Y CALIBRADORES DE CUANTIFICACIÓN
Además del control de transcripción no inversa en los ensayos RT-qPCR mencionados anteriormente,
se requieren controles adicionales y / o calibradores de cuantificación para todas las reacciones de
qPCR. Los NTC detectan la contaminación por PCR cuando se utilizan sondas y también pueden
distinguir productos de amplificación no intencionados (por ejemplo, dímeros de cebadores) de los
productos de PCR previstos en las reacciones SYBR Green I. Los NTC deben incluirse en cada placa
o lote de muestras, y deben establecerse las condiciones para el rechazo de datos. ¿Por ejemplo, los
NTC con Cqs? 40 podrían ignorarse si el Cq para la concentración más baja desconocida es 35.
Los controles positivos en forma de ácidos nucleicos extraídos de muestras experimentales son útiles
para monitorear la variación del ensayo a lo largo del tiempo y son esenciales cuando las curvas de
calibración no son Realizado en cada carrera. Los calibradores de cuantificación pueden ser moléculas
diana purificadas, como los oligonucleótidos sintéticos de ARN o ADN que abarcan el amplicón de
PCR completo, construcciones de ADN plásmido, ADNc clonado en plásmidos, ARN transcrito in vitro,
grupos de referencia de ARN, ARN o ADN de muestras biológicas específicas o internacionalmente
reconocido Estándares biológicos (a medida que estén disponibles).
Las diluciones deben llevarse a cabo en concentraciones definidas de ARNt portador (levadura o
Escherichia coli a 10–100 ng /? L). Para la detección de patógenos humanos, los calibradores pueden
diluirse en una muestra de control negativo ARN o ADN, o pueden diluirse en plasma humano sano,
después de lo cual se puede llevar a cabo la lisis en presencia de ARNt portador. Las diluciones en
serie de una plantilla en particular se pueden preparar como soluciones de reserva que resisten varios
ciclos de congelación y descongelación. Se debe preparar un lote nuevo cuando se detecte un cambio
de Cq de 0.5 a 1.0. Alternativamente, las soluciones para las curvas de calibración pueden
almacenarse durante una semana a 4 ° C y luego desecharse. Para los ensayos de diagnóstico, la
qPCR debe incluir un calibrador verificado independientemente, si está disponible, que se encuentre
dentro del intervalo lineal del ensayo. También se recomiendan controles de extracción positivos y
negativos.
7.4. Rendimiento del ensayo
Se deben determinar las siguientes características de rendimiento del ensayo: eficiencia de la PCR,
rango dinámico lineal, LOD y precisión.
7.4.1. Eficacia de la PCR.
Los ensayos de qPCR robustos y precisos generalmente se correlacionan con una alta eficiencia de
PCR. La eficiencia de la PCR es particularmente importante cuando se informan concentraciones de
ARNm para genes diana en relación con los de genes de referencia. El método ?? Cq es uno de los
medios más populares para determinar las diferencias en concentraciones entre muestras y se basa
en la normalización con un solo gen de referencia. Se calcula la diferencia en los valores de Cq (? Cq)
entre el gen diana y el gen de referencia, y se comparan directamente las qCqs de las diferentes
muestras. Los 2 genes deben amplificarse con eficiencias comparables para que esta comparación
sea precisa. Sin embargo, el método más popular no es necesariamente el más apropiado, y se han
desarrollado modelos cuantitativos alternativos y más generalizados para corregir las diferencias en la
eficiencia de amplificación y para permitir el uso de múltiples
genes de referencia. La eficiencia de la amplificación de la PCR debe establecerse mediante curvas
de calibración, ya que dicha calibración proporciona una indicación simple, rápida y reproducible de la
eficiencia de la PCR media, la sensibilidad analítica y la robustez del ensayo. La eficiencia de la
amplificación debe determinarse a partir de la pendiente de la porción log-lineal de la curva de
calibración. Específicamente, eficiencia? 10? 1 / pendiente? 1, cuando el logaritmo de la concentración
de la plantilla inicial (la variable independiente) se representa en el eje x y Cq (la variable dependiente)
se representa en el eje y. El máximo teórico de 1.00 (o 100%) indica que la cantidad de producto se
duplica con cada ciclo. Idealmente, los CI o los SE de las medias de las eficiencias de PCR estimadas
se informan a partir de curvas de calibración replicadas.
Las curvas de calibración para cada objetivo cuantificado deben incluirse con el manuscrito enviado
para que esta información pueda estar disponible para los revisores; Las pendientes y las
intersecciones y derivadas de estas curvas de calibración deben incluirse con la publicación. Las
diferencias en la eficiencia de la PCR producirán curvas de calibración con diferentes pendientes.
Como consecuencia, las diferencias entre los valores de Cq de los objetivos y las referencias no se
mantendrán constantes a medida que se varíen las cantidades de la plantilla, y los cálculos de las
concentraciones relativas serán inexactos, lo que arrojará resultados engañosos. Los valores de Cq
40 son sospechosos debido a la baja eficiencia implícita y, en general, no deben informarse; sin
embargo, el uso de tales cortes de Cq arbitrarios no es ideal, ya que pueden ser demasiado bajos
(eliminando resultados válidos) o demasiado altos (incrementando resultados falsos positivos)
7.4.2. Rango dinámico lineal.
Se debe describir el rango dinámico en el cual una reacción es lineal (desde el número de copias
cuantificables más alto hasta el más bajo establecido por medio de una curva de calibración).
Dependiendo de la plantilla utilizada para generar curvas de calibración, el rango dinámico debe cubrir
al menos 3 órdenes de magnitud e idealmente debería extenderse a 5 o 6 concentraciones log10. El
intervalo lineal de la curva de calibración debe incluir el intervalo para los ácidos nucleicos objetivo que
se están cuantificando. Debido a que los límites inferiores de cuantificación generalmente están mal
definidos, se debe determinar la variación en la concentración más baja que se afirma dentro del
intervalo lineal. Los coeficientes de correlación (valores r2) deben informarse e, idealmente, los IC
deben proporcionarse a través de todo el rango dinámico lineal.
7.4.3. LOD.
El LOD se define como la concentración más baja a la que se detectan el 95% de las muestras
positivas. En otras palabras, dentro de un grupo de réplicas que contienen el objetivo en
concentraciones en el LOD, no deben ocurrir más de 5% de reacciones fallidas. ¿Los PCR de baja
copia están limitados estadisticamente, y no es posible realizar un LOD de? 3 copias por PCR. Sin
embargo, si se realizan múltiples reacciones, se puede obtener una cuantificación precisa de
concentraciones más bajas mediante PCR digital. De hecho, los calibradores de concentración pueden
verificarse limitando la dilución para mostrar que el porcentaje de reacciones fallidas y exitosas sigue
una distribución de Poisson.
7.4.4. Precisión.
Hay muchas explicaciones para la variación en los resultados de qPCR, incluidas las diferencias de
temperatura que afectan la terminación del recocido y / o la desnaturalización, las diferencias de
concentración introducidas por los errores de pipeteo y la variación estocástica. La precisión en qPCR
típicamente varía con la concentración, disminuyendo con el número de copias. Lo ideal es que la
variación (repetibilidad) intraensayo se muestre en cifras como barras de error SD o como IC en curvas
de calibración con muestras repetidas. Los CV no se deben usar con Cqs, pero se pueden usar para
expresar la varianza en los números de copias o concentraciones. Esta variación técnica debe
distinguirse de la variación biológica. Las réplicas biológicas pueden abordar directamente la
importancia estadística de las diferencias en los resultados de qPCR entre grupos o tratamientos. Para
los ensayos de diagnóstico, también puede ser necesario informar la precisión entre ensayos
(reproducibilidad) entre sitios y diferentes operadores.
7.5. MULTIPLEX qPCR
La capacidad de multiplexar expande en gran medida la potencia del análisis de qPCR, particularmente
cuando se aplica a la detección simultánea de mutaciones puntuales o polimorfismos. La
multiplexación requiere la presentación de evidencia que demuestre que la cuantificación precisa de
múltiples objetivos en un solo tubo no se ve afectada, es decir, que la eficiencia del ensayo y el LOD
son los mismos que cuando los ensayos se realizan de forma uniplex. Esta preocupación es de
particular importancia cuando los objetivos de una abundancia apreciablemente menor se combinan
con objetivos altamente abundantes.
8. Análisis de datos
El análisis de datos incluye un examen de los datos sin procesar, una evaluación de su calidad y
confiabilidad, y la generación de resultados notificables. Se han descrito varias estrategias de
recolección y procesamiento de datos, y una evaluación sistemática ha revelado que los métodos de
análisis de datos de qPCR difieren sustancialmente en su desempeño.
Es necesaria información detallada sobre los métodos de análisis de datos y estimación de confianza,
junto con la especificación del software utilizado. Se deben especificar los métodos de identificación
de valores atípicos y la disposición de dichos datos. Documentar la precisión del ensayo requiere la
identificación de los métodos estadísticos utilizados para evaluar las variaciones (por ejemplo, IC del
95%) y la presentación de las concentraciones correspondientes o los valores de Cq. Dicha
información debe incluir datos de repetibilidad y reproducibilidad, si están disponibles. Como se
mencionó anteriormente, el reporte de CV para Cqs es inapropiado, porque los Cq siempre serán más
bajos (y, por lo tanto, potencialmente engañosos) que los CV calculados para los números de copia.
Se debe proporcionar información sobre los métodos utilizados para evaluar la precisión, incluida la
importancia estadística de las diferencias informadas entre los grupos.
8.1. NORMALIZACIÓN
La normalización es un componente esencial de un ensayo de qPCR confiable porque este proceso
controla las variaciones en el rendimiento de extracción, el rendimiento de transcripción inversa y la
eficiencia de amplificación, lo que permite las comparaciones de las concentraciones de ARNm en
diferentes muestras. El uso de genes de referencia como controles internos es el método más común
para normalizar datos de ARNm celular; sin embargo, aunque el uso de genes de referencia es
comúnmente aceptado como la estrategia de normalización más apropiada (69), su utilidad debe ser
validada experimentalmente para tejidos o tipos de células particulares y diseños experimentales
específicos. Desafortunadamente, aunque hay una mayor conciencia de la importancia de la validación
sistemática y aunque los efectos potencialmente engañosos del uso de genes de referencia
inapropiados para la normalización son ampliamente conocidos, estas consideraciones también son
ampliamente ignoradas. En consecuencia, muchos análisis moleculares aún contienen datos de qPCR
que están mal normalizados. La normalización implica informar las proporciones de las
concentraciones de ARNm de los genes de interés a las de los genes de referencia. Los ARNm del
gen de referencia deben expresarse de manera estable, y su abundancia debe mostrar una fuerte
correlación con las cantidades totales de ARNm presentes en las muestras. La normalización contra
un gen de referencia único no es aceptable a menos que los investigadores presenten pruebas claras
para los revisores que confirmen su expresión invariante en las condiciones experimentales descritas.
El número óptimo y la elección de los genes de referencia deben determinarse experimentalmente y
el método debe informarse.
8.2. VARIABILIDAD
La variabilidad inherente de los sistemas biológicos puede rivalizar o superar las diferencias
experimentales entre grupos. Esta variación se observa a menudo cuando se utilizan muchas réplicas
biológicas para aumentar la importancia estadística del experimento. Aunque las diferencias entre
réplicas biológicas pueden ser grandes, números suficientes pueden permitir discernir diferencias
experimentales más pequeñas. Una publicación reciente proporciona un ejemplo de libro de texto para
el manejo de dichos datos y cómo recuperar datos biológicamente significativos de ensayos sujetos a
altas variaciones biológicas. Muchos factores contribuyen a la variación experimental e influyen en el
número de réplicas biológicas necesarias para lograr un poder estadístico determinado. En
consecuencia, el análisis de potencia es útil para determinar el número de muestras necesarias para
obtener conclusiones válidas.
8.3. ANALISIS CUALITATIVO
El uso de la PCR para detectar simplemente la presencia de una plantilla de ácido nucleico, en lugar
de cuantificarla con precisión, se conoce como PCR cualitativa, que se usa ampliamente en el
diagnóstico de patógenos. El problema con la estratificación cualitativa / cuantitativa de los métodos
de PCR es que una respuesta precisa de sí / no requiere información sobre la sensibilidad de gama
baja del ensayo de PCR. En consecuencia, incluso un ensayo cualitativo debe proporcionar
información sobre las características de rendimiento del ensayo, especialmente con respecto a los
puntos discutidos en las secciones 7.4.2. y 7.4.3.
Conclusiones
La necesidad de garantizar medidas de garantía de calidad para los ensayos de qPCR y RT-qPCR
está bien reconocida. La principal diferencia entre la qPCR y los ensayos de PCR convencionales
(heredados) es la expectativa del potencial de los primeros para cuantificar los ácidos nucleicos
objetivo con precisión. Esta diferencia debe reconocerse claramente, y uno no puede asumir que los
análisis de PCR heredados se pueden traducir directamente al formato qPCR. La Tabla 1 proporciona
una lista de verificación para los autores que preparan un informe de un estudio de qPCR. Los
elementos que se consideran esenciales (E) se requieren para permitir que los revisores evalúen el
trabajo y otros investigadores lo reproduzcan. Los elementos que se consideran deseables (D) también
son importantes y deben incluirse si es posible, pero es posible que no estén disponibles en todos los
casos. Ciertamente, es importante aplicar el sentido común: el cumplimiento de todos los elementos
en la lista de verificación no es necesario para la selección inicial de las firmas de expresión que
apuntan a cientos de objetivos. Sin embargo, una vez que se ha identificado un conjunto más limitado
de objetivos (menos de 20), el rendimiento del ensayo debe describirse como se detalla en la lista de
verificación, que se encuentra en http://www.rdml.org/miqe/. En resumen, el propósito de estas pautas
es triple:
1. Permitir que los autores diseñen e informen experimentos de qPCR que tienen un mayor valor
inherente.
2. Permitir que los revisores y editores midan la calidad técnica de los manuscritos enviados en
comparación con un criterio establecido.
3. Para facilitar la replicación más fácil de los experimentos descritos en estudios publicados que
siguen estas pautas.
Como consecuencia, las investigaciones que utilizan esta tecnología ampliamente aplicada producirán
datos más uniformes, más comparables y, en última instancia, más confiables.