Instituto Politécnico de la Salud “Luis Felipe Moncada”

Protocolo de Investigación Aplicada

Tema

Métodos de conservación y cultivo para la rehabilitación del cepario micológico del

laboratorio microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-Managua, en los meses
de enero a abril del año 2019

Autores:

Bch. Jimmy Javier Martínez Maltez

Bch. Lidieth Paola Murillo Espino

Lic. Microbiología

Docente:

Lic. María Soledad Mendoza Salty

Índice de contenido

1. Introducción ........................................................................................................................ 1
2. Antecedentes....................................................................................................................... 2
3. Justificación ........................................................................................................................ 4
4. Planteamiento del problema ............................................................................................... 5
5. Objetivos............................................................................................................................. 7
5.1. Objetivo general .......................................................................................................... 7
5.2. Objetivos específicos ................................................................................................... 7
6. Marco teórico ...................................................................................................................... 8
6.1. Generalidades de los hongos ....................................................................................... 8
6.1.1. Taxonomía ........................................................................................................ 9
6.1.2. Morfología ...................................................................................................... 10
6.1.3. Reproducción .................................................................................................. 12
6.2. Medios de conservación ............................................................................................ 12
6.2.1. Métodos de conservación a largo plazo .......................................................... 13
6.2.2. Criopreservación ............................................................................................. 13
6.2.3. Liofilización .................................................................................................... 14
6.2.4. Métodos de conservación alternativos ............................................................ 15
6.2.5. Conservación fúngica por transferencia periódica ......................................... 15
6.2.6. Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril ...... 16
6.2.7. Método de conservación fungía en aceite mineral ......................................... 18
6.2.8. Conservación fúngica a través de métodos restringidos ................................. 18
6.2.9. Desecación en papel de filtro .......................................................................... 19
6.2.10. Desecación en arena, suelo, silicagel ............................................................ 19
6.2.11. Desecación en bolitas de alginato ................................................................. 20
6.3. Medios de cultivos ..................................................................................................... 20
6.3.1. Agar glucosa de Sabouraud. ........................................................................... 21
6.3.2. Medio de Sabouraud con antibióticos............................................................. 21
6.4. Otros medios de cultivo ............................................................................................. 22
6.4.1. Medio líqu
 ido de Sabouraud ...................................................................................................... 22
6.4.2. Agar BHI (infusión cerebro-corazón, “brain-heart”) ...................................... 22
6.4.3. Agar BHI con antibióticos .............................................................................. 22
6.4.4. Agar BHI con 5% sangre de oveja ................................................................. 23
6.4.5. Agar papa dextrosa (APD) .............................................................................. 23
7. Diseño metodológico ........................................................................................................ 24
7.1. Tipo de estudio. ......................................................................................................... 24
7.2. Tipo de muestreo ....................................................................................................... 24
7.3. Área de estudio. ......................................................................................................... 24
7.4. Periodo del estudio. ................................................................................................... 25
7.5. Universo .................................................................................................................... 25
7.6. Muestra: ..................................................................................................................... 25
7.7. Criterios de inclusión. ................................................................................................ 25
7.8. Criterios de exclusión: ............................................................................................... 25
7.9. Métodos, técnicas e instrumentos para la recolección de la información ................. 26
7.10. Procedimientos para la recolección de datos ........................................................... 26
7.11. Procesamiento de la muestra ................................................................................... 26
7.12. Limitaciones del estudio .......................................................................................... 27
7.13. Plan de tabulación y análisis .................................................................................... 27
7.14. Operacionalización de las variables ........................................................................ 28
8. Cronograma de actividades .............................................................................................. 32
9. Presupuesto ....................................................................................................................... 33
10. Conclusiones................................................................................................................... 34
11. Bibliografía ..................................................................................................................... 35
12. Anexos ............................................................................................................................ 37
 1. Introducción

La micología del griego (μύκης, hongo, y -λογία, tratado, estudio), es una ciencia de la
microbiología, la cual se encarga del estudio de los hongos, siendo una de las áreas de la
medicina más extensas, y diversificadas la cual aporta grandes avances a las investigaciones
científicas, ya sea como el uso de hongos en los procesos industriales como la fermentación
de bebidas, o como hongos productores de diversas enfermedades para el ser humano. En la
actualidad es una ciencia poco estudiada en Nicaragua, esto debido a las condicionantes que
el estudio de la micología conlleva.

En las últimas décadas los procesos micoticos se han convertido en una causa muy importante
de enfermedades en el ser humano, esto especialmente en personas la cuales poseen
enfermedades de base, inmunodeprimidos e incluso personas hospitalizadas con
enfermedades subyacentes graves, en estos grupos de personas los hongos actúan como
patógenos oportunistas ocasionando una morbimortalidad elevada. Con el crecimiento del
número de personas en riesgo a padecer un proceso micótico, es de vital importancia que los
médicos consideren a los hongos en sus diagnósticos ante la presencia de un proceso
infeccioso, ya que la lista de patógenos de carácter micótico es extensa y no se pueden ignorar
o descartar como contaminantes o microorganismos sin importancia clínica cuando se aíslan
de muestras clínicas de los pacientes correspondiente.

La formación de micotecas o ceparios micológicos, con el pasar del tiempo han adquirido
cada vez mayor importancia, debido a que esta permite una importante herramienta de
aprendizaje, diagnostico e investigación en los laboratorios microbiológicos. La
conformación de una micoteca conlleva un gran número de parámetros los cuales van
aumentando su rigurosidad en dependencia del tipo de cepas micológicas a conservarse, asi
como el determinar los tipos de métodos de conservación que serán utilizados según las
condiciones infraestructurales y capacidades del laboratorio, y el tiempo por el que serán
conservadas las cepas.

1
 2. Antecedentes

Según el Dr. Carlos Fernández. en un trabajo realizado en Cuba, las colecciones de cultivos
microbianos adquieren cada vez mayor importancia como mecanismos o vías para la
conservación ex situ de la biodiversidad y representan un importante elemento estratégico y
económico para el desarrollo de las investigaciones científicas, con particularidad en las
ramas biotecnológicas y biomédicas. Estas colecciones son las encargadas de colectar,
identificar, guardar y preservar aquellas cepas aisladas por primera vez, las cepas
manipuladas genéticamente, las cepas tipo de cada especie, mutantes, cepas causantes de
epidemias, cepas de importancia industrial y otros microorganismos útiles o perjudiciales, de
manera sistemática y organizada (Fernández, 2005).

Zulia Alemán en un estudio realizado en la habana cuba, afirma que el método de

conservación que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos el 70 % de las células
por un período considerable de tiempo, de forma tal que la población sobreviviente se
asemeje a la original como sea posible, conserve las propiedades de importancia de los
cultivos y minimice la ocurrencia de los eventos genéticos. De igual manera debe reducir al
mínimo el riesgo de contaminación y permitir que la pureza del cultivo permanezca
inalterable (Alemán, 2005).

En una investigación realizada en Venezuela, María Panizo, afirma que los métodos más
comúnmente utilizados en el mantenimiento y preservación de hongos son: liofilización,
congelación, bajo capa de aceite mineral y en agua destilada estéril. Cada uno es escogido
tomando en cuenta el tipo de hongo que se quiere preservar, la cantidad de cepas que se
quieren mantener, con qué finalidad serán utilizadas y cuáles son los recursos, tanto humanos
como en materiales y equipos, que dispone el laboratorio para dedicarse a esta tarea, Los
métodos de conservación de agua por Castellani y capa de aceite mineral, garantizan la
preservación adecuada de hongos levaduriformes y filamentosos durante largos períodos de
tiempo, asegurando viabilidad, pureza y estabilidad morfológica. Son de bajo costo y fácil
manejo, pero necesitan de constante vigilancia y atención por parte del personal que se ocupa
del mantenimiento de una colección de hongos (Panizo, 2005).
Según Yeimy Pinzón y Colaboradores, en un trabajo realizado en Colombia determinan que
el manejo de microorganismos contempla métodos de elección o de conservación a largo

2
plazo, con los que se paraliza el crecimiento de las células microbianas sin causar pérdida de
viabilidad. Así, se avala la estabilidad genética al limitar la aparición de generaciones
sucesivas y la actividad celular durante varios años. Los métodos de conservación
pertenecientes a este grupo incluyen: criopreservación y liofilización (Pinzón, 2009).

El Dr. Pedro F. Mateos, afirma en un estudio realizado en salamanca España, que en

cualquier laboratorio de microbiología es fundamental el mantenimiento y conservación de
las colecciones de microorganismos con las que trabajamos ya que, obviamente, son nuestro
reactivo primordial existen una gran variedad de métodos de mantenimiento y conservación
de los microorganismos cuya utilización va a de depender en parte del tiempo previsto
(Mateos, 2009).

Figueroa Carrasco y colaboradores, en un estudio realizado en Ecuador afirman que Las

micotecas a nivel mundial son consideradas centros para la conservación de hongos, las
cuales permiten salvaguardar su integridad y así poder realizar nuevas investigaciones,
generar nuevas técnicas para la enseñanza de la micología médica y así garantizar un
adecuado diagnóstico fúngico encaminado a establecer un control y/o erradicación de la
mayoría de los patógenos (Carrasco, 2017).

Alejandra Gutiérrez y Col. en la revista de Microbiología de Argentina afirman que para

poder mantener y conservar una colección de microorganismos, en particular una de cultivos
de hongos, se requiere una constante atención y vigilancia para preservar las características
morfológicas macro y microscópicas de las cepas. Es fundamental conocer las condiciones
de crecimiento y temperaturas apropiadas, las propiedades bioquímicas y las necesidades
fisiológicas de cada microorganismo, así como también los métodos de preservación más
favorables para su conservación y mantenimiento en el tiempo (Alejandra, 2017).

3
 3. Justificación

La micología es una ciencia médica la cual carece de demanda en Nicaragua, por lo que
sigue siendo un área abierta para la realización de un sin número de investigaciones, hoy en
día, el país solo cuenta con un hospital dermatológico el cual solo se centra en el diagnóstico
micológico a través del exámen directo, práctica la cual es muy pobre en comparación con
el amplio abanico de posibilidades diagnósticas e investigativas que la micología ofrece,
por lo que la formación de un Cepario micológico significa una gran oportunidad para la
realización de investigaciones futuras, y su utilización como una herramienta pedagógica
para la enseñanza de tan inexplorada ciencia en Nicaragua.
El laboratorio microbiológico de docencia del POLISAL UNAN-Managua, cuenta con un
pequeño cepario donde se conservan cepas desde hace más de 20 años, y las cuales han
servido a través de los tiempos, para que los jóvenes estudiantes los cuales reciben la
asignatura de micología médica conozcan un poco de los diferentes tipos de hongos
patógenos para el ser humano, responsables de las diferentes micosis conocidas, pero debido
a las pocas condiciones infraestructurales de los laboratorios, espacios para la conservación
de muestras micológicas y las técnicas de cultivo y conservación idóneas que se apliquen a
las necesidades actuales del laboratorio, ha conllevado de manera directa a que el Cepario
micológico carezca de muestras nuevas para la colección de la micoteca y pocos estudios
realizados.

La rehabilitación del Cepario del laboratorio microbiológico de docencia del POLISAL

UNAN-Managua simboliza un elemento importante para las investigaciones científicas in-
vitro, así como la enseñanza pedagógica de la micología, y la oportunidad de nuevas
investigaciones en el área de micología médica, con el fin de permitir una herramienta que
fortalezca el conocimiento en el área de micológica médica, por lo que esta investigación
pretende rehabilitar las cepas de hongos conservados en el Cepario micológico y aplicar
técnicas de cultivo con el objetivo de garantizar la conservación de esta micoteca para las
generaciones venideras de jóvenes estudiandos, los cuales apliquen a carreras de la salud, y
deban cursar la asignatura de micología médica, contribuyendo así a la universidad en lo que
concierne al área pedagógica y rehabilitación del cepario y a la sociedad con un personal de
salud o laboratorista, con conocimientos micológicos más afianzados.

4
 4. Planteamiento del problema

En la actualidad, el sector salud de Nicaragua trabaja a diario contra diversas infecciones y

patologías causadas por microorganismos varios, tarea la cual se dificultad en muchas
ocasiones en el laboratorio debido a las limitadas condiciones para la realización de técnicas
microbiológicas especializadas, y la poca importancia dentro de las áreas de las ciencias en
relación al sector salud, así como la poca conciencia bioética por gran parte de los
trabajadores de la salud. Dentro de las ciencias microbiológicas en Nicaragua, una de las
áreas de mayor afectación es el área micológica, debido a que no se cuenta con laboratorios
especializados, personal adecuadamente capacitado, e investigaciones o estudios
relacionados a este campo, como consecuencia de una mala concepción practico-teórico que
nace de un pensamiento erróneo de los actuales profesionales de las ciencias médicas, en
donde se resta la importancia a esta área debido a su baja incidencia y dificultades intrínsecas
de diagnóstico, cultivo y conservación, sumado principalmente a la falta de interés por esta
área y condiciones para el laboratorio micológico.

El trabajar con hongos implica un gran riesgo en la mayoría de los laboratorios debido a su
alta capacidad diseminativa y de contaminación, a través, de sus esporas las cuales pueden
ser transportadas por el aire con mucha facilidad, razón por la cual pocas personas se dedican
a trabajar con hongos, por el temor de ser contaminados y enfermar posteriormente, sumado
a la necesidad de un laboratorio con un nivel de contención tipo 3, para la realización de
investigaciones, diagnóstico y estudio. Debido a que los hongos son agentes microbiológicos
potencialmente patógenos.

2.1. Delimitación del problema

La formación de profesionales en el laboratorio microbiológico de docencia del POLISAL

UNAN-Managua, con conocimientos y dominio en el área de micología, se ve limitado
debido a que los laboratorios no cuentan con las condiciones de bioseguridad adecuadas, que

5
permitan la realización de técnicas para el diagnóstico, cultivo y conservación, así como el
mantenimiento necesario a la micoteca que actualmente se encuentra en desuso, sumado a la
poca promoción de esta especialidad, programas de investigación, y acondicionamiento
estructural de los laboratorios para el estudio de esta ciencia a mayor profundidad y crear
futuros profesionales más integrales en la rama de la micología.

Formulación del problema

¿Cuáles son los métodos de conservación y cultivo para la rehabilitación del Cepario
micológico del laboratorio microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-Managua, en
los meses de enero a abril del año 2019?

Sistematización del problema

1- ¿Cuáles son los métodos de conservación idóneos para la rehabilitación del Cepario
micológico del laboratorio microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-
Managua, en los meses de enero a abril del año 2019?

2- ¿Cuáles son los métodos de cultivos adecuados para la clasificación de los diferentes
hongos conservados en el Cepario micológico del laboratorio microbiológico de
docencia en el POLISAL UNAN-Managua, en los meses de enero a abril del año
2019?

3- ¿Cuál es la viabilidad micológica que presentan los hongos conservados en el Cepario

micológico del laboratorio microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-
Managua, en los meses de enero a abril del año 2019?

6
 5. Objetivos
5.1. Objetivo general

Evaluar los métodos de conservación y cultivo para la rehabilitación del Cepario micológico
del laboratorio microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-Managua, en los meses
de enero a abril del año 2019.

5.2. Objetivos específicos

1- Implementar métodos conservación idóneos para la rehabilitación del Cepario

micológico del laboratorio microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-
Managua, en los meses de enero a abril del año 2019.

2- Aplicar métodos de cultivos adecuados para la clasificación de los diferentes hongos

conservados en el Cepario micológico del laboratorio microbiológico de docencia en
el POLISAL UNAN-Managua, en los meses de enero a abril del año 2019.

3- Determinar la viabilidad micológica que presentan los hongos conservados en el

Cepario micológico del laboratorio microbiológico de docencia en el POLISAL
UNAN-Managua, en los meses de enero a abril del año 2019.

7
 6. Marco teórico

6.1. Generalidades de los hongos

Los hongos representan un grupo ubicuo y variado de microorganismos cuya principal

finalidad es degradar materia orgánica. Todos los hongos llevan una existencia heterótrofa
como saprofitos (microorganismos que se nutren de materia muerta o en descomposición),
simbiontes (microorganismos que viven juntos, de tal manera que la asociación supone una
ventaja mutua), comensales (microorganismos que viven en una relación estrecha en la que
uno se beneficia de la relación y el otro ni se beneficia ni sale perjudicado) o parásitos
(microorganismos que viven en el exterior o en el interior de un hospedador del que obtienen
beneficios sin hacer ninguna contribución útil a cambio; en el caso de los patógenos, la
relación es perjudicial para el hospedador) (Murray, 2013, p. 605). En lo que concierne con
sus necesidades nutricionales, los hongos pueden ser zootróficos lo cuales necesitan de
materia orgánica viva para su desarrollo, necrotróficos donde su alimento está basado en
materia orgánica, y sapotróficos en donde necesitan compuestos orgánicos no
necesariamente de vertebrados para su desarrollo.

Las enfermedades que producen, se conocen desde la más remota antigüedad; los griegos y
los romanos describieron algunas de las manifestaciones clínicas de las dermatofitosis, como
el querión y la mentagra, (…). Los aspectos clínicos de algunas micosis superficiales fueron
descritos desde la época de Hipócrates (460-377 a.C.) quien fue el primero en documentar la
candidiosis seudomembranosa con el nombre de “afta alba”, lo cual fue corroborado después
por Galeno (130-200 d.C.). Celso reconoció la tiña inflamatoria o querión flavus. También
se conocen datos de enfermedades por hongos o de la aplicación terapéutica de estos últimos
por el Códice de Martín de la Cruz, manuscrito azteca de 1552 conocido como Libelos de
medicinabulus indorum herbis y que fue traducido al latín por Juan Badiano y devuelto por
el Vaticano al país en 1990 (Arenas, 2014, p. 16).

En las últimas dos décadas los hongos se han convertido en causas importantes de
enfermedades en el ser humano, especialmente en personas inmunodeprimidas u

8
hospitalizadas con enfermedades subyacentes graves. En estos grupos de pacientes los
hongos actúan como patógenos oportunistas y producen una morbimortalidad elevada. La
incidencia total de las micosis invasoras específicas sigue aumentando a lo largo del tiempo,
y la lista de patógenos micóticos oportunistas también aumenta cada año. En pocas palabras,
¡no hay hongos no patógenos! Este aumento de las micosis se puede atribuir al creciente
número de pacientes inmunodeprimidos, como los pacientes trasplantados, los pacientes con
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), los pacientes con cáncer y que reciben
quimioterapia, y los pacientes que están ingresados con otras enfermedades subyacentes
graves y a los que se realizan diversas técnicas invasivas (Murray, 2013, p. 605). Por lo
general este tipo de paciente concomitantes son los que están más expuesto a padecer micosis
por hongos oportunistas y presentar complicaciones en el transcurso de la enfermedad.

6.1.1. Taxonomía

Los hongos son una clase definida de microorganismos, la mayor parte de los cuales son
formas de vida libre, que actúan como putrefactores en el ciclo energético. De las más de
200 000 especies conocidas, menos de 200 se han reportado como causantes de enfermedades
en humanos, (…). Siendo estos, células eucariotas con un nivel biológico de complejidad
más elevado que las bacterias. Pueden ser unicelulares o sufrir diferenciación y ser
multicelulares mediante el desarrollo de filamentos ramificados, Las micosis varían en gran
medida en cuanto a sus manifestaciones, pero tienden a ser subagudas o crónicas con
evolución lenta y con recaídas, la enfermedad aguda, como aquella que es producida por
muchos virus y bacterias, es poco común en infecciones micóticas (Ryan, 2011, p. 527). En
los procesos micoticos la enfermedad se caracteriza según la posición o el tropismo
anatómico del hongo hacia el paciente, clasificando de esta manera las micosis en cuatro
grupos; micosis superficiales, micosis cutáneas, micosis subcutáneas, y micosis sistémicas.

Se clasifican en su propio reino, el reino Fungi. Son microorganismos eucariotas que se

distinguen de los otros eucariotas porque tienen una pared celular rígida formada por quitina
y glucano y una membrana celular en la que el ergosterol sustituye al colesterol como

9
principal componente esterólico, la taxonomía clásica de los hongos se basa
fundamentalmente en la morfología y en la forma de producción de esporas. Sin embargo,
cada vez se tienen más en consideración las características ultraestructurales, bioquímicas y
moleculares, lo que a menudo lleva a cambios de la designación taxonómica original
(Murray, 2013, p. 605). La contemplación de estas características crea excepciones en
algunos hongos donde el taxón puede cambiar en dependencia del estadio que el hongo
presenta, ya sea a nivel saprofito o a nivel sistémico en el individuo, sin embargo hay micosis
que clasifica un grupo de hongos especiales, los cuales han desarrollado mecanismos de
adaptación e infectivos más viables y eficaces, este tipo de hongos pueden presentarse de
manera de moho en la naturaleza y como levadura en el individuo o en situaciones
ambientales adversas para su desarrollo, este tipo de hongos se les conoce como dimórficos.

6.1.2. Morfología

Los hongos tienen una pared celular rígida, compuesta principalmente de polisacáridos
(manano, glucano y quitina), lipopolisacáridos, y polipéptidos, carentes de clorofila, lo que
los separa radicalmente de las plantas, ya que no presentan la capacidad de realizar la
fotosíntesis (Ryan, 2011) afirma que:

Las células micóticas tienen características típicas de eucariotas, lo que incluye la

presencia de un núcleo con un nucléolo, membrana nuclear y cromosomas lineales.
El citoplasma contiene un citoesqueleto con microfilamentos de actina y microtúbulos
que contienen tubulina. También cuentan con ribosomas y organelos, como las
mitocondrias, retículo endoplásmico y aparato de Golgi. Las células micóticas tienen
una pared celular rígida externa a la membrana citoplásmica, cuya constitución
química difiere de la observada en plantas y bacterias (p. 527).

El agrupamiento más sencillo, basado en la morfología, divide a los hongos en levaduras y

mohos. Se puede definir morfológicamente una levadura como una célula que se reproduce
mediante gemación o fisión, de manera que una célula progenitora o «madre» desprende una
porción de sí misma para producir una célula descendiente o «hija». Las células hijas se
pueden elongar para formar seudohifas con forma de salchicha. Las levaduras habitualmente

10
son unicelulares y producen colonias redondeadas, pálidas o mucoides en agar. Por otro lado,
los mohos son microorganismos multicelulares formados por estructuras tubulares filiformes
denominadas hifas, que se alargan en los extremos mediante un proceso conocido como
extensión apical, las hifas pueden ser cenocíticas (huecas y multinucleadas) o tabicadas
(divididas por separaciones o tabiques transversales), (Murray, 2013, p. 605). También las
hifas pueden contener características distintivas como pigmentación lo que las clasificaría en
hialinas e hifas pigmentadas, debido a la producción de pigmentos generando una amplia
gama de colores que pueden apreciar claramente en los medios de cultivos o en los micelios
micoticos, que van desde verdes, negros, rojos, amarillos, blancos, y muchos otros.

Las hifas se unen para formar una estructura similar a un tapete denominada micelio, cuando
crecen en agar o en otras superficies sólidas, los mohos producen las denominadas hifas
vegetativas, que crecen sobre la superficie del medio de cultivo o por debajo del mismo, y
también hifas que se proyectan por encima de la superficie del medio de cultivo, las
denominadas hifas aéreas. Las hifas aéreas pueden producir estructuras especializadas
conocidas como conidios (elementos reproductores asexuados), los conidios pueden estar
producidos por un proceso blástico (de gemación) o por un proceso tálico, en el que los
segmentos de las hifas se fragmentan para dar lugar a células individuales o artroconidios.
Los conidios son transportados por el aire con facilidad y sirven para diseminar el hongo, el
tamaño, la forma y determinadas características del desarrollo de los conidios se utilizan
como método para identificar los hongos en género y especie (Murray, 2013, p. 605).

La mayoría de los hongos tienen respiración aerobia, aunque algunos son anaerobios
facultativos (fermentativos) y otros son anaerobios estrictos. Desde el punto de vista
metabólico los hongos son heterótrofos, y son versátiles desde el punto de vista bioquímico,
de manera que producen metabolitos tanto primarios (p. ej., ácido cítrico, etanol, glicerol)
como secundarios (p. ej., antibióticos [penicilina], amanitenos, aflatoxinas) (Murray, 2013,
p. 605). Esta característica metabólica de los hongos, es lo que los hace microorganismos
muy importantes, tanto a nivel industrial como microorganismos benéficos debido a sus
metabolitos los cuales son utilizados en muchos procesos alimenticios como es el caso de la

11
levadura Saccharomyces cerevisiae que es común mente utilizada para la fermentación de la
harina para la elaboración de pan, y cerveza, a como son microrganismo deteriorantes que
descomponen los alimentos alterando su inocuidad, y en la parte clínica cuando presentan un
comportamiento como microbios patógenos u oportunistas.

6.1.3. Reproducción

Los hongos se reproducen mediante la formación de esporas que pueden ser sexuadas (lo que
supone una meiosis, precedida por la fusión del protoplasma y el núcleo de dos tipos de
apareamiento compatibles) o asexuadas (sólo se produce mitosis). Los hongos de los subfilos
Mucormycotina y Entomophthoromycotina y las clases Pneumocystidiomycetes,
Basidiomycetes, Saccharomycetes y Euascomycetes producen esporas tanto sexuadas como
asexuadas. La forma de hongo que produce esporas sexuadas se denomina teleomorfo y la
forma que produce esporas asexuadas, anamorfo (Murray, 2013, p. 606). Según el
mecanismo de reproducción estos se pueden calsificar en dos grupos, que son; los hongos
perfectos (teleomorfos), los cuales corresponden a los filos zygomycota, ascomycota y
basidiomycota, donde cada filo presentara esporas o estructuras de reproducción
características (p. ej., ascosporas, zigosporas, basidiosporas), y el otro grupo de clasificación;
los hongos imperfetos (anamorfos) que pertenecen los hongos del filo deuteromycota lo
cuales presentan una reproducción asexual. En lo que concierna a las formas de las esporas
o estructuras de reproductivas de los hongos pueden ser de dos tipos; exosporas d entro de
las cuales están comprendidas los conidios o endosporas que normalmente se encuentran
dentro de una estructura llamada esporangio.

6.2. Medios de conservación

Los métodos de conservación son un conjunto de técnicas las cuales se usan en el laboratorio
microbiológico con el fin de garantizar las características puras de un cultivo o cepa de paso
del tiempo, permitiendo que entre el 70 – 80 % de las células conservadas mantengan su
integridad genética y sobrevivan al proceso de conservación.

12
6.2.1. Métodos de conservación a largo plazo

El manejo de microorganismos contempla métodos de elección o de conservación a largo

plazo, con los que se paraliza el crecimiento de las células microbianas sin causar pérdida de
viabilidad. Así, se avala la estabilidad genética al limitar la aparición de generaciones
sucesivas y la actividad celular durante varios años. Los métodos de conservación
pertenecientes a este grupo incluyen: criopreservación y liofilización (Pinzón, 2009, pág. 3).

6.2.2. Criopreservación

La criopreservación tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad y funcionabilidad

celular a temperaturas bajas. La criobiología se refiere a entender los efectos de las
temperaturas bajas sobre los sistemas celulares ya que el tiempo biológico es una
consecuencia de determinadas reacciones bioquímicas y el frío prolonga el tiempo biológico
puesto que enlentece estas reacciones. Sin embargo, este no es un proceso exento de
problemas ya que puede inducir variaciones extremas en las propiedades químicas, térmicas
y eléctricas las cuales pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada
interacción célula-célula inherente en las células y tejidos a criopreserva (Portillo, 2006, pág.
2). Esta técnica se realiza guardando a la cepa de interés en una suspensión a bajas
temperaturas, normalmente por debajo de 0 oC , como consecuencia de esto las células
fúngicas detienen su crecimiento como resultado a la poca disposición de agua líquida, este
tipo de técnicas de preservación afecta la viabilidad celular, por lo que la célula requiere ser
protegida a la criogenización con un agente crioprotector como el glicerol, o
dimetilsulfóxido, leche descremada e hidratos de carbonos como glucosa, lactosa, sacarosa,
inositol entre otros, donde la elección del agente crioprotector dependerá del microorganismo
a preservar.

Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el
inconveniente de requerir aparatos especiales, y además existe el peligro de que algún fallo

13
del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento.
También resulta ser el método más molesto para realizar el envío de las cepas (López, 2004).

6.2.3. Liofilización

La liofilización puede ser el método más utilizado como la tecnología sofisticada para la
preservación del germoplasma fúngico, y es la técnica primaria realizada en las técnicas
generales para la colección de cultivos fúngicos. Los cultivos pueden ser procesados en un
tiempo relativamente corte después de ser liofilizados, las ampollas de liofilizados pueden
ser almacenadas y luego enviadas para su posterior rehabilitación. El secado por frio es
efectivo para casi todas las formas de conidias fúngicas, entre lo que corresponden a los
Hyphomicetes y Coelomycetes, Ascomycetes, y Basidiomycetes. No suele ser útil usarlo con
hongos con células muy acuosas como muchos Oomycetes y los Entomophthorales.
(Humber, 1997). Esta técnica de conservación impide el crecimiento de las células de los
microorganismos sometidos al procedimiento como consecuencia de la reducción del agua
mediante la liofilización, lo que garantiza una gran estabilidad genética, pero en menor
proporción que en el proceso de congelación.

La liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células. Por lo tanto, primero
tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla mediante el vacío, sin
que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del
microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de
los que hay muchos modelos en el mercado. Las células microbianas así conservadas se
someten a un tratamiento más complejo que en el caso de la congelación, pues la liofilización
se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la congelación previa. Sin
embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y
para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden almacenarse a
temperatura ambiente (18-20ºC), con lo cual su envío es muy cómodo (López, 2004). Dentro
de los crioprotectores especiales para la conservación y protección de las células fúngicas

14
ante este procedimiento es el uso de la leche descremada, que garantiza una mejor
conservación fúngica.

6.2.4. Métodos de conservación alternativos

Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por
carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los
tratamientos de la conservación por estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se
debe usar un único método alternativo (López, 2004). Cuando se usan métodos de
conservación alternativos es recomendable utilizar como mínimo dos métodos para la
preservación de la cepa de interés, con el fin de garantizar la viabilidad de las cepas
conservadas.

El almacenar hongos a temperatura ambiente en lugar de la refrigeración puede requerir

menos recursos que cualquier otra estrategia de conservación, pero también parece ser la
técnica menos confiable y de menor duración. (Humber, 1997). Este tipo de técnicas debido
a su constante rehabilitación para la preservación de las cepas crea la posibilidad de la
variación genéticas de las cepas las cuales serán diferentes al paso del tiempo con la cepa
madre o primera cepa preservada.

6.2.5. Conservación fúngica por transferencia periódica

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha

crecido. Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo,
porque al seguir activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan,
provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro
tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor método para conseguir la estabilidad
genética, puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al
cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células

15
iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características. Si se va a utilizar
este método es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos
resiembras (López, 2004).

Algunas medidas eficaces para aumentar el tiempo de resiembras y envejecimiento son;

disminuyendo la cantidad de inóculo; rebajando la proporción de algunos nutrientes en el
medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios
facultativos, ya que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos
generalmente tóxicos; y almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC. A veces también se suele
recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con esto se consigue también
evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que podría ser tóxico
para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los
microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden
guardar en tubos completamente cerrados (López, 2004).

La transferencia periódica es la forma más fácil para el almacenamiento de cultivos fúngicos

para estudios relativamente a corto plazo (durante unas pocas semanas o meses), aunque
puede servir adecuadamente para mantener pequeñas cantidades de cultivos durante muchos
años. Hay varios inconvenientes potencialmente graves que se deben de considerar en la
transferencia en serie de hongos, como lo son los subcultivos repetidos, los que pueden llevar
a cambios tan perjudiciales como la pérdida de patogenicidad, virulencia o esporulación, pero
no hay forma de predecir si o cuando se repite el subcultivo podría resultar en la pérdida de
caracteres vitales (Humber, 1997). Otro problema es la contaminación de los tubos a lo largo
del tiempo y la posibilidad de la entrada de ácaros a estos en el momento del recultivo.

6.2.6. Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril

Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos

tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias.

16
Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar.
Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la
concentración celular no debe ser superior a 104-105 células/ml en el caso de bacterias y
levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión
trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la
suspensión se hace en agua de mar diluida. (López, 2004). Este tipo de técnicas de
conservación puede que no sea una de las más sofisticada tecnológicamente hablando, pero
es un método útil para la conservación de muchos hongos diversos, y para hongos los cuales
por su alto contenido en agua no se pueden liofilizar, y es un método ampliamente utilizado
con un gran número de hongos patógenos, conservando la viabilidad de estos por muchos
años.

La estasis del agua es probablemente una técnica de almacenamiento adecuada para casi
todos los patógenos fúngicos de los invertebrados. Esta técnica requiere tener solo tapón de
rosca estéril. tubos o viales y agua esterilizada (agua del grifo puede ser utilizado si el agua
destilada o desionizada no está disponible). Los materiales utilizados para esta técnica se
pueden mantener a temperatura ambiente o bien en refrigeración. Los problemas más graves
de esta técnica es la cantidad de inoculo en relación al volumen del agua utilizado, lo que sí
es desproporcional puede poner en riesgo la capacidad del hongo para soportar el
almacenamiento a largo plazo (…), y la pérdida del agua de los tubos de almacenamiento por
evaporación al estar mal sellados (Humber, 1997)

Los resultados obtenidos por la conservación por agua destilada en la preservación de

microorganismos por este método muestran altos porcentajes de viabilidad en periodos a
veces superiores a 5 años. La estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es
buena, pero no se ha comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder
fermentativo, etc. (López, 2004).

17
6.2.7. Método de conservación fungía en aceite mineral

La técnica de aceite mineral permite el almacenamiento de cultivos inclinados bajo una capa
de aceite mineral estéril. El aceite es uno de los métodos más antiguos, sencillos y menos
costosos, y es un método para la preservación del cultivo a largo plazo, con un enfoque
ampliamente utilizado, especialmente para los hongos, que no toleran la liofilización o en
lugares criogénicos donde el almacenamiento es demasiado costoso. El aceite previene la
desecación como disminuye el intercambio de gases, reduciendo asi el metabolismo fúngico
a un nivel muy bajo (…), las botellas de McCartney u otras botellas de tapón de rosca con
juntas de gomas debe evitarse a menos que las juntas se retiren, ya que los componentes
solubles en el aceite del caucho pueden ser toxico para los cultivos. (Humber, 1997). Este
medio garantiza la patogenicidad de algunos hongos los cuales se conservan por varios
meses, pero al ser conservados por mucho tiempo como años la patogenicidad y la virulencia
disminuye.

La técnica de conservación bajo aceite mineral estéril, es un método el cual se basa en la

supresión de la evaporación, tras cubrir con aceite mineral, o vaselina estéril (peso
específico:0,830-0,890) una estría del hongo a conservar (hasta 10mm sobre su superficie),
lo que impide la evaporación del agua contenida en el medio de cultivo y de esta manera se
evita el aumento de la presión osmótica, por concentración de solutos, que produciría
alteraciones significativas al cultivo fúngico, permitiendo también que los preservados sean
conservados en refrigeración o a temperatura ambiente (Rico, 2004). Este método ofrece
además las ventajas de ser sencillo, económico accesible para los laboratorios los cuales no
cuentan con condiciones estructurales y de equipos avanzados para las técnicas de
conservación como criopreservación o liofilización.

6.2.8. Conservación fúngica a través de métodos restringidos

Los métodos restringidos no se utilizaban habitualmente. Los más comunes son: desecación
en papel filtro y la desecación en tierra, arena, silicagel o algún otro soporte apropiado, estos

18
métodos de conservación se basan en la detención del crecimiento de las células por
eliminación del agua disponible. Se aplica a aquellos grupos de microorganismos que no
resisten los métodos de conservación por elección (Rico, 2004). Estos métodos son
necesarios para la conservación de aquellos microorganismos los cuales no pueden resistir el
proceso de liofilización ni congelación, por lo que se toman como métodos alternativos para
la preservación de cepas fúngicas.

6.2.9. Desecación en papel de filtro

Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solución
muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible
desecarlos por el procedimiento que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza
para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación previa de las células. El vacío
producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un vacío excesivo
provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado,
ocasionando la congelación incontrolada de las células (López, 2004). Esta técnica permita
la conservación de las células fúngicas y mantener su viabilidad genética.

6.2.10. Desecación en arena, suelo, silicagel

Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos
productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método (López,
2004). Los soportes que se utilizan como sustrato para esta técnica son previamente secados
y esterilizados, utilizando calor seco, no autoclave, luego se agrega la suspensión de
microorganismos y se deja secar a temperatura ambiente, los sustratos para esta técnica
pueden ser discos o tiras de papel, agar, discos de gelatina donde se agrega la suspensión y
se seca por vacío evitando la congelación.

19
La técnica de almacenamiento de esporas en gel de sílice anhidro estéril, son la única técnica
de almacenamiento de microorganismos que recomienda el uso de congeladores a -20oC. Es
posible almacenar gel de sílice inoculado con hongos en temperatura ambiente si el espacio
del congelador no está disponible pero la viabilidad de los hongos generalmente disminuirá
más pronto. Las esporas fúngicas almacenadas en gel de sílice pueden permanecer viables
para más de diez años (Humber, 1997). Los hongos con altas proporciones de volúmenes
vacuolar en el citoplasma y anaerobios no son aptos para el almacenamiento a través de la
técnica de gel de silicio.

6.2.11. Desecación en bolitas de alginato

Éste es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en una matriz de alginato
y la eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y
posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas
de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre
4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajo contenido en agua de las
células y la protección que suministra el soporte de alginato. Este es un método que se está
utilizando incluso para la conservación de algas y células vegetales (López, 2004).

6.3. Medios de cultivos

Según (Arenas, 2014) los medios de cultivos clásicos pueden ser de tres tipos: naturales,
semisintéticos y sintéticos. Los naturales están elaborados con leche, huevo, granos de
cereales, levadura de cerveza, frutas y otros compuestos. Los semisintéticos, como el
Sabouraud, aportan una fuente de carbono y nitrógeno. Los sintéticos tienen una composición
química bien definida y se usan en investigación; no son de uso sistemático. Los medios de
cultivo clásicos se preparan con facilidad; los ingredientes se disuelven por separado en agua
y se mezclan en un matraz de Erlenmeyer; se calientan 15 min a baño María y 5 min en el
mechero, la solución se coloca en tubos y se procesa en autoclave a 110 °C durante 15 a 20
min; al sacarlos se colocan en posición inclinada para aumentar la superficie de cultivo. Se

20
pueden utilizar cajas de Petri, que deben llenarse después de esterilizar el medio. Si se usa
tapón de rosca no se debe tapar herméticamente para facilitar la llegada de oxígeno, o se
pueden usar tapones de algodón. Todas las manipulaciones han de realizarse en el área de
esterilidad de la llama de un mechero de Bunsen o en una campana de flujo laminar (p. 351).

6.3.1. Agar glucosa de Sabouraud.

Este medio fue desarrollado para el cultivo de hongos patógenos, especialmente de los
productores de micosis superficiales. En la actualidad se recomienda sólo para el aislamiento
primario de dermatófitos, con el agregado de cicloheximida y cloranfenicol. El pH final
(alrededor de 5,6) es mucho menor que el de la mayoría de los medios y tiende a eliminar el
crecimiento bacteriano. Los subcultivos de los hongos aislados originalmente en BHI pueden
presentar una morfología más uniforme en agar glucosa de Sabouraud, por esto es útil para
la identificación de hongos una vez aislados (Anónimo, 2012). Es el medio clásico de
aislamiento; en ocasiones no es el idóneo, pero se usa de manera universal para la
identificación sistemática de los hongos (Arenas, 2014, p. 351).

6.3.2. Medio de Sabouraud con antibióticos

El agar Sabouraud con cloranfenicol es un medio de cultivo micológico el cual se utiliza para
el asilamiento selectivo de hongos en un entorno de laboratorio, este medio sin embargo no
está destinado a ser utilizado para el diagnóstico microbiológico de enfermedades o cualquier
otra condición de origen micótico en humanos, su uso principal es el cultivo de hongos
patógenos, comensales y algunos tipos de levaduras, y es beneficioso para el estudio de
esporulación y producción de pigmentos.

Para cualquier aislamiento se recomienda el medio simple de Sabouraud y el adicionado con

antibióticos, pero debe evitarse el cloranfenicol si hay sospecha de actinomicetos, o la
cicloheximida (Actidione) si se sospecha de enfermedad por agentes oportunistas (Arenas,
2014, pp. 351-352).

21
6.4. Otros medios de cultivo
6.4.1. Medio líquido de Sabouraud

Es igual al medio simple de Sabouraud, pero sin agar; puede utilizarse para rehidratar cultivos
desecados (Arenas, 2014, p. 352).

6.4.2. Agar BHI (infusión cerebro-corazón, “brain-heart”)

La infusión cerebro-corazón es una fórmula muy rica que puede emplearse, ya sea como
caldo o medio sólido, con sangre adicional o sin ésta, para el crecimiento de una gran variedad
de microorganismos. Los componentes clave incluyen infusión de distintos tejidos animales
con el agregado de peptona, tampón fosfato y una pequeña concentración de glucosa que
proporciona una fuente de energía fácilmente accesible a los microorganismos. Los caldos
infusión cerebro-corazón se emplean con frecuencia como medio para hemocultivo y como
medio base para muchas pruebas metabólicas, en especial para la identificación de
estreptococos (Anónimo, 2012).
Sirve para cultivar actinomicetos y obtener la fase levaduriformes de hongos dimorfos
(Arenas, 2014). La infusión cerebro-corazón es una fórmula muy rica que puede emplearse,
ya sea como caldo o medio sólido, con sangre adicional o sin ésta, para el crecimiento de una
gran variedad de microorganismos.

6.4.3. Agar BHI con antibióticos

El agar BHI adicionado de cloranfenicol y cicloheximida se utiliza para el aislamiento

selectivo de hongos patógenos. La cicloheximida inhibe el crecimiento de hongos saprófitos
mientras que el cloranfenicol actúa como agente antibacteriano tanto de bacterias Gram
positivas como Gram negativas. La incorporación de ambos antimicrobianos proporciona
una mayor selectividad frente a hongos saprófitos y bacterias.

22
6.4.4. Agar BHI con 5% sangre de oveja

El agar infusión cerebro-corazón con 5-10% de sangre de oveja adicionado de cloranfenicol

y gentamicina inhibe el crecimiento de bacterias, pero permite el crecimiento de hongos,
incluso de los más exigentes. Este agar se emplea como medio de aislamiento primario para
el crecimiento de hongos, ya que permite una mejor recuperación de patógenos que el agar
glucosa de Sabouraud (Anónimo, 2012).

6.4.5. Agar papa dextrosa (APD)

El agar papa dextrosa es un medio de cultivo microbiológico que se preparan a partir de

infusión de patata y dextrosa. La base del medio es altamente nutritiva, favorece el
crecimiento de hongos y levaduras y permite la esporulación y la producción de pigmentos
en algunos dermatofitos. Algunos procedimientos señalan bajar el pH del medio a 3.5 ± 0.1
con ácido tartárico al 10 %, para inhibir el crecimiento bacteriano. El agar es adicionado
como agente solidificaste. El Agar Dextrosa y Papa puede ser suplementado con antibióticos
o ácidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este medio es recomendado también para
realizar recuentos y para el cultivo de hongos y levaduras de importancia clínica (APHA,
1992).

23
 7. Diseño metodológico
7.1. Tipo de estudio.

Se realizará un estudio descriptivo prospectivo de corte transversal.

De acuerdo a (Canales, Alvarado, & Pineda, 1994) los estudios prospectivos se registra la
información según van ocurriendo los fenómenos (…). Una investigación es transversal
cuando se estudian las variables simultáneamente en determinado momento, haciendo un
corte en el tiempo. (...) y los estudios descriptivos son la base y punto inicial de los otros
tipos y son aquellos que están dirigidos a determinar "cómo es " o "cómo está" la situación
de las variables que se estudian en una población, la presencia o ausencia de algo (pp. 81-
83).

7.2. Tipo de muestreo

No probabilístico por conveniencia.

En las muestras no probabilísticas, la elección de los elementos no depende de la

probabilidad, sino de causas relacionadas con las características de la investigación o los
propósitos del investigador (Sampieri, 2014, p. 176).

7.3. Área de estudio.

En el laboratorio microbiológico de docencia del POLISAL UNAN-Managua, donde se

cuenta con un pequeño cepario micológico, está ubicado de la rotonda Universitaria
Rigoberto López Pérez 150 Metros al Este.

24
7.4. Periodo del estudio.

El periodo de estudio estará comprendido entre los meses de Enero – Abril del año 2019.

7.5. Universo

El universo está conformado por el total de cepas micológicas conservadas en el laboratorio

microbiológico de docencia del POLISAL UNAN-Managua.

7.6. Muestra:

Está conformada por X número de cepas micológicas conservadas en el laboratorio

microbiológico de docencia del POLISAL UNAN-Managua, las cuales serán seleccionadas
bajo los siguientes criterios:

7.7. Criterios de inclusión.

1- El total de cepas micológicas que se encuentren conservadas en el laboratorio.

2- Todas las cepas micológicas que estén contaminadas.

7.8. Criterios de exclusión:

1- Todas aquellas muestras que no pertenezcan al cepario.

2- Todas aquellas muestras que no se encuentren conservadas.

25
7.9. Métodos, técnicas e instrumentos para la recolección de la información

Para la realización de la presente investigación, primeramente, se deberá consultar múltiples

bibliografías y literaturas, asi como páginas web, artículos científicos y revistas digitales,
donde se evidencie registros de las técnicas de conservación, cultivo y determinantes de
viabilidad para la habilitación de ceparios micológicos.

7.10. Procedimientos para la recolección de datos

Para la recolección de datos acerca del laboratorio microbiológico de docencia del

POLISAL-UNAN, Managua, se realizará una carta a la directora del departamento de
Bioanálisis Clínico y Microbiología, Lic. Ligia Lorena Ortega, donde se planteará el tema,
objetivos y justificación de dicha investigación, con el fin de permitir el acceso a dicho
laboratorio para obtener información de las muestras conservadas.

7.11. Procesamiento de la muestra

Materiales a utilizar

- Agar glucosa Sabouraud

- Medio de Infusión de cerebro – corazón (BHI)
- Medio Sabouraud con antibióticos
- Aceite mineral
- Agua destilada
- Agua de mar estéril

Pasos a seguir

- Se procederá a la recolección de las muestras guardas en los medios de conservación,

se realizará el examen microscópico, y su siembra en nuevos medios de cultivos.

26
 - Se elaborará un atlas de estructuras fúngicas donde se plasmarán las características
microscópicas y macroscópicas de cada cepa micológica observada y reactivada.
- A través de una bitácora, se anotarán las fechas de siembra, tiempo de maduración y
las características que determinen la pureza del cultivo, como capacidad de
dimorfismo, crecimiento, y estructuras fúngicas especializadas.
- Cada cepa recuperada, se inocularán por lo menos dos medios de conservación
diferentes con el fin de garantizar su almacenamiento y características fenotípicas y
genotípicas integras en la medida de lo posible.
-

7.12. Limitaciones del estudio

- Las posibles limitaciones en la rehabilitación de las cepas conservadas, es la

contaminación con diferentes hongos circulantes en el ambiente del laboratorio.
- Los métodos de conservación como el agua destilada no permiten la integridad
genética de las cepas conservadas, por lo que podrían presentarse mínimas
variaciones fenotípicas en algunas cepas micológicas, como resultado de antigüedad
del medio.
- Los medios de conservación son altamente sensibles a la contaminación por cepas
contaminantes como Penicillium, Fusarium y Aspergillus.

7.13. Plan de tabulación y análisis

Para la elaboración del documento se utilizará el programa de Microsoft Word 2016, los
resultados se presentarán mediante gráficas las cuales serán realizadas en el programa
estadístico IBM SPSS versión 25.0 y la presentación con diapositivas para la defensa en el
programa Microsoft Power Point 2016

27
 7.14. Operacionalización de las variables
Instrumento de
Variables Indicador Valores Criterios recolección de la
información
- Tiempo de conservación activo.
□ 3 - 6 Meses
□ > 6 Meses - Cepas recultivables.
□ 1 - 6 Años
□ > 6 Años - Cepas que conservan su expresión fenotípica.
Agua destilada
- Tiempo de conservación activo.

□ < 90 dias - Incapacidad del medio para la conservación de las

células fúngicas.

- Tiempo de conservación activo:

□ 3 - 6 Meses
□ > 6 Meses - Cepas recultivables.
□ 1 - 6 Años
□ > 6 Años - Cepas que conservan su expresión fenotípica.
Agua de mar Bitácora
Métodos de conservación estéril
- Tiempo de conservación activo:
□ < 90 dias
- Incapacidad del medio para la conservación de las
células fúngicas.

- Tiempo de conservación activo.

□ 3 - 6 Meses
□ > 6 Meses - Cepas recultivables.
□ 1 - 6 Años
□ > 6 Años - Cepas que conservan su expresión fenotípica.
Aceite mineral
- Tiempo de conservación activo:
□ < 90 dias
- Incapacidad del medio para la conservación de las
células fúngicas.

28
 - Crecimiento satisfactorio de:
Aspergillus spp, Candida albicans, Trichophyton spp,
etc.

- Formación de colonias características según la

□ Si especie y genero fúngico.

- Presencia de pigmentos.

Agar - Formación de micelios aéreos.

sabouraud
- Ausencia de crecimiento.

- Perdida de la capacidad de dimorfismo o estructuras

especializadas.
□ No
- Tiempo de maduración lento.

- Perdida de la capacidad para formar pigmentos.

Métodos de cultivos para Bitácora
la clasificación
Crecimiento satisfactorio de:
Candida albicans, Aspergillus spp, Penicillium spp, etc.

- Colonias características según cepa y genero fúngico.

□ Si
- Capacidad de producir pigmentos.

- Formación de micelios reproductivos.

Medio
Sabouraud con - Ausencia de crecimiento.
antibióticos
- Perdida de la capacidad de formación de estructuras
fúngicas.
□ No
- Pérdida de capacidad de dimorfismo.

- Maduración tardía.

- Perdida de la capacidad de producir pigmentos.

29
 - Crecimiento de dermatofitos satisfactorio.

- Características macroscópicas de las colonias según

especie y género.

□ Si - Producción de pigmentos.

- Formación de estructuras especializadas.

Medio infusión
cerebro, corazón - Formación de micelio reproductivo.
(BHI)
- Ausencia de crecimiento.

- Perdida de la capacidad de dimorfismo o estructuras

especializadas.
□ No
- Tiempo de maduración lento.

- Perdida de la capacidad para formar pigmentos.

Observación microscópica de:

- Hifas
- Conidióforo
- Conidia
- Septos
□ Si
- Fiálide
- Esporas
Características - Levadura (tubo germinal)
Viabilidad micológica de microscópicas - Artroconidios Atlas de estructuras
los hongos conservados - etc... fúngicas

□ No Ausencia de estructuras fúngicas

30
 Características del Cultivo:

- Colonia
- Textura
- Pigmento
□ Si
- Superficie
- Color (frente y reverso)
- Aspecto
Características - Consistencia
Macroscópicas - Borde

□ No Ausencia de crecimiento fúngico en el medio de cultivo.

Viabilidad micológica de - Dimorfismo por medios de cultivos pobres en Atlas de estructuras

los hongos conservados nutrientes. fúngicas
□ Si □ No
(Candida albicans en fase filamentosa)

Capacidad de
dimorfismo
- Dimorfismo mediados por temperaturas diferentes:
□ Si □ No
25 – 28oC filamentosos
35 – 37oC Levaduriformes

□ Si - Formación de micelio reproductivo.

Capacidad
reproductiva

□ No - Ausencia de micelio reproductivo.

31
 8. Cronograma de actividades

Actividades Enero Febrero Marzo Abril Resultados

1 Fase I
Identificación del problema y recolección de datos.
2 Fase II
Reaislamieto de cepas micológicas conservadas.
3 Fase III
Identificación de los hongos reaislados.
4 Fase IV
Evaluación de la viabilidad de los hongos recuperados.
5 Fase V
Clasificación de las cepas recuperadas.
6 Fase VI Evaluación
Conservación de las cepas recuperadas.
La fase de evaluación se debe realizar 3 meses después del proceso de conservación para evaluar si el método, permitió la
conservación pura de las cepas recuperadas y permitir asi la estandarización de los métodos de conservación a usar en el laboratorio
microbiológico de docencia del POLISAL-UNAN, Managua.

= Equivalente a 15 días.

32
 9. Presupuesto

Nombre del articulo Unidad de Costo unitario ($) Cantidad a Incremento Gasto ($)
medida necesitar 25%
450gr 816.14 1 - 816.14
Agar dextrosa sabouraud

100gr 450.12 1 - 450.12

Agar sabouraud / antibióticos

100gr 730 1 - 730

Agar BHI

1lt 62 1 - 62
Aceite mineral

20unid 3,72 2 10 9.30

Placa petri 90x14mm

Sub total 2061.98 Total 2067.56

33
10. Conclusiones
(…)

34
 11. Bibliografía

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/ INTERAMERICANA EDITORES, S.A. DE C.V.

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 12. Anexos

Carta de solicitud para el acceso al laboratorio microbiológico de docencia del

POLISAL-UNAN, Managua.

Managua / Nicaragua

Jueves 17 de enero del 2019

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA UNAN-MANAGUA

POLISAL, UNAN-MANAGUA

Para:

Msc. Ligia Lorena Ortega.

Dir. Departamento de Bioanálisis clínico y Microbiología.

Estimada Lic. Lorena Ortega...,

Por medio de la presente me dirijo a usted, con el objetivo de realizar una formal solicitud,
la cual detallo a continuación: Actualmente, yo Jimmy Javier Martínez Maltez y Lidieth
Paola Murillo Espino, estamos realizando una investigación, en la que necesitamos su apoyo,
con el aprobamiento para el ingreso a los laboratorios de la licenciatura, y el acceso a las
muestras o cepas miológicas conservadas en este último, debido a que nuestra investigación
tiene como objeto principal la rehabilitación del cepario micológico de los laboratorios de
docencia de Bioanálisis clínico y microbiología…

A continuación, le detallamos el tema, objetivos y justificación de dicha investigación:

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MÉTODOS DE CONSERVACIÓN Y CULTIVO PARA LA REHABILITACIÓN DEL CEPARIO
MICOLÓGICO DEL LABORATORIO MICROBIOLÓGICO DE DOCENCIA EN EL POLISAL
UNAN-MANAGUA, EN LOS MESES DE ENERO A ABRIL DEL AÑO 2019.

Objetivo general:

Evaluar los métodos de conservación y cultivo para la rehabilitación del Cepario micológico del laboratorio
microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-Managua, en los meses de enero a abril del año 2019.

Objetivos específicos:

1- Implementar métodos conservación idóneos para la rehabilitación del Cepario micológico del laboratorio
microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-Managua, en los meses de enero a abril del año 2019.

2- Aplicar métodos de cultivos adecuados para la clasificación de los diferentes hongos conservados en el
Cepario micológico del laboratorio microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-
Managua, en los meses de enero a abril del año 2019.

3- Determinar la viabilidad micológica que presentan los hongos conservados en el Cepario micológico del
laboratorio microbiológico de docencia en el POLISAL UNAN-Managua, en los meses de enero a abril del año
2019.

JUSTIFICACION

La micología es una ciencia médica la cual carece de demandada en Nicaragua, por lo que sigue siendo un área
abierta para la realización de un sin número de investigaciones, hoy en día, el país solo cuenta con un hospital
dermatológico el cual solo se centra en el diagnóstico micológico a través del examen directo, practica la cual
es muy pobre en comparación con el amplio abanico de posibilidades diagnosticas e investigativas que la
micología ofrece, por lo que la formación de un Cepario micológico significa una gran oportunidad para la
realización de investigaciones futuras, y su utilización como una herramienta pedagógica para la enseñanza de
tan inexplorada ciencia en Nicaragua.

El laboratorio microbiológico de docencia del POLISAL UNAN-Managua, cuenta con un pequeño cepario
donde se conservan cepas desde hace más de 20 años, y las cuales han servido a través de los tiempos, para que
los jóvenes estudiantes los cuales reciben la asignatura de micología médica conozcan un poco de los diferentes
tipos de hongos patógenos para el ser humano, responsables de las diferentes micosis conocidas, pero debido
a las pocas condiciones infraestructurales de los laboratorios, espacios para la conservación de muestras
micológicas y las técnicas de cultivo y conservación idóneas que se apliquen a las necesidades actuales del
laboratorio, ha conllevado de manera directa a que el Cepario micológico carezca de muestras nuevas para la
colección de la micoteca y pocos estudios realizados.

La rehabilitación del Cepario del laboratorio microbiológico de docencia del POLISAL UNAN-Managua
simboliza un elemento importante para las investigaciones científicas in-vitro, así como la enseñanza

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pedagógica de la micología, y la oportunidad de nuevas investigaciones en el área de micología médica, con el
fin de permitir una herramienta que fortalezca el conocimiento en el área de micológica médica, por lo que esta
investigación pretende rehabilitar las cepas de hongos conservados en el Cepario micológico y aplicar técnicas
de cultivo con el objetivo de garantizar la conservación de esta micoteca para las generaciones venideras de
jóvenes estudiandos, los cuales apliquen a carreras de la salud, y deban cursar la asignatura de micología
médica, contribuyendo así a la universidad en lo que concierne al área pedagógica y rehabilitación del cepario
y a la sociedad con un personal de salud o laboratorista, con conocimientos micológicos más afianzados.

Sin más que agregar, nos despedimos cordialmente, esperando su positiva y atenta respuesta.

Bch. Jimmy Javier Martínez Maltez /15072446

Bch. Lidieth Paola Murillo Espino / 15072226

Lic. Microbiología IV año segundo semestre.

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