Cap - 10 Criopreservación de Embriones Bovinos

Criopreservación 149
CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES BOVINOS
Jorge Cabodevila &

Miriam Teruel
Introducción
La criopreservación posibilita almacenar embriones de una amplia variedad de

especies mamíferas sin que pierdan su capacidad de desarrollar y nacer vivos. Si bien los
embriones son un conjunto de células, se aplican principios criobiológicos originalmente
estudiados en células aisladas tales como linfocitos y fibroblastos.
En el caso particular de los bovinos, cuyos embriones son recolectados y
transferidos mediante métodos no quirúrgicos, las ventajas que brinda la criopreservación
se ven reflejadas, en primera instancia, durante la ejecución del programa de
transferencia y luego, en mucha mayor magnitud, en el comercio nacional e internacional
de reproductores.
En lo que respecta a la organización del programa de transferencia, la
criopreservación permite utilizar eficientemente donantes y receptoras, otorgando una
mayor flexibilidad en la disponibilidad de estas últimas. También posibilita transferir
algunos embriones y conservar el resto en bancos de germoplasma hasta poder analizar
los registros de producción de la descendencia.
En referencia a la comercialización de reproductores, la criopreservación permite a
los ganaderos progresar genéticamente a bajo costo, comparando los valores del embrión
y de su transporte con el de los animales en pie. También hace posible controlar
enfermedades, reemplazando la importación de animales en pie por la de embriones
criopreservados libres de ellas. Las razones enunciadas convierten a la criopreservación
en una herramienta insustituible en la aplicación de la transferencia embrionaria.
Técnicas de criopreservación
Las técnicas de criopreservación permiten conservar embriones por distintos

períodos dependiendo de las temperaturas que se utilicen.
La refrigeración es un método simple por medio del cual pueden mantenerse
embriones a temperaturas entre 0 y 4ºC durante 24 a 72 hs.
La conservación a -196ºC permite mantener embriones por períodos extensos.
Leibo (1989) identifica cuatro etapas comunes a las diferentes técnicas: exposición de los
embriones a concentraciones molares de agentes crioprotectores, enfriamiento desde
temperaturas fisiológicas hasta temperaturas lo suficientemente bajas como para causar
un virtual cese de todas las reacciones químicas inducidas térmicamente, calentamiento
desde la temperatura de conservación a temperaturas fisiológicas y finalmente, extracción
del crioprotector. En la congelación convencional, ampliamente difundida, los
embriones alcanzan su equilibrio osmótico antes de comenzar el descenso de la
temperatura y lo mantienen durante el enfriamiento. Este, se lleva a cabo lentamente
permitiéndole a los embriones contraerse y ceder agua, en respuesta al incremento
gradual de la concentración de la solución extracelular. Se han desarrollado otras
técnicas en las que se efectúa una deshidratación parcial de los embriones sin que éstos
150 Cabodebila & Teruel
alcancen su equilibrio osmótico. Esto ocurre antes del enfriamiento rápido, en la
vitrificación o durante un breve período intermedio de exposición de los embriones a
temperaturas debajo de 0ºC en la congelación ultrarrápida.
Refrigeración
La refrigeración de embriones se encuentra como un paso intermedio entre la

transferencia de embriones en fresco (recién recolectados) y conservados a -196ºC. Es
una técnica que permite detener el desarrollo embrionario y mantener la viabilidad
embrionaria mediante un simple refrigerador con hielo y agua para regular el descenso de
la temperatura.
Para realizar la refrigeración, se emplea solución buffer fosfato suplementada con
suero fetal bovino o albúmina sérica bovina (PBSS). Los embriones son cargados en
pajuelas de 0,25 ml y colocados en el refrigerador hasta el momento de realizar la
transferencia. Si bien el almacenaje de los embriones se realiza por corto tiempo, un
fenómeno comúnmente observado es el colapso de los blastocistos, el cual puede ser
revertido luego de un breve período de cultivo (Bon Durant y col., 1982).
La técnica se utiliza para transportar embriones cuando las receptoras se
encuentran distantes de las donantes (Leibo y Winninger, 1986; Refsdal y col.,1988) y
también para conservar embriones hasta que receptoras asincrónicas alcancen la
sincronización adecuada. Es una herramienta interesante, considerando su simpleza y
que ha permitido lograr porcentajes de preñez que oscilan entre 44% y 50% (Tabla 1). No
obstante, a pesar de los buenos resultados y de su sencillez, en la actualidad ha caído
prácticamente en desuso debido a que la congelación convencional se ha convertido en
una técnica que si bien es más costosa, permite mantener la viabilidad embrionaria por
tiempos ilimitados, con las ventajas prácticas que ello trae aparejado.
Tabla 1. Resultados obtenidos con la transferencia no quirúrgica de embriones

refrigerados.
Duración de la Embriones Receptoras Referencias

refrigeración transferidos preñadas
hs n n (%)
24 19 9 (47,3) Refsdal y col., 1988
48 16 8 (50,0) Bezugly y col., 1988
Hasta 72 222* 98 (44,1) Lindner y Ellis, 1985
*De 227 embriones refrigerados, 5 fueron descartados en la evaluación morfológica
realizada antes de la transferencia.
Congelación convencional
Es un proceso físico-químico complejo, de intercambio de calor y agua entre las

células y el medio externo que culmina en un cambio de fase líquida a sólida (Schneider y
Mazur, 1984; Aller y col., 1995). Los embriones son congelados y descongelados de
manera rápida. Esto hace necesario deshidratarlos parcialmente antes de la congelación
a fin de evitar la formación de cristales que lesionan los blastómeros (Mazur, 1977). La
deshidratación parcial de los embriones se logra incorporando un agente crioprotector al
medio de congelación (Schneider y Mazur, 1986). Los crioprotectores son sustancias de
bajo peso molecular que pueden penetrar o no a través de la membrana plasmática. Entre
los primeros se encuentran glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), propilenglicol y etilenglicol;
al segundo grupo pertenecen distintos azúcares: sucrosa, trealosa, glucosa, rafinosa, etc.
y macromoléculas tales como polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico y hialuronidato de
sodio. Si bien cada crioprotector tiene mecanismos propios de acción, sus efectos
generales son estabilizar las membranas celulares, producir la salida de agua intracelular
y reducir la concentración de electrolitos del medio extracelular.
La respuesta celular a temperaturas debajo de 0°C depende de la tasa de
enfriamiento a la que son sometidas las células. Cuando se utilizan tasas de enfriamiento
muy lentas, se produce lo que se conoce como efecto de solución, ya que al iniciarse el
descenso de la temperatura, comienza a formarse hielo en la solución extracelular, con la
consecuente concentración de sales. Los blastómeros ceden agua, produciéndose una
deshidratación excesiva de los mismos que ocasiona la disminución del volumen celular y
la destrucción de la membrana plasmática. Por el contrario, si la tasa de enfriamiento es
excesivamente rápida, el agua no alcanza a salir del interior de las células,
produciéndose la formación de cristales de hielo intracelulares. Si la descongelación
posterior es lenta, estos cristales sufren un crecimiento adicional, provocando un daño
mecánico que compromete la vida celular.
Las soluciones de congelación pueden enfriarse por debajo de su punto de
congelación. Al llegar a -10 ó -15ºC, se forma hielo de manera espontánea,
produciéndose un aumento brusco de temperatura denominado calor latente de fusión.
Para evitar este fenómeno perjudicial para los embriones, se induce la formación de hielo
en el medio extracelular. Esta maniobra, denominada “seeding” se realiza entre -4 y -7ºC
tocando el envase de los embriones con una pinza enfriada previamente a -196ºC, o de
manera automática en algunos equipos programables. El descenso controlado de
temperatura (0,3 - 0,6ºC por minuto) continúa hasta que no se producen más cambios de
volumen. Esto ocurre a temperaturas entre -30 y -40ºC, momento en el que los
embriones son sumergidos en nitrógeno líquido a -196ºC (Lehn-Jensen y Greve, 1982)
(Fig 1).
Temperatura (ºC) Estabilización
25 “Seeding"
-7
0,3 - 0,6 ºC/min
- 30
-196
15 25 90
Fig 1. Tasas de enfriamiento utilizadas en la congelación convencional de embriones

bovinos
La temperatura a la que se detiene la congelación lenta y a la cual los embriones
son inmersos en el nitrógeno líquido determina la velocidad de descongelación que será
necesario aplicar. Cuando se la detiene a -30 ó -40ºC es posible realizar la
descongelación de manera rápida, sumergiendo los embriones en un baño María a 20-
37ºC durante 20-30 segundos. Si el enfriamiento lento se extiende hasta -70ºC, la
descongelación debe efectuarse lentamente.
Inmediatamente de realizada la descongelación, el crioprotector debe ser retirado
del embrión para evitar un shock osmótico. En un principio, la extracción se efectuaba de
manera escalonada, colocando los embriones sucesivamente en soluciones decrecientes
del crioprotector o incorporándole progresivamente PBSS con el mismo fin. De esta
manera el crioprotector es retirado en forma lenta y progresiva de las células,
rehidratándose las mismas en forma simultánea (Aller y col., 1995). Posteriormente se
logró extraer el crioprotector en una sola etapa, empleando sucrosa que actúa como una
contrafuerza osmótica restringiendo el movimiento de agua a través de las membranas
(Leibo y Mazur, 1978). Una tercera variante fue efectuar la extracción exponiendo los
embriones a soluciones conteniendo glicerol y sucrosa (Heath, 1990).
El resultado de la congelación está condicionado por la calidad del embrión, por el
tiempo que transcurre desde la recolección hasta que comienza la congelación y por el
estadio de desarrollo embrionario.
Los porcentajes de preñez que se obtienen luego de transferir embriones de calidad
excelente pueden diferir de los de calidad buena, con ambas calidades se obtienen
mejores resultados que con aquellos de calidad regular (Leibo, 1986; Arreseigor y col.,
1998; Munar y col., 1998; Tabla 2).
Tabla 2. Efecto de la calidad embrionaria pre-congelación sobre el porcentaje de preñez

post-transferencia
Calidad embrionaria Embriones Receptoras Referencias

Pre-congelación transferidos preñadas
(grado) n n (%)
Excelente 173 84 (48,6)a Leibo (1986)
Buena 220 98 (44,6)a
Regular 83 20 (24,1)b
Excelente 233 133 (57,1)a Arreseigor y
Buena 276 146 (52,9)a col. (1998)
Regular 276 86 (31,2)b
Excelente 1633 996 (61,0)a Munar y col.
Regular 565 301 (53,3)b (1998)
Buena 123 49 (39,8)c
a, b, c diferencias significativas (p< 0,05)
Por su parte los porcentajes de preñez resultantes de la transferencia de embriones

congelados son inversamente proporcionales al tiempo transcurrido desde la recolección
hasta el comienzo de la congelación (Wright, 1985). La viabilidad embrionaria disminuye
significativamente cuando dicho período es mayor de 3 hs (Pettit, 1985, Figura 2).
70
% de preñez
65 n:119
60
55 n:116
50 n:114
45 n:28
n:102
40
0 3 4 5 7 9 10
Fig 2. Efecto del tiempo transcurrido entre la recolección de los embriones y la

congelación sobre el porcentaje de preñez
Con respecto al estadio de desarrollo, los resultados presentados son discordantes;

en su análisis debe tenerse en cuenta la metodología de congelación utilizada y a su vez
si lo que se evalúa es tasa de supervivencia post-descongelación o tasa de preñez.
Algunos autores han obtenido mejores resultados con mórulas compactas y blastocistos
tempranos que con blastocistos y blastocistos expandidos (Dochi y col., 1998; Munar y
col., 1998); según estos autores los estadios más avanzados serían más sensibles a la
congelación por tener un grado mayor de diferenciación celular y presencia de líquido en
el blastocele. A su vez se observó un mayor efecto del estadio cuando se utilizó
etilenglicol con respecto al glicerol (Palma y col., 1998). En oposición a esto, Prather y
col. (1987) sostienen que los estadios de desarrollo más avanzados son los que
presentan mejor viabilidad post-descongelación, postulan que el avance en el desarrollo
implicaría un grado inherente de viabilidad lo que les concedería a estos embriones menor
posibilidad de sufrir degeneración celular. Finalmente cabe señalar que en un número
importante de trabajos no se han observado diferencias con la congelación de los estadios
comprendidos entre mórula compacta y blastocisto expandido (Leibo, 1982; Pettit, 1985;
Wright, 1985; Nibart, 1986).
En la búsqueda de aumentar la supervivencia embrionaria luego de la congelación,
se han realizado distintas manipulaciones en la zona pelúcida. Se comparó la disolución
enzimática con pronasa con procedimientos mecánicos que variaron desde la realización
de un pequeño orificio a un corte en la zona pelúcida. Esta última técnica permitió
aumentar el porcentaje de protrusión (Baguisi y col., 1998).
La congelación convencional incluye los métodos estándar, "one step" y de
transferencia directa.
Método estándar
Este método posibilitó a Wilmut y Rowson (1973) obtener el primer ternero nacido
de la transferencia de un embrión congelado. El protocolo original comprendía varios
pasos que se detallan en el Cuadro 1.
Cuadro 1: Método de congelación estándar desarrollado por Wilmut y Rowson (1973)
1- Incorporación de 1,5M de dimetilsulfóxido (DMSO), a temperatura ambiente, en

cuatro etapas:
a) 0,25 M de DMSO en PBSS, 5 minutos
b) 0,5 M de DMSO en PBSS, 5 minutos
c) 1,0 M de DMSO en PBSS, 10 minutos
d) 1,5 M de DMSO en PBSS, 20 minutos
2- Enfriado de los embriones a 1°C/minuto hasta -7°C, en tubos de ensayo
conteniendo 0,2 ml del medio de congelación (1,5 M de DMSO en PBSS).
3- Inducción de la cristalización en el medio de congelación a -7°C mediante un
cristal de hielo.
4- Congelación a 0,3°C/minuto hasta -65°C, desde -65°C a 1°C/minuto hasta -120°C.
5- Introducción de los embriones en nitrógeno líquido a -196°C.
6- Retiro de los embriones del nitrógeno líquido y colocación de los mismos en un
baño a -100°C, desde -100°C hasta -10°C, utilizando una velocidad de
descongelación de 10°C/minuto.
7- A -10°C descongelado rápido a temperatura ambiente en un baño a 20°C.
8- Retiro del DMSO en seis etapas a temperatura ambiente:
a) 1,5 M de DMSO en PBSS, 5 minutos
b) 1,25 M de DMSO en PBSS, 10 minutos
c) 1 M de DMSO en PBSS, 10 minutos
d) 0,75 M de DMSO en PBSS, 10 minutos
e) 0,5 M de DMSO en PBSS, 10 minutos
f) 0,25 M de DMSO en PBSS, 10 minutos
g) Colocar en PBSS
9- Evaluación de la viabilidad cultivando los embriones 24 horas en PBSS, a 38°C.
Al método estándar se le han efectuado desde entonces distintas modificaciones

tendientes a su simplificación (Cabodevila y col., 1991). Crioprotectores, velocidades de
enfriamiento, congelación y descongelación y técnicas de extracción del crioprotector han
sido los aspectos sobre los que se ha trabajado.
Con respecto a los crioprotectores, luego de utilizar 1,2 propanodiol (Renard y col.,
1981), etilenglicol y mezclas de DMSO y glicerol (Elsden y col., 1982), generalmente se
eligió al glicerol como crioprotector, especialmente luego que Bouyssou y Chupin (1982)
comunicaron mejores resultados con 1,4 M de glicerol que con 1,5 M de DMSO. La
incorporación del glicerol se simplificó y aceleró notablemente desde el momento en que
se comenzó a realizar en una sola etapa (Bui-Xuan-Ngoyen y col., 1984; Chupin y
Procureur, 1984; Niemann, 1985).
En referencia a los cambios efectuados en las velocidades de enfriamiento,
congelación y descongelación, una de las primeras modificaciones al protocolo original fue
introducida por Willadsen (1977) y resultó sustancial. Demostró que los embriones
sobrevivían cuando la congelación lenta se detenía a -30 ó -40ºC, se los sumergía en
nitrógeno líquido y luego se los descongelaba de manera rápida colocándolos en un baño
María a 25ºC durante 20 segundos. La contribución de Willadsen fue relevante dado que
posibilitó reducir a la mitad, el tiempo requerido por el protocolo original. Además
simplificó y aceleró la técnica de descongelación.
Una mayor simplificación del método de congelación estándar, se logró al
comprobarse que los embriones podían ser colocados en el equipo de congelación,
directamente a la temperatura a la que se induce la cristalización, sin importar la velocidad
de enfriamiento (Bouyssou y Chupin, 1982; Schneider y Mazur, 1984).
El momento de detención de la congelación lenta debe estar en función de la
concentración del crioprotector (Takeda y col., 1985; Massip y col., 1987). Generalmente
entre -20 y -30°C, no se registran diferencias importantes en la viabilidad post-
descongelación (Lehn-Jensen y col., 1981, Lehn-Jensen y Greve, 1982). Algunos autores
recomiendan un segundo período de congelación más lento aún, -0,1°C/min entre -35 y
-38°C (Lindner y col., 1982; Pettit, 1985), mientras que otros prefieren un período de
estabilización de aproximadamente 15 minutos antes de pasar a la congelación rápida
hasta -196°C (Wright, 1985).
Con respecto a las técnicas de extracción del crioprotector una vez retirados los
embriones del envase de congelación, Leibo y Mazur (1978), sugirieron un procedimiento
alternativo a la técnica de extracción escalonada para retirar el crioprotector de los
embriones, utilizaron una concentración isoosmolar de sucrosa (sucrosa 1,12 M es
isoosmolar con glicerol 1,5 M). Este carbohidrato no penetra en los blastómeros y, en
consecuencia, el glicerol sale del embrión más rápidamente que cuando se efectúa la
extracción escalonada. Esto se debe a que el gradiente de concentración intra/extracelular
de glicerol permanece alto porque el compartimento extracelular es generalmente lo
suficientemente grande como para mantener la concentración de glicerol baja. El embrión
retorna a su volumen normal cuando es transferido desde el medio con sucrosa a un
medio isotónico y estos cambios de volumen indican que las membranas celulares
funcionan normalmente (Schneider y Mazur, 1984).
La extracción del crioprotector con sucrosa se ha efectuado con distintas
molaridades (desde 0,25 M hasta 1,08 M) en una o más etapas con molaridad
decreciente, sin variar sustancialmente la viabilidad embrionaria post-descongelación
(Tervit y Elsden, 1981; Renard y col., 1983; Bui-Xuan-Ngoyen y col., 1984; Tekada y col.,
1985; Bielanski y col., 1985 y 1986; Prather y col., 1987). También se han expuesto los
embriones, inmediatamente después de la descongelación, a una mezcla de glicerol y
sucrosa y luego a una solución de sucrosa sola, no observándose diferencias importantes
en la viabilidad embrionaria (Niemann y col., 1982; Niemann, 1985; Munar y col., 1988). El
desarrollo en el cultivo in vitro post-descongelación, resultó inferior en los embriones en
los que la extracción del crioprotector se efectuó en soluciones con molaridad decreciente
de glicerol en PBSS, comparándolo con el de aquellos en los que se utilizó una solución
de sucrosa en PBSS (Bielanski y col., 1986).
Como se puede apreciar en la Tabla 3, actualmente se obtienen porcentajes de
preñez que oscilan entre 50 y 60%, esto es un 10% inferior a lo que generalmente se
logra con la transferencia de embriones sin criopreservar.
Desde el momento en que se demostró que la sucrosa podía ser utilizada para
retirar el crioprotector de los embriones (Leibo y Mazur, 1978), surgió la posibilidad de
diseñar una técnica de extracción que se adaptara al trabajo en condiciones de campo.
Para evitar que en la extracción del crioprotector el embrión esté en contacto con el medio
externo, Leibo (1982) y Renard y col. (1982), arribaron al denominado método "one step".
En el mismo, los embriones se transfieren a campo sin requerir equipos ni laboratorios
costosos; no obstante, al prescindir de la evaluación morfológica post-descongelación es
razonable esperar que los resultados de preñez sean inferiores. Para efectuar la
congelación, el embrión es acondicionado en el segmento medio de la pajuela, separado
por burbujas de aire de los extremos que contienen sucrosa en concentración isoosmolar
con la del medio de congelación (Leibo, 1982) o sucrosa en el segmento inferior y medio
B2 de Menezo en el superior (Renard y col., 1982).
Tabla 3: Resultados obtenidos con la transferencia de embriones congelados utilizando el

método estándar.
Embriones transferidos Receptoras preñadas Referencias

n n (%)
550 297 (54,0) Pettit (1985)
456 268 (58,8) Munar y col. (1988)
883 443 (50,1) Hill (1996)
455 214 (47,0) Dochi y col. (1998)
646 403 (62,3) Munar y col. (1998)
Método ''one step''
Al efectuar la descongelación, las soluciones se mezclan agitando la pajuela

vigorosamente para desplazar el aire hacia los extremos y permitir que las soluciones se
mezclen. La solución de sucrosa isoosmolar con el medio de congelación provoca que el
glicerol salga del embrión; de esta manera se extrae el crioprotector dentro del envase de
congelación. Chupin y col. (1984) compararon los resultados de preñez obtenidos con las
metodologías desarrolladas por Leibo (1982) y Renard y col., (1982) sin encontrar
diferencias significativas; sin embargo hubo una tendencia a mayor porcentaje de preñez
44,7% para la técnica de Renard contra un 38,5% de la propuesta por Leibo.
El método ''one step'' representa una gran ventaja práctica dado que posibilita
transferir embriones congelados a campo de manera similar a lo que ocurre con la
inseminación artificial. No obstante, cuando el glicerol es extraído dentro de la pajuela, la
viabilidad embrionaria puede ser afectada si no se logra una mezcla homogénea de las
distintas soluciones.
Los porcentajes de preñez que se logran con el método ''one step'' oscilan entre
25% y 40%, registrándose además una gran variabilidad (Tabla 4).
Tabla 4: Resultados obtenidos con la transferencia de embriones congelados utilizando el

método ''one-step''.

n n %
1259 327 25,9 Leibo (1984)
99 41 41,4 Chupin y col. (1984)
24 6 25,0 Cabodevila y col. (1992)
Método de transferencia directa
Considerando los inconvenientes del método anteriormente descrito, surgió la

necesidad de encontrar nuevas alternativas para la transferencia a campo. Actualmente,
el método de transferencia directa permite efectuar la transferencia prescindiendo de la
extracción del crioprotector. Existen dos variantes de este método, en una, el embrión es
expuesto a una solución de glicerol y sucrosa previo a la congelación. Ello provoca una
deshidratación extrema del embrión con una reducción de su volumen de alrededor del
40% al final del período de estabilización, lo que evita el shock osmótico post-
descongelación (Massip y col., 1987). En consecuencia, en estos embriones la
congelación lenta puede ser detenida antes (a -25°C) dado que no hay riesgos de
formación de cristales durante la congelación rápida. La sucrosa está involucrada en el
transporte activo de iones (Borland y col., 1976), mecanismo que es controlado por el
sistema Na+K+ATPasa, el que es inhibido por el glicerol. Por lo tanto, se considera que la
presencia de sucrosa en el medio de congelación permitiría a los embriones, reestablecer
el potencial de equilibrio químico durante la descongelación. Además, la sucrosa, al igual
que otros carbohidratos, preserva la integridad estructural y funcional de las membranas.
Esto explicaría los resultados beneficiosos obtenidos suplementando el medio de
congelación con un 20% de rafinosa (Richards y col., 1988).
En la otra variante del método de transferencia directa, se reemplaza el glicerol por
etilenglicol, crioprotector que tiene menor peso molecular que el glicerol y por lo tanto,
resulta más permeable con lo que provoca pequeños cambios de volumen celular. Al
momento de envasar el embrión, se incluyen dos columnas de PBSS en la pajuela para
facilitar la remoción del etilenglicol desde el embrión y disminuir la cantidad de
crioprotector transferida al útero de la receptora, permitiendo reducir efectos locales en el
ambiente uterino (Voelkel y Hu, 1992b).
En la Figura 3 se observa la posición del embrión y de la solución de congelación
en ambos protocolos de transferencia directa.
embrión
Massip y col. (1987) PBSS 1,36M G + 0,25M S PBSS

Voelkel y Hu (1992a) PBSS 1,5M EG PBSS
Fig 3. Disposición de las distintas soluciones en el interior de la pajuela en los protocolos

de transferencia directa; PBSS= solución buffer fosfato suplementada con suero o
albúmina sérica, G= glicerol, S= sucrosa, EG= etilenglicol
El método de transferencia directa en el que se utiliza etilenglicol (Cuadro 2) ha

dado resultados muy satisfactorios con porcentajes de preñez similares a los obtenidos
con el método estándar (Beal y col., 1998; Palma y col., 1998). Se obtuvieron mejores
resultados con mórulas compactas y blastocistos tempranos que con blastocistos y
blastocistos expandidos (Dochi y col., 1998; Munar y col., 1998). Suponiendo que ello se
debía a que los embriones de mayor número de células tenían mayor permeabilidad
relativa, en un reciente estudio se redujo el período de estabilización y se incorporó
sucrosa a la solución de etilenglicol. Con ello mejoró substancialmente el porcentaje de
preñez obtenido con los estadíos más avanzados (Munar y col., 1998).
Cuadro 2: Método de transferencia directa desarrollado por Voelkel y Hu (1992a)
Exposición de los embriones a 1,5M etilenglicol en PBSS, durante 10-20 minutos a

temperatura ambiente. Durante este período la pajuela debe ser lavada 3 veces
con la solución de congelación, antes de cargar el embrión.
Las pajuelas son colocadas directamente en el equipo de congelación enfriado
previamente a -7ºC.
3. Luego de dos minutos, se induce el ''seeding''.
4. La temperatura se mantiene a -7ºC, 8 minutos más.
La temperatura desciende hasta -30ºC a una velocidad de 0,3ºC/min. A esa temperatura
las pajuelas son sumergidas en nitrógeno líquido
La descongelación se efectúa colocando las pajuelas en un baño de agua a 30ºC
durante 10 segundos.
En la Tabla 5 se presentan resultados obtenidos empleando ambas variantes del

método de transferencia directa.
Tabla 5. Resultados obtenidos con la transferencia de embriones congelados utilizando el

método de transferencia directa

n n %
Glicerol + sucrosa
38 16 42,1 Massip y col. (1987)
4846 2352 48,5 Nibart y Humblot (1997)
Etilenglicol
550 285 51,8 Hill (1996)
1239 626 50,5 Nibart y Humblot (1997)
780 465 59,6 Beal y col. (1998)
418 187 44,7 Dochi y col. (1998)
1808 1016 56,2 Munar y col. (1998)
También se ha comparado para este método el uso de etilenglicol con el de

propilenglicol, ambos suplementados con distintas concentraciones de sucrosa. El mejor
resultado se obtuvo con el primer crioprotector, lográndose 51,4% y 12,2% de preñez
para mórulas y blastocistos congeladas con etilenglicol y propilenglicol, respectivamente
(Martinez y col., 1999).
Congelación de embriones producidos in vitro
La criopreservación de embriones producidos in vitro es una alternativa

sumamente interesante si se logran obtener resultados de preñez similares a aquellos
obtenidos con embriones producidos in vivo. Desde hace varios años se viene realizando
la congelación de embriones producidos in vitro y la transferencia de los mismos (Lu y
col., 1988 y1990; Goto y col., 1989; Fukuda y col., 1990; Reichenbach y col., 1990, 1991;
Suzuki y col., 1991; Wurth y col., 1994; Seregi y col., 1995; Hasler y col., 1995; Lazzari y
col., 1995; Agca y col., 1996; Reinders y van Wagtendonk-de Leeuw, 1996).
A pesar de la gran cantidad de trabajos realizados, los resultados del desarrollo in
vitro y los porcentajes de preñez luego de la transferencia de embriones congelados
producidos in vitro son menores a los obtenidos con embriones frescos. Diversos factores
serían responsables de tales resultados, entre ellos se encuentran características
morfológicas, bioquímicas y fisiológicas inherentes a los embriones producidos in vitro
(Shamsuddin y col., 1992; Greve y col, 1993; Leibo y Loskutoff, 1993; Pollard y Leibo,
1994; Massip y col., 1995a; Wright y Ellington, 1995; Wrenzycki y col., 1996; Thompson,
1997) las condiciones de cultivo (Rorie y col., 1990; Zhang y col., 1992; Massip y col.,
1993; Semple y col., 1995; Pugh y col., 1996 y 1998; Gomez y Diez, 1997; Lee y col.,
1997; Twagiramungu y col., 1997), el método de congelación utilizado (Mahmoudzadeh y
col., 1994; Hochi y col., 1996), el crioprotector (Voelkel y col., 1992b) el estadio de
desarrollo (Zhang y col., 1992 y 1993; Del Campo y col., 1993; Pavasuthipaisit y col.,
1993; Pollard y Leibo, 1993; Cseh y col., 1995; Dinnyés y col., 1995 y1996; Carvalho y
col., 1996; Pugh y col., 1998) y la edad del embrión (Del Campo y col., 1993; Suzuki,
1993; Takagi y col., 1994; Wurth y col., 1994; Cseh y col., 1995; Hasler y col., 1995;
Massip y col., 1995b; Myers y col., 1996).
A su vez, la suplementación de la solución utilizada para la congelación con
diferentes azúcares se ha utilizado en busca de una mayor supervivencia post-
descongelación, sin encontrarse efecto positivo en los mismos (Yang y col., 1997; Furnus
y col., 1997).
También se ha suplementado la solución de estabilización (1,5M de etilenglicol,
0,1M de sucrosa y suero fetal) utilizada para la congelación de blastocistos, con ácido
linoleico-albúmina sérica bovina (BSA) buscando una mayor tolerancia de las membranas
celulares a las bajas temperaturas, sin lograr un aumento en la proporción de blastocistos
que sobreviven y protruyen luego de la criopreservación (Okazaki y col., 1997). Sin
embargo, el mismo ácido linoleico-BSA fue utilizado durante el desarrollo in vitro de
blastocistos que posteriormente fueron congelados con etilenglicol como crioprotector,
observándose que el porcentaje de supervivencia post-descongelación fue mayor para
aquellos suplementados (Imai y col., 1997). También buscando estabilizar las membranas
se ha adicionado BSA o suero a los medios de congelación, observándose una
interacción entre el estadio de desarrollo y el tipo de suplementación, siendo mayor el
porcentaje de supervivencia cuando se congelan mórulas tempranas y blastocistos
tempranos en presencia de BSA (Pugh y col., 1998).
A pesar de todas las modificaciones que se han realizado tanto durante el desarrollo
in vitro de los embriones como durante las distintas etapas de la congelación, los
resultados de preñez obtenidos son muy variables oscilando entre 24% y 54%
(Reichenbach y col., 1991; Kajihara y col., 1992; Lee y col., 1997; Agca y col., 1998; Aller
y col., 1998 y 1999).
Congelación de embriones sometidos a micromanipulación
La congelación convencional se ha utilizado también en embriones sometidos a

micromanipulación ya sea para obtener algunas células y proceder a la identificación del
sexo previo a su transferencia o para producir mellizos idénticos. La supervivencia de
estos embriones luego de su congelación es menor que la de embriones intactos, esta
sensibilidad podría deberse a la perforación de la zona pelúcida y/o a la reducción del
número de células que sufren estos embriones (Lucas-Hahn y Niemann, 1991). Para
mejorar la tasa de supervivencia se implementaron distintas alternativas metodológicas,
tales como sellar el orificio practicado en la zona pelúcida cubriendo éste con una zona
pelúcida adicional o que el embrión micromanipulado sea embebido en agar, previniendo
así la pérdida de blastómeros adicionales, simplemente por una mejor protección física
durante el crecimiento de los cristales de hielo. También se ha intentado mejorar la
viabilidad de estos embriones realizando cultivos de los mismos en células epiteliales
oviductales (Schmidt y col., 1992a y b) o modificando los protocolos de congelación
mediante el agragado de polivinilpirrolidona (Suzuki y col., 1995). Los resultados
obtenidos han sido sin embargo muy variados (Lehn-Jensen y Willadsen, 1983; Rorie y
col., 1986; Picard y col.,1988; Lucas-Hahn y Niemann, 1991; Seike y col., 1991; Touati y
Ectors, 1991; Schmidt y col., 1992a y b).
Los porcentajes de preñez obtenidos luego de la transferencia de los embriones
manipulados generalmente no superan el 30% siendo a su vez muy variables según las
condiciones de cultivo utilizadas, la calidad embrionaria así como el protocolo de
congelación utilizado (Niemann y col., 1986; Chesne y col., 1987; Seike y col., 1991;
Touati y Ectors, 1991).
Vitrificación
La vitrificación es un proceso termodinámico mediante el cual un fluido incrementa su

viscosidad durante el enfriamiento, adquiriendo las propiedades de un sólido (Bautista y
Kanagawa, 1998). A diferencia de lo que ocurre durante la congelación, en la vitrificación no
se forman cristales sino que el fluido pasa a un estado sólido no estructurado similar al vidrio
de donde la técnica toma su denominación.
La vitrificación se utiliza desde hace años en la conservación de células, tejidos y
órganos, siendo más reciente su empleo en la conservación de embriones y ovocitos (Rall y
Fahy, 1985; Nakagata, 1989). En condiciones prácticas, la vitrificación se logra mediante la
inmersión directa en nitrógeno líquido. Esto representa una velocidad de enfriamiento de
aproximadamente 2500 ºC/min, resultando necesario el empleo de soluciones altamente
concentradas de uno o más crioprotectores permeables que pueden ser tóxicas para las
células (Palasz y Mapletoft 1996).
Teniendo en cuenta que la vitrificación es un proceso físico diferente al de la
congelación, es necesario definir con claridad, el significado de la terminología usada al
hacer referencia al tema. Cuando se habla de llevar nuevamente el material biológico
vitrificado a la temperatura ambiente de laboratorio se utiliza el término ''calentar'' y no
''descongelar''. Por otra parte, ''desvitrificación'' no significa, como parecería, salir del estado
de vitrificación para regresar a la temperatura óptima celular o corporal, sino que indica
pérdida del estado vítreo pasando al de cristalización, hecho indeseable que puede ser
incompatible con la viabilidad celular y/o embrionaria (Capdevielle, 1996).
En 1987, Massip y col. obtuvieron el nacimiento del primer ternero producto de la
transferencia de un embrión vitrificado. El protocolo original (Figura 4), resultó apto para
vitrificar mórulas compactas y blastocistos tempranos pero no, blastocistos. Prueba de ello es
que se obtuvieron 16 preñeces luego de la transferencia de 42 mórulas compactas y
blastocistos tempranos (38,1%) y ninguna después de la transferencia de 13 blastocistos
(Massip y col., 1989). El mismo grupo de investigadores logró, poco tiempo después, vitrificar
con éxito blastocistos, modificando el protocolo original. El período de exposición de los
embriones al medio de vitrificación intracelular fue duplicado y los embriones expuestos a
soluciones de glicerol, glicerol y sucrosa en PBSS antes de tomar contacto con el medio de
vitrificación extracelular, enfriado a 4ºC. De esta manera, se redujo la entrada del 1-2
propanodiol a los blastocistos y con ello, la toxicidad del medio de vitrificación. En este
trabajo, quedó demostrada una interacción entre estadio de desarrollo y protocolo utilizado
dado que, la variante introducida resultó apta para vitrificar blastocistos pero no estadios más
tempranos (Van der Zwalmen y col., 1989).
1. Exponer los embriones durante 10 min a temperatura ambiente (20°C), a una solución:
10% glicerol - 20% 1,2 propanodiol en PBSS (medio de vitrificación intracelular).
2. Pasar los embriones a una solución: 5% glicerol - 25% 1,2 propanodiol en PBSS (medio
de vitrificación extracelular).
3. Envasar en pajuelas de 0,25 ml de acuerdo al siguiente esquema:
a b c a a
3 cm 1 cm 7 cm
a) Solución extractora del crioprotector (1M sucrosa en PBS.)
b) Burbujas de aire (0,25cm)
c) Embrión en una gota del medio de vitrificación extracelular.
4.Sumergir inmediatamente la porción a-b de menor tamaño en el nitrógeno líquido y
luego progresivamente el resto de la pajuela.
5. Calentar en baño María a 20ºC.
6. Vaciar el contenido de la pajuela en una placa y esperar 10 min a 20ºC.
7. Lavar el embrión 1 a 3 veces en PBSS.
8. Transferir utilizando el método no quirúrgico.
Fig 4. Protocolo de vitrificación desarrollado por Massip y col. (1987)
En la última década, especialmente luego de la puesta a punto de sistemas de

producción in vitro de embriones, se han efectuado numerosos trabajos de investigación que
incluyeron pequeñas modificaciones al protocolo de vitrificación original y el desarrollo de
nuevos protocolos. Las innovaciones se basaron generalmente en incorporar distintas
asociaciones de crioprotectores de baja toxicidad al medio de vitrificación con el objetivo de
mejorar los resultados obtenidos hasta ese momento (Cabodevila y col., 1997). Una síntesis
consignando las modificaciones introducidas al método desarrollado por Massip y col.
(1987), el sistema de evaluación utilizado y los resultados obtenidos se presentan en el
Cuadro 3.
Cuadro 3: Modificaciones introducidas al protocolo de vitrificación desarrollado por Massip y
col. (1987), sistemas de evaluación y resultados.
Modificación principal Sistema de evaluación Referencias
Cultivo in vitro Transferencia

n % n %
Variación en temperatura y 35 57,1 l 14 50,0 + Van der Zwalmen y col.

tiempo de exposición de los (1989)
embriones a la solución de
vitrificación.
Extracción del crioprotector en 7 57,1 t 4 25,0 { Dobrinsky y col. (1991)

2 etapas.
Cambios en la configuración de 21 23,8 + de Leeuw y col., (1992)

la pajuela y transferencia
directa.
Reducción de la concentración 24 58,0 t Dobrinsky y col. (1992)
de sucrosa en el medio de
extracción del crioprotector.
Aumento del número de etapas 61 100 l 10 60,0 { Kuwayama y col. (1992)
en las que se efectúa la
exposición de los embriones a
la solución de vitrificación.
Reemplazo del 1-2 propanodiol nc 51,1 a Yang y col. (1992ª)

por etilenglicol. 80,8
Variación en temperatura y nc 87,0 b

Yang y col. (1992 )
tiempo de exposición de los
embriones a la solución de
vitrificación.
Reemplazo del 1-2 propanodiol 30 90,0 l 16 63,0 { Agca y col. (1994)

por etilenglicol. Variación en
temperatura y tiempo de
exposición de los embriones a
la solución de vitrificación.
Criterios de evaluación: t desarrollo hasta blastocisto; l reexpansión del blastocele; protrusión;
{
preñez diagnosticada mediante ultrasonografía entre los 35 y 60 días de gestación; + preñez
diagnosticada mediante palpación transrectal a los 60-90 días de gestación.
Referencia: nc: no consignado
De los nuevos protocolos surgidos debe mencionarse el de Rall (1992), quien utilizó
una solución de vitrificación que contenía glicerol, incorporado en 3 pasos de
concentraciones crecientes, como único crioprotector. Obtuvo un 66% de desarrollo en el
cultivo in vitro y 47% de preñez en las receptoras transferidas. Resultados similares -42,5%
de preñez- fueron informados por de Leeuw y col. (1992). El protocolo de Rall, (1992) ha sido
comparado con los métodos de congelación estándar y de transferencia directa, alcanzando
similares porcentajes de preñez (Van Wagtendonk y col.,1994) y de desarrollo en el cultivo
in vitro (Dinnyes y col., 1995).
Otros investigadores incorporaron distintos azúcares a la formulación del medio de
vitrificación (Tachikawa y col., 1993; Saito y col., 1994; Saha y col., 1995 y 1996b; Saha y
Suzuki, 1997). La presencia de azúcares tiene como objetivo reducir el efecto tóxico de los
crioprotectores permeables, promoviendo la deshidratación de los embriones por ósmosis
(Kasai y col., 1990). Además, las macromoléculas tienden a darle mayor estabilidad a las
soluciones de vitrificación (Fahy y col., 1984). En el Cuadro 4 se presenta una reseña de
cada protocolo incluyendo los resultados obtenidos.
Tachikawa y col. (1993), además de la solución de vitrificación descrita en el Cuadro 4,
utilizaron otra reemplazando el etilenglicol por glicerol. Diversas pérdidas registradas en
ambos casos, hicieron que solamente el 21% (6/28) de los embriones transferidos
(transferencia bilateral) resultaran en terneros nacidos vivos. Este protocolo fue utilizado para
vitrificar embriones producidos in vivo e in vitro (Mahmoudzadeh y col., 1993 y 1995). En el
último caso, se observó un incremento del 20% en la reexpansión del blastocele cuando la
vitrificación se efectuó en 2 etapas. Otra conclusión importante de estos trabajos fue que los
porcentajes de reexpansión y de protrusión en el cultivo in vitro no variaban si la extracción
de los crioprotectores se efectuaba en PBSS, sin sucrosa.
El efecto beneficioso de efectuar la vitrificación de los embriones producidos in vitro en
2 etapas fue corroborado posteriormente (Delval y col., 1996; Rodriguez, 1996; Ohboshi y
col., 1997 y 1998).
Otros autores han utilizado protocolos que contemplan la transferencia directa del
embrión, sin necesidad de retirarlo de la pajuela para efectuar la extracción del crioprotector
(Ishimori y col., 1993; Kuwayama y col., 1994). En el Cuadro 5 se presenta una reseña de
estos protocolos incluyendo los resultados obtenidos.
En un intento por mejorar la resistencia de los embriones producidos in vitro a la
vitrificación, se incorporó el factor de crecimiento IGF-I al medio de cultivo sin obtener
resultados exitosos (Willemsen y col., 1995).
Por otra parte, teniendo en cuenta que la exposición de los embriones a altas
concentraciones de crioprotectores y su posterior vitrificación pueden afectar el citoesqueleto
(Overstrom y col, 1993; Dobrinsky, 1996), se han utilizado estabilizadores de los
microfilamentos y microtúbulos que componen el mismo observándose un efecto beneficioso
en los embriones cultivados in vitro pero no en los transferidos (Dobrinsky y col., 1995).
Estos resultados, sumados a otros donde la transferencia de los embriones vitrificados
a receptoras sincronizadas se realizó con escaso éxito (Ostashko y col., 1992, Cutini y col.,
1998), demuestran la variabilidad que se registra aún con esta técnica. A pesar de ello, el
espectro de utilización de la vitrificación se amplía día a día siendo empleada en la
criopreservación de embriones ovinos (Martinez y col., 1996, Schiewe y col., 1991) y
porcinos (Dobrinsky y Johnson, 1993). También han sido vitrificados exitosamente ovocitos
bovinos destinados a ser fecundados in vitro (Hamano y col., 1992; Vajta y col., 1998) y
ovocitos en estado de pronúcleo, 15 horas post-fecundación in vitro (Saha y col., 1996a). En
la metodología desarrollada por Vajta se emplean velocidades de enfriamiento y
calentamiento extremas (más de 20.000 ºC/min), esto permite reducir el período de
exposición de los embriones a la solución de vitrificación a menos de 30 segundos. Según
Massip (1999), el futuro de esta metodología resulta promisorio teniendo en cuenta que un
25% de los ovocitos vitrificados alcanzó el estadio de blastocisto luego de la fecundación in
vitro y que permitió vitrificar exitosamente estadios tempranos de desarrollo embrionario.
Si bien generalmente las soluciones son suplementadas con suero o albúmina sérica,
se ha demostrado que tanto la congelación convencional como la vitrificación pueden
efectuarse en soluciones sin suplementación proteica (Palaz y col., 1986).
Cuadro 4. Protocolos que incluyen azúcares en la formulación del medio de vitrificación,

sistemas de evaluación y resultados.
Medio de
extracción del Resultados Referencias
Medio de vitrificación y Cultivo in vitro
crioprotector y Transferencia
tiempo de exposición
tiempo de n % n %
exposición
40% EG + 30%F + 0,5M S en 0,5 M en PBS: 1 nc 74-77l 10 80,0 Tachikawa y col. (1993)
PBS: 1 ó 2 min. ó 2 min.
a) 10% G + 0,125M S + 0,125M a) 0,5M S en 221 76,0 Saito y col. (1994)

D en PBSS: 5 min. PBSS: 5 min.
b) 10% G + 10% EG + 0,25M S b) 0,25M S en
+ 0,25M D en PBSS: 5 min. PBSS: 5min.
c) 20% G + 20% EG + 0,375M S
+ 0,375M Den PBSS: 1 min.
a) 10% G + 0,1M S + 0,1M X + a) 0,5M S en 129 79,0 Saito (1995)

1% PEG en PBSS: 5 min. PBSS: 5 min.
(Com Personal)
b) 10% G + 10% EG + 0,2M S + b) 0,25M S en
0,2M X + 2% PEG en PBSS: 5 PBSS: 5min.
min.
c) 20% G + 20% EG + 0,3M S +
0,3M X + 3% PEG en PBSS: 1
min.
a) 20% EG en PBSS: 3 min. PBSS con o sin 190 74,7l Mahmoudzadeh

b) 40% EG + 18% F+ 10% S en S: 5 min.
y col. (1995)
PBSS: 30-45 seg.
a) 10% G + 0,3M T en PBSS: 5 PBSS 172 35,4 Saha y col. (1995)

min.
b) 40% EG + 0,3M T + 20% PVP
en PBSS: 1 min.
Criterios de evaluación: l reexpansión del blastocele; protrusión; + preñez diagnosticada mediante
palpación a los 60-90 días post-transferencia bilateral.
Referencias: PBS= solución salina buffer fosfato; PBSS= solución salina buffer fosfato
suplementada; G= glicerol; EG= etilenglicol; F= ficol; D= dextrosa; PVP= polivinil pirrolidona; S=
sucrosa; T= trealosa; X= xilosa; PEG= polietilenglicol; nc: no consignado.
Cuadro 5. Protocolos de vitrificación que contemplan la transferencia directa de los
embriones
Medio de extracción
Medio de vitrificación y del crioprotector y Resultados Referencias
tiempo de exposición tiempo de exposición Cultivo in vitro Tranferencia
n % n %
25% G + 25% EG en 0,5M S en PBSS: 5 25 20{ Ishimori y
PBSS: 2 min. min. col. (1993)
a) 10% G en PBSS: 5 min. 0,5M S + 15% yema 30 73l 5 60{ Kuwayama y

b) 30% EG + 1M S en de huevo en PBSS: col. (1994)
PBSS: 30-40 seg. 5 min.
Criterios de evaluación lreexpansión del blastocele; {preñez diagnosticada por ultrasonografía a los
60 días de gestación; G=glicerol, EG=etilenglicol, S=sucrosa
Vitrificación de embriones sometidos a micromanipulación
El protocolo desarrollado por Massip y col. (1987) ha sido aplicado con éxito a la
vitrificación de embriones sometidos a micromanipulación, ya sea para la identificación del
sexo (Agca y col., 1995) o la producción de individuos idénticos (Massip y col., 1988). Por su
parte, el protocolo desarrollado por Vajta y col., (1998) fue aplicado exitosamente en la
vitrificación de embriones donantes de núcleo para efectuar clonación (Massip, 1999).
La transferencia de embriones vitrificados según lo descrito por Massip y col. (1987)
fue utilizada también para producir mellizos. Uno ó 2 embriones fueron transferidos
dependiendo si la receptora había sido o no inseminada previamente obteniéndose
resultados similares a los logrados con la transferencia de embriones congelados, utilizados
con el mismo fin (Agca y col., 1996).
Congelación ultrarrápida
Esta técnica fue desarrollada por Takeda y col. (1984), se asemeja a la vitrificación
(Figura 5), salvo que en la congelación ultrarrápida se produce cristalización del agua intra
y extracelular.
Temperatura
Estabilización
(ºC) 25
-9
“Seeding”
-30
Vitrificación (---)
Congelación ultrarrápida ( _ )
-196
15 25 Tiempo (min)
Fig 5. Tasas de enfriamiento utilizadas en la vitrificación y en la congelación ultrarrápida
de embriones.
Los embriones son deshidratados parcialmente y luego se los expone a una mezcla
compuesta por una solución 2 a 4,5M de un crioprotector permeable como el glicerol,
propanediol, DMSO o etilenglicol y 0,25 a 0,5M de un soluto extracelular no permeable
como la sucrosa, trealosa, lactosa o galactosa (Shaw y col, 1991; Rayos y col., 1992).
Esta segunda deshidratación, deja a los embriones en condiciones de ser enfriados
rápidamente. Las pajuelas son colocadas en el cuello del contenedor de nitrógeno líquido.
Existe un lugar óptimo para colocar la pajuela según el nivel de nitrógeno existente en el
contenedor, para que la cristalización ocurra espontáneamente sin producirse la elevación
de la temperatura relacionada con el cambio de fase. Las pajuelas, luego de permanecer
cinco minutos en el cuello del termo, son sumergidas en el nitrógeno. Al producirse la
congelación del agua extracelular durante el congelado rápido, la osmolaridad de la
solución de congelación aumenta, causando la pérdida de agua congelable de las células
embrionarias. No obstante, bajo estas condiciones la formación de hielo intracelular es
posible pudiendo ocurrir daño embrionario si se aplican posteriormente, tasas de
calentamiento inapropiados.
El método de congelación ultrarrápida ha sido utilizado exitosamente para congelar
embriones de animales de laboratorio (Takahashi y Kanagawa, 1990; Zuh y col., 1990).
En bovinos, se lo ha evaluado, cultivando los embriones descongelados y los resultados
obtenidos fueron dispares según el estadio de desarrollo del embrión congelado (Chupin,
1986). Buscando perfeccionar la técnica, se modificó el tiempo de exposición a la segunda
solución deshidratante a la vez que se varió la temperatura a la que ésta ocurría (Chupin,
1987). No obstante, las tasas de supervivencia obtenidas fueron de alrededor del 30%
(Niemann, 1991).
Esta técnica también ha sido aplicada en embriones producidos in vitro, variando las
concentraciones de crioprotectores y tratando de lograr la combinación óptima de los
mismos, lográndose porcentajes de protrusión de alrededor del 70% utilizando 1.5M de
glucosa y 0.25M de sucrosa (Huang y col., 1992)
Conclusiones
∗ La congelación convencional resulta la técnica de elección para la

criopreservación de embriones. Ha alcanzado gran aplicación práctica, especialmente a
partir del empleo del método de transferencia directa donde se utiliza etilenglicol como
crioprotector.
∗ La vitrificación y la congelación ultrarrápida de embriones aparecen como
opciones más simples y económicas que la congelación convencional, no obstante para
que tengan aplicación práctica será necesario superar los fenómenos de embriotoxicidad
que generalmente provocan.
∗ En las distintas técnicas de criopreservación se observan diferencias de viabilidad
de acuerdo al estadio de los embriones y al método utilizado, por lo tanto resulta de
interés realizar estudios tendientes a encontrar las condiciones óptimas para cada
situación.
∗ Teniendo en cuenta la evolución de la biotecnología de la reproducción, en
investigaciones futuras deberá prestarse especial atención a resolver los problemas que
se presentan actualmente con la criopreservación de embriones producidos in vitro o
sometidos a micromanipulación.
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and in vitro-produced preimplantation embryos from livestock species Theriogenology 44, 1167-
1189
Wrenzycki C, Herrmann D, Carnwath JW and H Niemann (1996) Expression of the gap junction
gene connexin43 (Cx43) in preimplantation bovine embryos derived in vitro or in vivo J Reprod
Fertil 108, 17-24
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produced bovine embryos following cryopreservation and single-embryo transfer Theriogenology
42,1275-1284
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frozen in ethylene glycol supplemented with sucrose or trehalose Theriogenology 47, 360
Zhang L, Barry DM, Denniston RS, Bunch TD and RA Godke (1992) Successful transfer of frozen-
thawed IVF-derived embryos Theriogenology 37, 331
Zhang L, Barry DM, Denniston RS, Bunch TD and RA Godke (1993) Birth of live calves after
transfer of frozen-thawed bovine embryos fertilized in vitro Vet Rec 132, 247-249
Zuh B, Wang G, Ma B and J Wang (1990) One step freezing of rabbit embryos Theriogenology 33,
196

Cap - 10 Criopreservación de Embriones Bovinos

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Criopreservación 149

CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES BOVINOS

Jorge Cabodevila &

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Método ''one step''

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Tabla 4: Resultados obtenidos con la transferencia de embriones congelados utilizando el

Embriones transferidos Receptoras preñadas Referencias

Considerando los inconvenientes del método anteriormente descrito, surgió la

Massip y col. (1987) PBSS 1,36M G + 0,25M S PBSS

Fig 3. Disposición de las distintas soluciones en el interior de la pajuela en los protocolos

El método de transferencia directa en el que se utiliza etilenglicol (Cuadro 2) ha

Cuadro 2: Método de transferencia directa desarrollado por Voelkel y Hu (1992a)

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Tabla 5. Resultados obtenidos con la transferencia de embriones congelados utilizando el

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En la última década, especialmente luego de la puesta a punto de sistemas de

Modificación principal Sistema de evaluación Referencias

Cultivo in vitro Transferencia

Variación en temperatura y 35 57,1 l 14 50,0 + Van der Zwalmen y col.

Extracción del crioprotector en 7 57,1 t 4 25,0 { Dobrinsky y col. (1991)

Cambios en la configuración de 21 23,8 + de Leeuw y col., (1992)

Reemplazo del 1-2 propanodiol nc 51,1 a Yang y col. (1992ª)

Variación en temperatura y nc 87,0 b

Reemplazo del 1-2 propanodiol 30 90,0 l 16 63,0 { Agca y col. (1994)

Cuadro 4. Protocolos que incluyen azúcares en la formulación del medio de vitrificación,

a) 10% G + 0,125M S + 0,125M a) 0,5M S en 221 76,0 Saito y col. (1994)

a) 10% G + 0,1M S + 0,1M X + a) 0,5M S en 129 79,0 Saito (1995)

a) 20% EG en PBSS: 3 min. PBSS con o sin 190 74,7l Mahmoudzadeh

a) 10% G + 0,3M T en PBSS: 5 PBSS 172 35,4 Saha y col. (1995)

a) 10% G en PBSS: 5 min. 0,5M S + 15% yema 30 73l 5 60{ Kuwayama y

Vitrificación de embriones sometidos a micromanipulación

∗ La congelación convencional resulta la técnica de elección para la

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