Facultad de Ciencias

Departamento de Química y Farmacia

Análisis de resultados
“Proteínas”
Informe de Laboratorio
Bioquímica
2018

Introducción
Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos, los que están
unidos mediante enlaces peptídicos entre el grupo amino de un aminoácido y el grupo carboxilo de
otro aminoácido. Las proteínas pueden tener distinto número y composición de aminoácidos,
generando moléculas de distinto tamaño, propiedades ácido-base, y solubilidades diferentes.
La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales denominados:
estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. La desnaturalización consiste en la pérdida
de todas las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), lo cual se puede dar
por cambios de pH, alteraciones de la concentración, agitación molecular o variaciones bruscas de
temperatura. El efecto más visible de este fenómeno es que se produce una disminución drástica de
la solubilidad de la proteína, acompañada frecuentemente de precipitación, además de la pérdida de
todas sus funciones biológicas. La desnaturalización puede ser reversible (renaturalización) pero en
muchos casos es irreversible. [1]
La cuantificación exacta de proteínas es esencial para todos los experimentos relacionados con
proteínas en una multitud de temas de investigación, existen varios métodos para la determinación
de proteínas y estos se basan principalmente en reacciones químicas del grupo arilo o alquilo de los
aminoácidos. La reacción del Biuret es una reacción coloreada (violeta) debido a la formación del
complejo Cu en un medio alcalino con compuestos que poseen grupos -CO-NH, el método de Biuret
es la técnica más simple para la determinación de las proteínas solubles. Las sustancias que poseen
2 o más enlaces peptídicos forman un complejo coloreado púrpura con sales de cobre alcalinas. El
desarrollo del color es diferente para cada proteína. La cantidad de color violeta es directamente
proporcional a la concentración de proteínas. [2]
La electroforesis de proteínas es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica
controlada con la finalidad de separar proteínas según su tamaño y carga eléctrica a través de una
matriz. Se realiza sobre un soporte sólido o semisólido, para minimizar efectos de difusión. La
dirección de la migración de las moléculas depende del pH de la solución y del punto isoeléctrico de
la proteína, en tanto que el grado de desplazamiento depende de la carga eléctrica de cada proteína
y con menor importancia, de otros factores como la diferencia de potencial, el peso molecular, el
tamaño de la molécula, la conductividad del medio y el tipo de soporte. Terminada la carrera
electroforética, las proteínas se tiñen con un colorante adecuado, como, por ejemplo, el Azul de
Coomassie. [3] Y se puede determinar el peso molecular a través de la curva de calibración.
En el presente informe se analizarán los resultados obtenidos en 3 laboratorios, en la cuantificación
de proteínas utilizando el método de Biuret (laboratorio 1), en la evaluación de propiedades de las
proteínas (laboratorio 2) y en la extracción y electroforesis de proteínas (laboratorio 3).

Hipótesis 1
Es posible determinar la concentración de proteínas de una muestra de albúmina utilizando el
método de Biuret.
Hipótesis 2
Es posible analizar e interpretar los resultados obtenidos en la evaluación de las propiedades de las
proteínas y sus posibles causas de manera correcta.
Hipótesis 3
Es posible extraer proteínas desde un trozo de carne y obtener una estimación de la masa molecular
de las proteínas del trozo de carne y la albúmina empleando SDS-PAGE.

Objetivos generales.
● Determinar la concentración de proteínas de una muestra problema por el método de Biuret.
● Evaluar propiedades de las proteínas en los distintos experimentos y su posterior interpretación.
● Extraer proteínas desde un trozo de carne y determinar masa molecular de las proteínas
empleando SDS-PAGE.
Objetivos específicos.
● Graficar la curva de calibración para la determinación del peso molecular de las proteínas
● Evaluar tratamiento de una solución de proteínas con ácido
● Evaluar actividad de la amilasa salival
● Realizar Test de Ninhidrina e interpretar resultados.

Materiales

Tubos de ensayo - tubos eppendorf – vaso precipitado - micropipeta – pipetas – mortero –

cubeta - reactivo de biuret – albumina - agua destilada – leche - ácido acético glacial -
almidón – lugol – ninhidrina – seroalbúmina – aminoácidos – amilasa salival – salchicha –
PBS – sistema de electroforesis

Métodos

Laboratorio 1: Cuantificación de proteínas

Se preparó una batería de tubos que incluyó el blanco colorimétrico y los tubos patrones que
contenían alícuotas de la solución patrón. Cada tubo contenía las siguientes soluciones:
Blanco: 1ml de agua destilada y 4ml de reactivo de biuret
Tubo 1: 0,2ml de albumina - 0,8 de agua destilada y 4ml de reactivo de biuret
Tubo 2: 0,4ml de albumina - 0,6 de agua destilada y 4ml de reactivo de biuret
Tubo 3: 0,6ml de albumina - 0,4 de agua destilada y 4 ml de reactivo de biuret
Tubo 4: 0,8ml de albumina - 0,2 de agua destilada y 4ml de reactivo de biuret
Tubo 5: 1ml de albumina - y 4ml de reactivo de biuret
Muestra problema: 1ml de suero y 4ml de reactivo de biuret
Luego se procedió a mezclar e incubar por 10min a 37°C y se leyó la absorbancia a 540nm. La
muestra se rotuló y guardó a -20ºC ya que se utilizó para la actividad de electroforesis de proteínas.

Laboratorio 2: Propiedades de las proteínas:

1. Tratamiento de una solución de proteínas con ácido:
Se colocó en un tubo de ensayo 2 ml de leche junto con 2 ml de ácido acético glacial, se mezcló y
se observó lo ocurrido.
2.-Actividad amilasa salival.:
En un vaso precipitado se agregó 5 ml de saliva, luego se rotuló 3 tubos de ensayo:
Tubo 1: Se agregó 0,5 ml de la solución de almidón + 0,5 ml de saliva, se incubo a 37°C por 10 min.
Luego se le agrego 1 ml de Lugol.
Tubo 2: Se coloco 0,5 ml de la solución de almidón + 0,5 ml de saliva, se incubo a 100°C por 10
min, se esperó a que enfríe y se vertió 1 ml de Lugol.
Tubo 3: Se vertió 0,5 ml de la solución de almidón + 0,5 ml de agua, se calentó a 37°C por 10 min.
Y se agregó 1 ml de Lugol.
3- Reconocimientos de aminoácidos: Test de Ninhidrina
Para comenzar se rotularon tres tubos de ensayo:
Tubo 1: Se le agregó 1 mL de agua + 1 mL de reactivo de Ninhidrina
Tubo 2: Se le agrego 1 mL de solución de aminoácidos + 1 mL de reactivo de Ninhidrina.
Tubo 3: Se le agregó 1 mL de solución de seroalbúmina+ 1 mL de reactivo de Ninhidrina.
Posteriormente se calentó en baño de agua a ebullición por 10 min dos tubos y se esperó a que
enfríen.

Laboratorio 3: Extracción y electroforesis de proteínas

Se colocó en un mortero un trozo de salchicha helada, se homogeneizó con el vástago hasta
disgregar el tejido agregándole PBS hasta que la muestra quedó liquida, seguidamente se tomó el
extracto liquido con una micropipeta, se procedió a centrifugar durante 15min a 14.000 rpm a una
temperatura de 4°C, finalmente se colocó el sobrenadante en un tubo de 1,5ml y se conservó en
hielo para posteriormente realizar la electroforesis.

Resultados y discusión

Laboratorio 1:

Cuantificacion de proteinas
0.6 y = 0.0846x - 0.0589
R² = 0.9772
0.5
absrobancia 540nm

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7
concentracion (mL)

Grafico N°1: curva de calibración. En el que se indica la relación entre absorbancia y

concentraciones, en donde: 1) blanco, 2) tubo 1, 3) tubo 2, 4) tubo 3, 5) tubo 4, 6) tubo 5 y 7) muestra
problema.
Concentración de la muestra problema: 0,707 mL
En cuanto al gráfico Nº1, la R resultó de 0,9772, lo cual indicaría que los datos o valores de
absorbancia están correctos y esto se puede confirmar al ver la gráfica y observar que mientras
más cercanos estén los puntos graficados a la recta menos impurezas contienen en este caso las
soluciones.

Para cuantificar las proteínas se hizo uso del método de biuret. Dos cadenas peptídicas forman un
complejo con el cobre. El reactivo de biuret está compuesto de hidróxido de potasio, sulfato cúprico
y tartrato de sodio y potasio. El que va a reaccionar directamente es el sulfato de cobre,
específicamente el cobre y se va a formar el complejo de color púrpura o azul dependiendo de la
concentración de proteínas, los demás reactivos que contiene el reactivo de biuret son para
mantener el pH, en este caso básico, para que ocurra la reacción.

Laboratorio 2
1) Tratamiento de una solución de proteínas con ácido: Al agregar a la leche el ácido acético,
se produjo coagulación, esto debido a que el ácido acético disminuye el pH de la leche y esto
afecta la solubilidad de la caseína. La caseína cuando está soluble se encuentra en forma de
miscelas [4] y al disminuir el pH se desestabiliza la miscela, por lo tanto, se produce la
aglomeración y esto se debe a la disminución de su carga isoeléctrica hasta llegar a la del punto
isoeléctrico. Al mismo tiempo, el calcio y el fósforo orgánicos contenidos en la miscela se van
volviendo solubles en la fase acuosa debido a la acidez del medio y las cadenas polipeptídicas de
la caseína que estabilizan la miscela pierden la capacidad de estar unidas a estas miscelas,
desintegrándose y la caseína precipita formando coágulos.
2) Actividad amilasa salival: La amilasa salival degrada el almidón catalizando la hidrólisis de los
enlaces o-glicosídicos del α(1,4). La función del lugol en este experimento es reconocer el
polisacárido. Los átomos de yodo se introducen en los espirales de amilosa del almidón formando
un complejo que será de color azul. [5]
- Tubo 1: Al mezclar la saliva con el almidón lo incubamos a 37º C que es la temperatura fisiológica
de nuestro organismo, por lo tanto, la amilasa salival debiera actuar de manera óptima y degradar
el almidón, entonces ya no quedará almidón disponible para formar el complejo con el lugol y en
consecuencia la solución se ve transparente.
- Tubo 2: En este caso se incuba a 100º C y, por lo tanto, la enzima debiera desnaturalizarse,
perdiendo sus estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria, por esta razón la solución se ve de
color azul, ya que, la enzima no puede degradar el almidón, entonces, el almidón sigue íntegro
para que forme un complejo con el lugol y se vea de color azul. En la realización de este
experimento, la solución no presentó color azul, sino que transparente, esto puede deberse a que
la enzima alcanzó a degradar cierto almidón, ya que, no se puso el tubo inmediatamente a 100ºC,
sino que se procedió a realizar los demás experimentos
- Tubo 3: Si bien este último tubo está en las mismas condiciones que el primero, esta no contiene
saliva, por lo tanto, no contiene la amilasa salival, debido a esto, el almidón forma el complejo con
el lugol y la solución se ve de color azul.
3) Test de Ninhidrina: La ninhidrina reacciona con el aminoácido formando un intermediario, este
descarboxila y deshidrata para dar un ión dipolar, este ión hidroliza dando la amina. Finalmente, la
amina condensa con otra molécula de ninhidrina para dar el Púrpura de Ruhemann. [6]
- Tubo 1: El agua al no tener grupo amino, la ninhidrina no lo reconoce, por lo que, no hay reacción
y la solución se ve de color transparente.
- Tubo 2: En este caso la ninhidrina reacciona con el aminoácido, dando como resultado el color
azul en la solución.
- Tubo 3: La ninhidrina reacciona con los aminoácidos de la seroalbúmina, obteniendo así el color
azul en la solución.

Laboratorio 3

Figura 1: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia

de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). En donde, M:
marcador de peso molecular (kDa). ALB: Albúmina (1
mg/mL). CARNE: proteínas extraídas de salchicha.

En relación con la figura 1, la albúmina presenta un peso

molecular el cual no se puede apreciar bien, pero está
situada entre 66 a 97 kDa, y teóricamente la albúmina pesa
aproximadamente 68 kDa. Para obtener un resultado más
preciso se podría cargar un marcador que tenga una mayor
cantidad de bandas.
En cuanto a la extracción de la carne, esta contiene muchos
tipos de proteínas, por lo tanto, se observa muchas bandas
con distintos pesos moleculares, las bandas que se ven más intensas indican que hay una mayor
concentración de proteínas que las demás, entre las cuales, una banda posee un peso entre 45 a
66 kDa y la otra banda tiene un peso mayor a 97 kDa.

Conclusiones

En síntesis, en el laboratorio 1 de cuantificación de proteínas, se logró determinar correctamente la

concentración de proteínas, empleando el método de biuret, el cual dicha concentración resultó de
0,707 el cual fue obtenido mediante la realización de la curva de calibración. En el caso del
laboratorio 2 de propiedades de las proteínas se analizó e interpretó los resultados obtenidos en
cada experimento, y se identificó las posibles causas de manera correcta. Los experimentos se
realizaron eficazmente, por lo que, la mayoría no presentó problemas en su resultado, a excepción
de la actividad de la amilasa salival, en la que en el tubo 2 la solución presentó un color
transparente en vez de azul, esto debido por un descuido personal, en el que no se incubó el tubo
inmediatamente a 100ºC. Y finalmente en el laboratorio 3 fue posible extraer proteínas desde un
trozo de carne, en este caso, de salchicha y obtener una estimación de la masa molecular de las
proteínas del trozo de carne y además de la albúmina empleando SDS-PAGE, resultando pesos
moleculares cercanos al valor real en el caso de la albúmina y como en el trozo de carne no se
puede identificar cuáles son todas las proteínas resultantes, se hizo una estimación de aquellas
que estaban más concentradas. En conclusión, el análisis de resultados se llevó de manera eficaz,
llevando a cabo la interpretación de todos los experimentos realizados en el laboratorio, y las
hipótesis establecidas al comienzo de este informe se comprueban.

Referencias

[1].- Voet, D., Voet, J. G., & Pratt, C. W. (2007). Fundamentos De Bioquímica. Ed. Médica
Panamericana.

[2] Stoscheck, C.M. (1990). Cuantificación de proteínas. Métodos en Enzimología 182: paginas. 50-
69.

[3] .- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G.M., Carnemolla, B.,
Orecchia, P., Zardi, L. y Righetti, P.G. (2004). «Plata azul: una coloración coloidal muy sensible de
Coomassie G-250 para el análisis del proteoma.». Electroforesis, 25 (9): paginas .1327 - 1333.

[4] .- Williamson MB. 1944. La composición de aminoácidos de las proteínas de la leche humana.
Revista de química biológica 156 (1): páginas 47 - 52.

[5] .- Ramasubbu, N .; Paloth, V .; Luo, Y .; Brayer, G. D .; Levine, M. J. (1996). «Estructura de la α-

amilasa salival humana a 1.6 Å Resolución: implicaciones para su papel en la cavidad oral». Acta
Crystallographica Sección D Cristalografía Biológica 52 (3): paginas 435-446.

[6]Gonzáles Rodriguez, Lucia . Manual de Laboratorio Bioquímica I. Facultad de Medicina

Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia. Bogotá 1997.