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net/publication/256247114
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Jean-Marie Perrier-Cornet
University of Burgundy
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All content following this page was uploaded by Jean-Marie Perrier-Cornet on 20 May 2014.
THÈSE
présentée pour obtenir le titre de
Docteur de l'Université de Bourgogne
Génie des Procédés
M. GOMA G. Rapporteur
M. PETITET J.P. Rapporteur
M. BALNY C. Examinateur
M. ENGASSER J.M. Examinateur
M. GERVAIS P. Examinateur
lle
M SIMATOS D. Examinateur
M. TRAITLER Examinateur
à Antoine et à Lucien
REMERCIEMENTS
Je remercie les membres du jury qui ont bien voulu lire et juger ce travail :
M. BALNY C., Professeur à l'INSERM (unité 128) de Montpellier,
M. ENGASSER J.M., Professeur à l'INPL de Nancy,
M. GOMA G., Professeur à l'INSA de Toulouse,
M. PETITET J.P., Directeur CNRS au LIMHP de Villetaneuse,
Mlle SIMATOS D., Professeur à l'ENSBANA de Dijon,
M. TRAITLER, Responsable Génie Industriel Alimentaire chez Nestlé.
J'associe à ces remerciements tous les collègues et étudiants du laboratoire qui ont
contribué à ce travail et particulièrement Laurent BENEY, Christine EVRARD, Pierre-
André MARECHAL, Inigo MARTINEZ DE MARAÑON et Olivier VITRAC.
Je remercie enfin ma tante et mon épouse pour leur participation acharnée et leur
compréhension.
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 7
MATERIELS ET METHODES 77
BIBLIOGRAPHIE 210
ANNEXES
Table des symboles
SYMBOLES PRINCIPAUX
a coefficient d’activité
b volume non osmotique (m3)
c concentration (mole/ m3)
n nombre de moles
t temps (s)
x fraction molaire
INDICES ET EXPOSANTS
i espèce chimique dont la concentration varie
j espèce chimique dont la concentration reste constante
o état standard
s espèce chimique diffusant au travers de la membrane
w eau
SI soluté intracellulaire
SE soluté extracellulaire
ABREVIATIONS
ADN acide désoxyribonucléique
ATP adénosine tri-phosphate
CIP presse isostatique froide (température ambiante)
CSP protéines induites par un choc thermique négatif
DAC cellule à enclumes de diamant
FTIR spectroscopie infrarouge utilisant la transformation de Fourier
HIP Presse isostatique haute température (température supérieure à 100 °C)
HSP Protéines induites par un choc thermique positif
IR rayonnement infrarouge
LC liquide cristallin
LGPAB laboratoire de génie des procédés alimentaires et biotechnologiques
LIMHP laboratoire d'ingénierie des matériaux et des hautes pressions
Unité CNRS, Université Paris XIII
RMN résonance magnétique nucléaire
SEM microscope électronique à balayage
TEM microscope électronique à transmission
UFC unité formant colonie
UV ultraviolet
WIP presse isostatique chauffée (Warm Isostatic Press)
INTRODUCTION
L'intérêt des hautes pressions pour la biologie et les sciences alimentaires a débuté à la
fin du siècle dernier conjointement à l'essor des techniques hyperbares et à la
découverte de microorganismes au fond des fosses océaniques.
En 1882, la découverte, par l'expédition Talisman, d'organismes vivants à des
profondeurs de 6000 m a amorcé ce qui allait devenir la barobiologie. Quelques
années plus tard, ont été consignées en France les premières observations concernant
l'effet de pressions élevées sur l'action des microorganismes. CERTES (1884), puis
REGNARD (1891) ont publié des articles dans les comptes rendus de l'Académie des
Sciences et de la Société de Biologie de Paris (JOHNSON et EYRING 1970).
En 1899, aux États-Unis, HITE fut le premier auteur à montrer l'intérêt des hautes
pressions pour augmenter la durée de conservation d'aliments, particulièrement du lait
et des jus de fruits (HITE 1899). Il fit construire pour ces expériences des presses
capables de dépasser des pressions de 400 MPa. Il montra non seulement qu'il était
possible de préserver des produits alimentaires pendant plusieurs semaines grâce à
l'application de hautes pressions, mais aussi que cette préservation dépendait du
triplet : niveau de pression, temps d'application et température. De plus, la putréfaction
des aliments pressurisés faisait apparaître une faune microbienne inhabituelle.
Malgré les résultats encourageants obtenus par HITE, cette direction fut délaissée par
les chercheurs.
Jusqu'à 1950, ce domaine a cependant connu un large développement scientifique sans
retombées industrielles immédiates au niveau alimentaire. Les travaux s'orientèrent
plutôt vers la destruction de tous les germes en vue d'une stérilisation de produits
médicaux. En 1918, LARSON montra qu'une pression de 1200 MPa était insuffisante
pour inactiver la totalité des spores de Bacillus subtilis (LARSON et al. 1918). A partir
de 1932, les travaux des chercheurs français BASSET et MACHEBOEUF ont permis de
recenser les pressions d'inactivation de nombreux microorganismes et toxines jusqu'à
1780 MPa (BASSET et MACHEBOEUF 1932). D'autres travaux se sont intéressés à
l'évolution des molécules biologiques sous pression et en 1914, BRIDGMAN montre que
le blanc d'oeuf coagule sous pression (BRIDGMAN 1914).
INTRODUCTION 1
Dans les années 1950, les études se sont recentrées sur la physiologie et le
métabolisme des microorganismes marins ou non à des pressions modérément élevées
(< 200 MPa) (OPPENHEIMER et ZOBELL 1952). A la même époque se développent les
premières études sur la biochimie des protéines et enzymes sous pression (LAIDLER
1950).
Néanmoins, l'utilisation des hautes pressions pour la "pasteurisation" de produits
alimentaires est rare. En 1965, TIMSON et SHORT ont appliqué des hautes pressions
(jusqu'à 1 GPa) sur du lait, identifiant les microorganismes survivants (TIMSON et
SHORT 1965). Cette étude inclut des traitements avec passage dans les différentes
phases solides de l'eau. La baroprotection conférée par des additifs est aussi explorée.
Dans le même temps, des expériences ont été poursuivies sur le comportement des
spores bactériennes sous pression (GOULD et SALE 1972).
Toutefois, depuis une dizaine d'années, le développement des techniques, l'attraction
des marchés agroalimentaire et médical ont dynamisé, par l'intermédiaire du Japon, un
domaine resté jusqu'alors confidentiel.
Sous l'impulsion du Professeur HAYASHI, une collaboration entre l'industrie et la
recherche a permis, au Japon, de produire un travail scientifique considérable et varié,
mais aussi de commercialiser un certain nombre de produits (jus de fruits, compotes,
desserts) sur le marché japonais.
L'application d'une haute pression hydrostatique est notamment capable d'inactiver les
microorganismes. Cependant, comme pour la destruction par effet thermique, les
mécanismes cellulaires impliqués sont encore mal connus. La facilité de mise en
oeuvre des traitements thermiques et le développement de procédés de stérilisation
rapide (UHT, "flash pasteurisation") ont rendu inutile l'identification des cibles
cellulaires de la chaleur pour une optimisation de traitement. Par contre, le coût et la
difficulté technique liés au matériel haute pression freinent le développement
d'applications industrielles, car la résistance de certaines souches microbiennes et
particulièrement des spores implique des niveaux de pression élevés (> 800 MPa) ou
des temps de traitement très longs. La compréhension des phénomènes liés à
l'inactivation des microorganismes et particulièrement les cas d'extrême barorésistance
(milieux concentrés ou déshydratés, formes microbiennes sporulées) devrait en
permettre d'envisager une optimisation du procédé par une réduction des temps de
traitement ou des niveaux de pression.
2 INTRODUCTION
Afin de mettre en évidence et de comprendre les modifications des microorganismes
engendrées par les hautes pressions, de nombreuses expérimentations ont été mises en
oeuvre. Cependant, le nombre de méthodes d'investigation in situ sous pression étant
réduit, les observations sont généralement faites après retour à pression
atmosphérique.
Dans ce cas, la seule variable prise en compte est la viabilité cellulaire. Les conditions
de milieu ou de traitement permettent de mesurer la sensibilité des microorganismes et
les modalités de leur destruction.
L'importance de différents paramètres a ainsi été mise en évidence : temps de séjour
sous pression, température, activité de l'eau du milieu, … Cependant, la description de
la cinétique de l'inactivation microbienne pour chaque paramètre exige un grand
nombre d'expérimentations. De plus, l'importance des phases transitoires d'élévation
de la pression et de détente sont rarement prises en compte.
D'autres investigations ont lieu en continu, mais uniquement sur une activité
enzymatique cellulaire spécifique.
La plupart de ces expériences sont en outre réalisées in vitro sur des systèmes modèles
(enzymes, liposomes). Les résultats obtenus apportent des informations importantes
sur la résistance des systèmes enzymatiques et sur les modifications structurales des
biomolécules. Cependant, leur transposition aux systèmes cellulaires reste difficile, la
cellule constituant un milieu complexe avec de nombreuses interactions entre chaque
composant. Certains microorganismes sont capables de survivre à des niveaux de
pression où la plupart de leurs protéines sont dénaturées in vitro.
Il n'existe pas à ces niveaux (> 200 MPa) d'approche directe et globale de l'évolution
cellulaire au cours du traitement. L'observation microscopique couplée à un système
d'analyse d'images est utilisée depuis longtemps par le laboratoire de Génie des
Procédés Alimentaires et Biotechnologiques de l'ENSBANA de Dijon. Elle permet,
par le suivi du volume cellulaire, une description de la réaction thermodynamique et
physiologique des cellules soumises à différents stress physico-chimiques : chocs
osmotiques, température, pH. Ces études ont permis de mettre en évidence
l'importance des variations de volume sur la viabilité cellulaire, notamment l'influence
de la cinétique d'application de ces stress.
Pour mettre en oeuvre des techniques similaires avec la pression hydrostatique, une
cellule permettant la visualisation sous haute pression a été développée en
INTRODUCTION 3
collaboration avec le laboratoire d'Ingénierie des Matériaux et des Hautes Pressions,
unité CNRS, Université Paris XIII.
L'observation de levures avec cette cellule a demandé une mise au point difficile.
L'objectif de cette thèse est de montrer la faisabilité technique et l'intérêt d'une
approche microscopique dans la compréhension des mécanismes cellulaires induits par
hautes pressions.
L'étude bibliographique des aspects thermodynamiques et biologiques des hautes
pressions permet de faire le point sur les connaissances actuelles dans ces domaines et
fournit des bases pour l'interprétation des phénomènes morphologiques observés.
Dans un premier temps, sont détaillées les mises au point de la cellule de visualisation
et du système de mesure du volume qui y est rattaché. Un étalonnage de la mesure
ainsi obtenue sera réalisé.
Dans un second temps, l'observation microscopique de cellules de levures, de cellules
sanguines humaines et de liposomes sous pression est effectuée. Les conditions de
traitement sont déterminées préalablement par des analyses de la viabilité finale de
cellules de levures.
La cellule vivante étant un système ouvert, la variation du volume cellulaire peut être
reliée à la compression du contenu intracellulaire et/ou aux transferts de masse.
L'analyse de ces variations permet d'approcher les perturbations hydrostatiques
responsables des transferts et de différencier les types de cellules selon leur
comportement morphologique. Ce travail doit contribuer à une meilleure
compréhension des mécanismes d'inactivation par haute pression et permettre
d'envisager une optimisation des procédés de pasteurisation UHP (Ultra Haute
Pression).
Ce travail a fait l'objet de deux publications (PERRIER-CORNET et al. 1995a; PERRIER-
CORNET et al. 1995b), une troisième, concernant les liposomes est en préparation.
4 INTRODUCTION
Note : Dans la langue française compression signifie "action et résultat de l'application
d'une force pressante". L'utilisation de ce terme conduit à de nombreuses ambiguïtés.
Nous avons donc distingué trois emplois différents et défini une expression pour
chacun d'eux :
INTRODUCTION 5
6 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Si la force n'est pas uniformément répartie, une surface élémentaire dS peut être
définie, sur laquelle agit F tel que F F . L'expression de la pression sera
S
alors :
F
P (2)
dS
Cette pression est exprimée dans le système international en pascal (Pa), avec
1 Pa = 1 N.m-2. De nombreuses autres unités de pression ont été et sont encore
utilisées, quelques unes ainsi que leur facteur de conversion ont été repris dans le
Tableau 1. Cependant pour des raisons de cohérence, nous utiliserons uniquement le
pascal ou plutôt ses multiples, le mégapascal (MPa) avec 1 MPa = 106 Pa et le
gigapascal (GPa) avec 1 GPa = 103 MPa = 109 Pa.
M
dz
dx
dy y
Cette équation donne une augmentation de pression de 0,98 MPa pour une hauteur
d'eau d'environ 100 m.
Remarquons que la force exercée sur la surface dS n'est perpendiculaire à cette surface
que si le fluide est parfait. Dans le cas de fluide réel, peuvent s'ajouter des contraintes
de cisaillement dues à la viscosité du fluide. Cependant, à l'équilibre, ces contraintes
s'annulent en l'absence de mouvement et permettent de ne considérer que des forces
pressantes.
Le volume (ou densité) est la variable conjuguée de la pression. Cette relation apparaît
dans les différentes équations d’état, dont la plus simple est celle des gaz parfaits :
( PV ) T RT (5)
Cette équation d'état est la seule pour laquelle des règles de mélange sont
rigoureusement définies. Du fait de la difficulté à estimer les coefficients du viriel, des
équations empiriques ont été développées dont le prototype est l'équation de VAN DER
WAALS (ABBOTT et VAN NESS 1992) :
PV V a
(7)
nRT V b RTV
où a et b sont des coefficients positifs, b est appelé covolume et le terme a/V² est
défini comme la pression de cohésion.
Pour les liquides, des équations empiriques plus complexes ont été définies, dont la
plus connue et la plus utilisée est celle proposée par Tait (TAIT 1888) :
V B P
C.ln (8)
V0 B P0
où C et B sont des constantes positives,
V=V-V0 est la différence de volume due à la variation de pression de P0 à P.
Ces équations empiriques ne sont satisfaisantes que sur une plage limitée de pressions.
En effet, dans le cas d'une pression suffisamment élevée, le volume calculé à partir de
ces équations est négatif.
dTC VC
TC ( 10 )
dP H C
où TC représente la température de changement d’état (en °K),
HC et VC sont respectivement les variations d'enthalpie (en J.mol-1) et de
volume (m3.mol-1) relatives au changement d’état considéré.
Lors d’une fusion par exemple, HF et VF sont généralement positifs et une élévation
de pression entraîne une augmentation de température. Pour des composés organiques,
la variation de température est d'environ 15°C pour 100 MPa (HEREMANS 1995).
L’eau fait exception, car sa phase solide à pression atmosphérique (glace ordinaire) est
moins dense que celle liquide dans les mêmes conditions et la variation du volume
(VF) est alors négative. Cette propriété s’explique en partie par la structure de l’eau
(cf. § A.2 p.14). Les autres changements d’état, telles les transformations
polymorphiques des lipides ou la gélification, seront développés pour chaque classe de
composé impliqué (cf. § B.2.3B.2.3 p.49).
500
20 GPa, 440 °C
400 VII
200
Température (°C)
III
100 VI
Ih V
0
60 GPa, -120 °C
-100 II
VIII
0 500 1000 1500 2000 2500
-200
IX
-300
Pression (MPa)
14
12 80 C
60 C
10
Dilatation thermique (dV/dT)
40 C
8
(mm3.mol-1..K-1)
6 20 C
0C
2
-2
0 200 400 600 800 1000 1200
Pression (MPa)
1,8
2,2 C
1,6
10 C
1,4
20 C
1,2
Viscosité (mPa.s)
30 C
1
50 C
0,8
0,6
0,4 100 C
0,2
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Pression (MPa)
Le second principe définit une fonction d'état S, appelée entropie, dont la variation
dans un système fermé lors d'une transformation réversible est définie ainsi :
Qrev ( 12 )
S
T
où T est la température du système (en K),
Qrev, la chaleur échangée au cours de la transformation réversible (en J).
Par définition des fonctions d'état, ces relations restent vraies au cours d'une
transformation irréversible.
De même, on peut exprimer les variations de V en fonction de P, T, ni :
V V V
dV dT dP dni ( 14 )
T P , ni P T , ni i ni T , P
1 V
( 15 )
V T P
1 V
T ( 16 )
V PT
En substituant ces coefficients dans l'équation ( 14 ), on obtient :
dV V
dT T dP i dni ( 17 )
V i V
Selon cette équation, l'échauffement moyen de l'eau est de 2°C pour 100 MPa à 25°C,
alors qu'à 0°C, il n'y a pratiquement pas d'augmentation de température, tout au moins
pour une variation de 100 MPa (cf. Figure 5). La réaction inverse se produit lors de la
détente.
40
Variation de température (°C) 80°C
60°C
30
40°C
20°C
20
10°C
10
0
0 200 400 600 800
Pression (MPa)
A partir du potentiel chimique pour une phase condensée, d'autres paramètres peuvent
être définis :
l'activité du composant i (ai) :
o o P 0
0
i (T , P, xi ) i (T , P) RT .ln ai (T , P) i (T , P) V i dP RT .ln ai (T , P) ( 21 )
o
P
Pour une solution idéale (=1), l'activité est donc indépendante de la pression. Cette
équation peut être intégrée si l'on connaît la loi d'évolution du volume partiel en
fonction de la pression. Plus simplement, la variation de volume partielle peut être
considérée en dépendance linéaire de la pression sur l'intervalle de pression,
wB wA RT a wB
ln ( 29 )
Vw Vw a wA
A.3.2.1 Équilibre
Considérant une réaction chimique de la forme :
( i j X j
) Xi ( 33 )
i j
KA
A H H
2
( 40 )
AH c H AH
Cette relation n'est valable que dans le cas où l'acide faible est le seul acide ou si les
autres acidités sont négligeables. La dérivée par rapport à la pression de l'équation
( 40 ) donne la variation du pH en fonction de la variation de la constante d'équilibre
dont l'évolution en fonction de la pression peut s'exprimer en utilisant ( 36 ) :
d pH
c AH H d ( pKa ) 1 c AH V
. AH
( 41 )
dP 2. c AH H dP
2. c
AH
H 2,3. RT
d pH 2c AH V V AH
1 . F (c AH ). ( 42 )
4c K K K 4c 2,3. RT
AH
dP AH A A A AH
2,3. RT
( i ) Xi k j X j
X ( 43 )
i j
La formation des produits est alors proportionnelle à X. Après dérivation, on obtient
la vitesse k de la réaction :
k BT
k K ( 44 )
h
ln k
1 ln K
RT U
Ea ( 45 )
T P T T P RT 2
RT 2
où Uest la variation d'énergie interne entre l’état transitoire activé et les réactants
(en J),
Ea, l’énergie d’activation de la réaction (Ea>0) (en J).
Pression
ln k ln K V
( 46 )
P T P T RT
où Vest la variation de volume partiel molaire entre l’état transitoire activé et les
réactants (en m3.mol-1).
La pression peut accélérer ou ralentir une réaction suivant le signe de Valors que
l'élévation de température ne peut que l'accélérer.
N 0 z 2 e 2 1 ln D 1 ln r
Ve 1 ( 47 )
8 0 r D P T 0 D P T
Cette équation donne une variation de volume d’environ -10 ml.mol-1 par ion
monovalent. Par contre, la création d'une liaison électrostatique entre deux ions induit
une variation de volume positive. Avec une molécule amphotère, la pression provoque
une neutralisation partielle des charges et une variation de volume négative de plus
faible amplitude.
Ces variations de volume créées par l'électrostriction vont intervenir dans toutes les
réactions aboutissant à l'apparition d'une ou plusieurs charges sur des particules
différentes, comme la dissociation ionique d'acides faibles, de sels ou même de l'eau.
Ces réactions ont une importance biologique prépondérante car elles modifient
largement des propriétés aussi importantes que le pH et la force ionique de la solution
(cf. Tableau 3).
B.1 Compressibilité
L'augmentation de pression entraîne une variation de volume de la substance
considérée. L'étude de cette variation peut s'effectuer :
sur le soluté pur : la mesure n'est applicable que sur un liquide (lipides, glycérol,
polyéthylène glycol).
sur des solutions binaires : la mesure du volume s'obtient en comparant la
compressibilité de la solution par rapport à celle du solvant pur, c'est une
compressibilité apparente.
11 V1 1
S S
1 nV S nw Vw S
w
( 49 )
V1 P V1 V1 n1
Les coefficients de compressibilité adiabatique S sont les plus utilisées car ils
résultent directement de la mesure de la vitesse du son selon la relation (CHALIKIAN et
al. 1994a) :
1
S ( 50 )
u2
S = 0 à -0,23 GPa-1
Ribonucléase A S = 0,005 GPa-1 native (pH=2, 15°C)
(TAMURA et GEKKO 1995)
Membranes Phospholipidiques
Liposomes iT =0,1 à -0,8 GPa-1 compressibilité globale (BRAGANZA et WORCESTER 1986b;
SCARLATA 1991)
1 A =
-1 (BRAGANZA et WORCESTER 1986b)
0,3 à 0,7 GPa compressibilité latérale
A P T
500
450 Protéine dénaturée
G < 0
400
350 G=0
Pression (MPa)
XD=0.5
300 S<0 S=0 S>0
250
200 V<0
150 Protéine native V=0
100 G > 0
V>0
50
0
0 10 20 30 40 50
Température (°C)
Température Pression
Liaisons peptidiques rupture pas d'effet
Groupements fonctionnels désamination pas d'effet
Ponts bisulfures rupture pas d'effet
Radicaux thiol oxydation oxydation
Modifications structurales gélification ou précipitation gélification ou précipitation
Conclusion
Les molécules biologiques qui forment la structure et assurent les différentes fonctions
des êtres vivants (lipides et protéines) sont donc susceptibles d'être modifiées par les
hautes pressions. Ces modifications peuvent perturber le fonctionnement des cellules
jusqu'à inactivation complète et définitive.
Bien que le catabolisme ne semble pas être l'étape limitante de croissance dans des
conditions optimales, le changement de source d'énergie affecte largement la
barorésistance du microorganisme. Il peut être expliqué par la vitesse de synthèse
d'ATP qui diffère en fonction du substrat. Sous haute pression, on constate un
appauvrissement du "pool" d'ATP cellulaire, dû notamment à une énergie de
maintenance plus grande. Cette dépense énergétique se retrouve dans le mauvais
rendement de synthèse de matière organique par rapport à la synthèse d'ATP obtenue
sous haute pression chez Streptococcus faecalis (MATSUMARA et MARQUIS 1977). Il
semble donc dans ce cas que l'inhibition de la croissance par la pression peut être
interprétée en fonction de l'équilibre entre la synthèse et la consommation d'ATP.
Conclusion
L'élévation de la pression entraîne donc un ensemble de perturbations physiologiques
conduisant pour une pression suffisante à un arrêt du métabolisme et de la croissance.
Cet état n'est pas irréversible car la cellule est capable de se développer à nouveau si
les conditions redeviennent plus favorables. Pour arrêter définitivement le
développement des microorganismes, l'application de niveaux de pression beaucoup
plus élevés est nécessaire.
C.2.1 Évaluation de l'efficacité d'un traitement haute pression sur des microorganismes
L'estimation de l'impact d'un traitement par haute pression sur la viabilité des
microorganismes est généralement effectuée par étalement et comptage sur boite de
Pétri avant et après traitement. Son efficacité s'exprime par la réduction décimale de la
population finale par rapport à la population initiale (Log[N0/N]). Si l'inactivation est
du premier ordre, ce qui est rarement le cas en pression, l'efficacité du traitement est
une fonction linéaire du temps. La concentration initiale ne semble pas avoir une
action significative sur la cinétique de destruction (ISHIGURO et al. 1993).
Par contre, pour l'évaluation de cette destruction, les conditions de comptage semblent
très importantes :
le moment de la lecture, car la pression entraîne généralement une augmentation du
temps latence et donc une diminution du nombre de colonies apparentes dans un
premier temps. Des expériences sur Saccharomyces cerevisiae et
Zygosaccharomyces bailii montrent que les comptages peuvent changer entre 48 h
et 72 h ; par contre, ils n'évoluent pratiquement plus au-delà (PANDYA et al. 1995).
le milieu gélifié du comptage semble induire des différences très importantes. Par
exemple, l'agar simple (PCA) donne des résultats d'efficacité (No/N) 10 fois plus
importants que le trypticase-soja (TSA) pour Escherichia coli après un traitement à
180 MPa pendant 30 mn (ISHIGURO et al. 1993).
Saccharomyces cerevisiae 300 MPa 10 mn >8 pH=4 à 25°C (PANDYA et al. 1995)
Zygosaccharomyces bailii 300 MPa 10 mn >8 pH=4 à 25°C (PANDYA et al. 1995)
Rhodotorula rubra 300 MPa 15 mn >7 25 °C (OXEN et KNORR 1993)
Candida albicans 200 MPa 60 mn 4 40 °C (BUTZ et LUDWIG 1986)
Champignons filamenteux
La variation de l'efficacité d'un traitement est induite par les conditions de la mesure et
s'ajoute aux variations des différents paramètres liés au traitement. C'est pourquoi les
résultats obtenus par des auteurs différents devront être comparés avec prudence.
C.2.2.3.1 pH
Le pH influe sur la résistance des microorganismes, à pression atmosphérique comme
à pression élevée. La sensibilité des bactéries est accrue à haute pression. Le pH
optimal de résistance est proche de la neutralité : pH 7 pour Escherichia coli à 20°C
(KAJIYAMA et al. 1993) et Listeria monocytogenes (MACKEY et al. 1995), 8 pour
Bacillus subtilis (TIMSON et SHORT 1965). Par contre, les levures sont relativement peu
sensibles au pH du milieu : l'inactivation de Rhodotorula rubra semble indépendante
du pH dans une gamme comprise entre 3 et 8 (OXEN et KNORR 1993). Lors du
traitement de jus de fruits, différentes levures n'ont pas été inactivées par un
EDTA, lysozyme, Escherichia coli <1 Pas d'effet d'association des (HAUBEN et al. 1995)
nisine trois substances.
EDTA augmente l'altération
des cellules.
C.2.3 Action des hautes pressions létales : altération de la morphologie et des fonctions
vitales des microorganismes
L'évolution des microorganismes sous pression est difficile à suivre et les altérations
sont généralement observées immédiatement après retour à pression atmosphérique.
L'analyse de ces altérations est très importante car elle peut fournir des indications
quant aux causes de cette inactivation.
Les applications alimentaires des hautes pressions, entrevues dès le début du siècle
(cf. Introduction), se développent depuis une dizaine d'années. Des nombreuses revues
exhaustives sont consacrées à ce développement (HOOVER et al. 1989; FARR 1990;
CHEFTEL 1991; BALNY et al. 1992; CHEFTEL 1992; TONELLO 1992a; CUOGHI 1993;
JOHNSTON 1994). Une liste des principaux axes de développements envisagés est
fournie dans l'Annexe I. Deux grands axes concentrent la plupart des études actuelles :
la réduction de la charge microbienne et la modification des propriétés de
biomolécules (essentiellement des protéines).
Les produits commercialisés actuellement au Japon utilisent largement ces deux effets
des hautes pressions dont des domaines de prédilection concernent également des
applications très spécialisées, comme l'inactivation de bactéries induisant la nucléation
de la glace (HONMA et al. 1993).
soit directement (étalon primaire), en équilibrant la force pressante par une masse :
balance de pression, colonne de mercure, ...
soit par l'intermédiaire de variations de paramètres physiques connus (étalon
secondaire), nécessitant donc un étalonnage préalable : résistance électrique, jauge
de contrainte, changement de propriétés optiques.
Parmi ces capteurs, seule la température peut être mesurée en n'importe quel point du
système.
Ce système, plus souple, préserve le volume utile de l'enceinte et permet une plus
grande gamme de pression. Suivant la conception du système, il est possible d'obtenir
des augmentations en pression très rapides (HAYAKAWA et al. 1994a).
Dans cette partie seront présentés les deux types de matériels utilisés pour le
traitement par haute pression hydrostatique et le matériel biologique support des
expérimentations. Les deux principales mesures réalisées au cours de ce travail seront
ensuite détaillées : la mesure de viabilité des cellules et la mesure de volume par
analyse d'images. Enfin, les différents protocoles expérimentaux utilisés lors des
expérimentations seront définis.
78
La cellule repose sur deux fenêtres cylindriques de saphir. Le saphir est un matériau
aux propriétés physiques particulièrement intéressantes (cf. Annexe II). Seul le
diamant possède des caractéristiques mécaniques supérieures, mais l'acquisition de
gemmes de cette taille pose des problèmes techniques et surtout financiers. Le quartz
naturel ou synthétique a apparemment de meilleures propriétés optiques que le saphir
mais une résistance mécanique moindre. Des essais avec du quartz ont relevé des
difficultés de montage et un clivage de la pièce à partir de 150 MPa.
Le saphir peut être monté directement sans joints comme l'a décrit POULTER (HAWLEY
1978), le principe d'étanchéité est une simple application du principe de la surface non
supportée développé par BRIDGMAN. Ce type de fixation présente des inconvénients
car il nécessite des surfaces de contact parfaitement polies et le retour à pression
atmosphérique provoque le détachement de la fenêtre. Le maintien de la fenêtre au
support par un serrage externe et l'adjonction de joints permet de prévenir les fuites
possibles durant plusieurs cycles de pression. De plus, une feuille d'or interposée entre
le saphir et la pièce support atténue l'effet des irrégularités de surface.
La taille des hublots de saphir a été choisie afin de résister à des pressions de
700 MPa. Une récente étude (CHERVIN et al. 1994) a permis de définir les zones de
ruptures de cylindres de saphir sous l'effet de la pression, en fonction de l'épaisseur du
saphir et du diamètre de la surface non supportée. Cette étude permet de prévoir le
type de fracture du saphir en fonction du niveau pression utilisé et des dimensions de
la fenêtre. Des cycles de pressurisation/détente ne semblent pas affecter sa résistance.
D'après cette étude, l'épaisseur minimale de la fenêtre de saphir pour un rapport de
diamètres (pièce/ouverture) de ½ et une pression de 700 MPa est d'environ 3 mm. Le
choix d'une épaisseur de 5 mm assure donc un bon coefficient de sécurité.
une partie "statique" (700 MPa) avec une pompe manuelle, qui permet des
augmentations rapides et précises de pression dans un petit volume,
une partie "dynamique" (400 MPa) avec une pompe hydropneumatique, qui accepte
de plus grands volumes mais offre aussi de nouvelles possibilités : injection,
circulation, chauffage, ...
Dans la configuration adoptée (cf. Figure 17), les deux parties sont interconnectées,
deux vannes permettent l'isolement d'une partie ou de l'autre. Cependant, l'ensemble
reste modulable, il est possible d'en dissocier une partie, par exemple pour atteindre
des pressions de 500 MPa à 700 MPa.
88
MATERIELS ET METHODES 89
C Cellules et liposomes utilisés
Afin de pouvoir comparer les comportements morphologiques, deux types de cellule
(levures et cellules sanguines humaines) ainsi que des liposomes et des sphéroplastes
ont été utilisés.
C.1 Levures
C.1.1 Souches utilisées
Deux souches différentes ont été utilisées :
la levure Saccharomyces cerevisiae souche CBS 1171 est bien connue et largement
utilisée dans la littérature comme au laboratoire GPAB de l’ENSBANA,
la levure Saccharomycopsis fibuligera souche CBS 2521 présente l'avantage d’être
plus grande que la levure précédente et surtout possède une paroi beaucoup plus
visible au microscope, donnant un meilleur contraste et une focalisation plus aisée.
Sa courbe de croissance est similaire à celle de Saccharomyces cerevisiae en milieu
liquide, mais elle se développe sous forme de filaments lorsque les conditions
deviennent difficiles (au bout de 4 jours de culture environ).
Ces deux souches ont une forme sphéroïde lorsqu’elles sont cultivées en milieu
liquide.
L'activité de l'eau de ce milieu est environ 0,997 et peut être diminuée par ajout de
solutés.
Elle a été mesurée, comme pour les autres milieux utilisés à l'aide d'un osmomètre
Aqualab CX2 (Decagon devices Inc., USA) qui donne la température du point de
rosée de l'échantillon, couvrant une gamme d'activité de l'eau de 0,1 à 1.
C.2 Sphéroplastes
Les sphéroplastes sont des levures dont la paroi a été retirée par action enzymatique.
Ils sont préparés à partir de Saccharomyces cerevisiae en phase exponentielle. La lyse
de la paroi est réalisée par deux enzymes : 200 g/ml de zymolysase (Sigma, États-
Unis) et 2 % de -glucuronidase (Sigma, États-Unis) en présence de 2,5 l/ml de -
mercaptoéthanol (Sigma, États-Unis) et de glycérol qui maintient une activité de l'eau
de 0,99 (WOLSKA-MITASZKO et al. 1981). La lyse complète de la paroi est vérifiée par
l'éclatement de la membrane en présence d'eau distillée. Les sphéroplastes sont fixés
selon un protocole identique aux levures.
MATERIELS ET METHODES 91
celui d'une expérience (30 mn), permet son introduction dès le début de la
manipulation.
Les cellules sanguines sont fixées et observées selon un protocole identique à celui
utilisé pour les levures (cf. § F.1.F.1.1 p. 101). La chambre de visualisation et le milieu
de pressurisation (milieu DPMI) sont maintenus à une température proche de 37°C.
C.4 Liposomes
Les liposomes sont des vésicules formées à partir de phospholipides dans une solution
aqueuse. La fabrication de liposomes unilamellaires est réalisée selon le protocole
suivant :
16:0 Palmitique 32
16:1 Palmitoléique 1,5
18:0 Stéarique 16
18:1 Oléique 26
18:2 Linoléique 13
18:3 Linolénique < 0,3
20:4 Arachidonique 4,8
22:6 Docosahexaénoique 4
MATERIELS ET METHODES 93
La fonctionnalité de la membrane et/ou du métabolisme : l'ajout d'un colorant
vital dans la cellule de visualisation permet de distinguer au microscope les cellules
viables des cellules mortes ; le comptage se fait sur cellule de numération (Cellule
de Malassez). Deux colorants d'exclusion ont été utilisés : le bleu de méthylène
(LEE et al. 1981) et le Viablue II (NCIMB, Écosse) (HUTCHESON et al. 1988) qui ne
pénètrent dans la cellule que lorsque celle-ci n'est plus viable. De plus, si le bleu de
méthylène entre dans une cellule viable dont la membrane est altérée, le colorant y
est oxydé en une forme incolore. Les cellules endommagées présentent alors des
niveaux de coloration différents, en fonction de la vitesse de pénétration du
colorant et de son oxydation (JONES 1987). Le Viablue II est utilisé
préférentiellement car sa coloration est plus facilement identifiable. L'erreur induite
par ce type de mesure est faible (< 10 %) pourvu que le nombre de cellules compté
soit suffisant (LANGE et al. 1993). Cependant, cette technique ne permet pas de
mesurer des viabilités inférieures à 10 %.
MATERIELS ET METHODES 95
contre, le stockage sur disque n'admet pas d'acquisitions en ligne aussi rapides (jusqu'à
2 images/s).
Les images peuvent être enregistrées sur un magnétoscope Hi8 (EVO500, Sony,
Japon) pour un traitement ultérieur, ce qui permet de traiter des cinétiques rapides
(25 images/s) dont le déclenchement est a priori inconnu.
La carte est fournie avec une bibliothèque en langage C++ pour le développement
d'applications spécifiques. Ici, deux programmes ont été adaptés aux besoins de
l'expérimentation. Simultanément à l'acquisition d'images, ils enregistrent en outre les
données de la pression et de la température :
le premier programme réalise l'acquisition d'images numérotées à chaque
sollicitation de l'opérateur, ce qui permet de s'assurer de la focalisation ou de
réaliser un échantillonnage statistique,
le second effectue cette acquisition à intervalles de temps réguliers sans aucune
intervention ; il est adapté à l'analyse de cinétiques rapides.
De multiples informations (20 à 100 images/expérience) peuvent ainsi être recueillies.
L'étape suivante consiste à extraire l'information de chaque image par un processus de
traitement informatique.
L'analyse d'images est effectuée avec le logiciel Visilog 4.0 (Noesis, France) sur un
serveur RS6000 (IBM, États-Unis). La technique utilisée reprend les travaux
précédents effectués au laboratoire sur la cellule osmotique (BERNER 1994a). La faible
qualité des images obtenues sous haute pression, l'utilisation d'autres matériaux
biologiques (cellules sanguines, liposomes) ainsi que de nouvelles méthodes
d'acquisition d'images ont nécessité le développement d'un algorithme de traitement
permettant d'extraire les informations contenues dans chaque image. Le programme
d'analyse automatique inclut quatre sous-programmes ou routines, analysés ci-après,
qui permettent d'améliorer sensiblement la qualité de l'analyse et surtout le temps de
traitement.
MATERIELS ET METHODES 97
Figure 18 : Segmentation par détection des maximums locaux sur un gradient
morphologique. Afin de suivre le traitement, un élément de l'image (150x200) a
été sélectionné, un graphique montre les niveaux de gris le long de l'axe médian.
240
220
200
180
160
140
120
100
30
25
20
15
10
Étape 3 : Étape 4 :
Binarisation par détection des maximums locaux Remplissage des formes
Étape 5 : Étape 6 :
Calcul des distances sur l'image binaire Séparation des formes
MATERIELS ET METHODES 99
E.2.4 Analyse individuelle des cellules
Le module d'analyse individuelle de Visilog permet de calculer de nombreux
paramètres sur chaque cellule, rendant possible un traitement des résultats à
posteriori :
Ces informations calculées pour chaque objet et chaque image sont transférées sur un
fichier exploité ultérieurement sur un tableur. Elles permettent, pour des
échantillonnages statistiques de la population de levures, une sélection automatique
des cellules à partir de critères simples :
F.1.1.1 Fixation
Les cellules sont fixées à la surface de la fenêtre de saphir inférieure par
l'intermédiaire du film de polymère. Le chitosan (Fluka - Biochemie N°22741),
polymère cationique, a tout d'abord été utilisé après vérification sur Saccharomyces
cerevisiae de ses capacités d'adhésion et de son innocuité (BERNER et GERVAIS 1994b).
Cependant, face à des problèmes de visualisation et à la suite d'études montrant un
effet antimicrobien du chitosan sous pression (PAPINEAU et al. 1991), un autre
polymère, la poly-L-lysine (solution 0,1 g/l, N°P8920, Sigma, États-Unis) a été préféré
car il est décrit comme neutre vis-à-vis des microorganismes sous pression (ISHIGURO
et al. 1993) et perturbe moins la visualisation.
Le film est confectionné avec une goutte de solution contenant le polymère qui est
déposée à la surface de la fenêtre de saphir inférieure, préalablement montée dans le
corps de la cellule. Après 30 mn environ, le surplus de liquide est évacué et la fenêtre
séchée pendant 30 mn supplémentaires. Une goutte de liquide cellulaire est alors
déposée sur le film de polymère ainsi créé. Les cellules sont laissées pendant environ
30 mn afin qu'elles se déposent et adhèrent au film. Puis, le montage de la chambre est
poursuivi comme indiqué à l'annexe III.
Le faible nombre de cellules suivies pour chaque traitement (de 1 à 20 cellules) est un
facteur limitant de ces expériences. De plus, le film de polymère peut induire des
perturbations au niveau membranaire, mais aussi diminuer le contraste des images.
où v0, vp sont respectivement les volumes initial et final de la même cellule (en
Voxel ou m3),
f, la variation relative de volume due au traitement, supposée identique quelle
que soit la cellule considérée (f [0,1]),
In, Ip, des classes de volume quelconque,
(Vn), la suite de volumes représentant les bornes des classes de l'histogramme.
Pour obtenir des classes adjacentes quel que soit le volume considéré, il faut que
I P I n1 :
I p I n 1 n, Vn 1 (1 f )Vn ( 57 )
La suite (Vn) doit donc être une suite géométrique de raison 1/(1-f). La valeur de f est
obtenue en optimisant le déplacement des fréquences calculées avant et après
traitement.
F.3.1 Étalonnage
Le circuit utilisé ne comporte que la pompe manuelle, les deux vannes et le capteur de
pression. La variation de volume induite par la pompe a été étalonnée par 1/6 de tour.
Afin d'obtenir des mesures absolues, l'évaluation du volume initial du circuit est
nécessaire, ce qui ne peut être réalisé directement. Ce volume a été obtenu en
rapprochant les variations de volume de l'eau pure avec celles fournies par la
littérature (BRIDGMAN 1912). L'estimation du volume initial est de 4,96 ml ( 0,07)
avec une variation de volume de 89 l.tour-1 ( 0,1).
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 109
Figure 19 : Effets de la pression et de la focalisation sur l'estimation du volume de billes de
verre (4 billes, diamètre < 40 µm) (HAYERT 1994).
Le signe () représente la mesure moyenne obtenue avec la focalisation
optimale ; les barres (), les variations maximales de volume induites par la
défocalisation.
100%
90%
(% du volume initial)
80%
Volume relatif
70%
60%
50%
40%
Tableau 9 : Analyse de la variance des volumes relatifs de levures au cours d'un traitement
30%
20%
haute pression (250 MPa, 15 mn). Les écarts résiduels représentent les erreurs
10%
0%
dues à la focalisation.0 0 0 0 0 0 0 0 0
Pression (MPa)
Source des Somme des Degré de Moyenne Écart F calculé Probabilité Valeur
variations carrés des liberté des carrés moyen de F/Ho critique de
écarts des écarts Fà5%
Cellules de
0,101 8 0,01260 11 % 12,93 < 0,01 % 1,99
levure
Pression 0,758 9 0,08424 29 % 86,50 < 0,01 % 1,93
Interaction 0,493 72 0,00684 8% 7,02 < 0,01 % 1,37
pression-levures
Focalisation 0,175 180 0,00097 3%
Total 1,527 269
Une analyse de la variance à deux facteurs (la pression, les individus) a été
réalisée sur ces mesures (cf. Tableau 9). Outre une influence significative
prévisible de chaque facteur, cette analyse montre un écart moyen résiduel
d'environ 3 % dû aux différentes focalisations. La mesure de volume a donc une
bonne reproductibilité quelle que soit la pression considérée. Cette mesure a de
plus été effectuée sur Saccharomyces cerevisiae avec l'objectif
APO 20 x 0,30 GF (Nachet, France), conditions les plus défavorables pour
l'analyse des levures.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 111
Figure 20 : Effet de la pression sur la distribution des volumes de billes de latex
Distribution initiale
Distribution à 200 MPa après 15 mn
Distribution après retour à pression atmosphérique
100%
90%
80%
70%
(% de la population totale)
60%
Fréquence
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Classes de volume de billes de latex (m3)
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 113
Le système de mesure de la distribution de volumes mis en oeuvre permet donc
d'obtenir une distribution satisfaisante des objets à observer malgré le nombre
relativement faible d'objets considérés (environ 500 par distribution).
L'utilisation de cette technique sur des levures ne devrait pas induire d'erreur
supplémentaire car, la concentration cellulaire étant supérieure, le nombre de cellules
pris en compte sera plus important et en phase stationnaire les levures ont, comme les
billes, une distribution unimodale.
Conclusion
Ces étalonnages ont permis d'estimer l'erreur commise aussi bien sur une mesure
individuelle que sur une distribution complète. Les faibles écarts observés dans les
deux cas valident la technique et le protocole. Néanmoins, les interprétations de
variations de volume devront tenir compte d'erreurs systématiques.
Différents niveaux de pression de 100 à 320 MPa ont été utilisés pour un temps de
séjour de 15 mn environ. La population des deux souches de levures utilisées a été
estimée par la méthode UFC ou par coloration vitale (cf. § F.2.2 p.104). La viabilité
est exprimée en rapportant la population viable après traitement à celle du témoin
n'ayant pas subi le traitement, pour la méthode UFC ; par contre pour la méthode
microscopique, cette viabilité est directement obtenue en divisant le nombre de
cellules viables identifiées par le nombre total de cellules de l'échantillon.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE S OUS HAUTES PRESSIONS 115
Figure 21 : Viabilité de Saccharomyces cerevisiae et Saccharomycopsis fibuligera après un
traitement à un niveau de pression variable durant 15 mn.
120%
100%
(UFC et coloration vitale)
80%
Viabilité cellulaire
60%
40%
20%
0%
0 50 100 150 200 250 300 350
Pression (MPa)
appliquée pendant 15 mn
116 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Les résultats présentés Figure 21 montrent une forte diminution de la viabilité
en fonction de la pression, cette inactivation étant plus sensible pour la mesure
par UFC. En effet, après un traitement à 320 MPa pendant 15 mn, dans 1 ml de
milieu, seules 500 cellules de Saccharomyces cerevisiae sont capables de
former une colonie, alors qu'initialement ce nombre était proche de 108 soit une
réduction décimale de 5,3.
Les résultats obtenus sur Saccharomyces cerevisiae sont cohérents avec ceux
rapportés par d'autres auteurs dans des conditions comparables, aussi bien avec
une coloration vitale (HAYAKAWA et al. 1992) qu'avec un comptage sur boite
de Pétri (HOOVER et al. 1989; PANDYA et al. 1995).
Ces résultats montrent aussi que la souche Saccharomycopsis fibuligera est
sensiblement plus résistante à la pression que Saccharomyces cerevisiae. Un
niveau de destruction comparable est obtenu pour Saccharomycopsis fibuligera
pour une pression de 50 MPa supérieure à celle nécessaire pour Saccharomyces
cerevisiae.
La différence entre les méthodes d'estimation (coloration vitale et UFC) est accentuée
par le traitement haute pression. Cet écart signifie donc que les propriétés mises en jeu
par chaque technique ne sont pas affectées avec la même ampleur par le traitement
haute pression. La perméabilité membranaire et l'activité enzymatique cellulaire sont
donc moins perturbées que la capacité de ces cellules à se développer sur un milieu
d'agar nutritive. Cependant, dès 250 MPa, la viabilité estimée par numération
microscopique est au-dessous de la zone d'application conseillée pour cette méthode
(JONES 1987), la relation avec la viabilité n'est plus linéaire. Ces deux méthodes
restent néanmoins bien corrélées.
La valeur donnée par la méthode UFC est essentielle pour les applications
alimentaires, car elle représente un taux de désinfection directement utilisable. La
viabilité estimée par coloration permet, par contre, une mesure rapide et directe qui
peut facilement être exploitée pour la compréhension des mécanismes d'inactivation
cellulaire sous haute pression. Il faudra cependant tenir compte du fait qu'une grande
partie des cellules considérées comme viables au microscope sera incapable de se
développer sur un milieu nutritif.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 117
Figure 22 : Viabilité de Saccharomyces cerevisiae en fonction du temps de séjour à trois
niveaux de pression différents.
La viabilité est estimée par la méthode UFC.
Erreur ! Liaison incorrecte.
118 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRES SION
En considérant la viabilité indiquée par coloration, une pression de 250 MPa pendant
15 mn inactive environ la moitié de la population des levures, ce qui permet avec une
forte probabilité d'avoir des cellules inactivées et viables présentes dans un faible
échantillon comme celui d'un champ microscopique (environ 0,1 mm de côté).
Le temps de séjour sous pression retenu pour effectuer ces expériences est de 15 mn,
car de nombreuses études sur les cinétiques de destruction des levures ont mis en
évidence une rupture de pente autour de ce temps (OXEN et KNORR 1993). Il est
cependant intéressant de connaître l'évolution de la viabilité lorsque ce temps est
réduit.
B.1.2 Effet du temps de séjour sous pression sur la viabilité des levures
La viabilité de Saccharomyces cerevisiae a donc été mesurée après des traitements
utilisant différents temps de séjours sous pression.
Ainsi, la Figure 22 représente l'évolution de la viabilité pour trois niveaux de pression
différents. L'axe des abscisses présente le temps de séjour sous pression. Ce temps
n'inclut pas les durées d'élévation de pression (environ 3 mn) et de détente (environ
1 mn), similaires quel que soit le temps de maintien sous pression. La série "Jet"
correspond à un traitement en continu, où l'élévation de pression est réalisée par une
pompe haute pression et la détente dans l'air par une buse en saphir percée d'un orifice
de 45 µm de diamètre (La Découpe, France) (VITRAC 1995). Ce traitement équivaut à
une augmentation et une diminution de pression extrêmement rapides (inférieure à une
seconde) et un temps de maintien sous pression d'une vingtaine de secondes, les effets
secondaires dynamiques de la détente brutale (échauffements, impact, cisaillement)
ont été réduits lors de cette expérience.
Les traitements décrits par les deux premières séries ("Jet" et "0 mn") bien qu'ils
impliquent tous les deux un temps de séjour sous pression réduit, incluent des durées
d'élévation de pression et de détente différentes (respectivement quelques secondes et
3 mn + 1 mn) et surtout utilisent des techniques distinctes.
Les résultats de la Figure 22 montrent une liaison directe entre la viabilité et le
temps de séjour sous pression, un temps de séjour réduit étant peu destructeur
au moins jusqu'à 250 MPa. Alors que la pression s'applique instantanément et
uniformément à tout le système, l'inactivation microbienne induite par ce
traitement est fonction du temps et n'affecte pas également tous les individus.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 119
Le logarithme de la destruction et le temps de maintien sont fortement liés sur
l'intervalle de temps considéré (0-15 mn). Un maintien d'environ 3 mn à
250 MPa est nécessaire pour diviser la population par 10. Par contre, au-delà de
15 mn, le taux de destruction augmente beaucoup moins vite et une destruction
complète (réduction décimale > 10) nécessite un temps de maintien sous
pression prolongé. Quatre heures à 200 MPa sont nécessaires pour détruire
totalement une culture de Saccharomyces cerevisiae (BUTZ et LUDWIG 1986).
Ces résultats sur la cinétique d'inactivation sont comparables à ceux obtenus sur
Saccharomyces cerevisiae (EARNSHAW 1995) ou sur Rhodotorula rubra (KNORR
1995).
Dans ces deux premières séries d'expérimentations, le milieu dans lequel sont traitées
les levures est celui utilisé pour la culture cellulaire. Or de nombreux auteurs ont mis
en évidence l'importance du milieu sur la résistance des levures à haute pression.
120 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
B.2 Effet du milieu sur la barorésistance des levures
Les caractéristiques du milieu dans lequel se trouvent les levures ont une influence
déterminante sur la survie des microorganismes à un stress et particulièrement lors
d'un traitement haute pression.
L'influence de la variation de deux propriétés importantes a été examinée :
modification de l'activité de l'eau par ajout de solutés osmotiquement actifs,
modification du pH du milieu par addition d'acides faibles ou forts.
B.2.1 Effet des solutés et de l'activité de l'eau du milieu sur la barorésistance des
levures
De nombreux auteurs ont mis en évidence le rôle d'adjonction de soluté dans le milieu
pour protéger les cellules traitées sous haute pression (HAYAKAWA et al. 1992;
TAKAHASHI 1992; OXEN et KNORR 1993).
Afin de vérifier ce phénomène, trois solutés sélectionnés en fonction de leur rôle
spécifique et de leur compatibilité avec la croissance cellulaire ont été utilisés :
le glycérol, synthétisé en grande quantité par les levures lors de chocs osmotiques
(GERVAIS et al. 1992), son passage à travers la membrane peut se faire de façon
passive. Son action protectrice vis-à-vis de la dénaturation des protéines est
reconnue aussi bien pour la dénaturation thermique (GEKKO et TIMASHEFF 1981)
que pour celle obtenue par haute pression (OLIVEIRA et al. 1994),
le sorbitol est un composé non toxique pour la cellule. Il ne pénètre pas dans les
cellules de levures (NIEDERMEYER et al. 1977),
le fructose possède un coefficient osmotique élevé et une solubilité importante
(GERVAIS et al. 1988).
L'influence sur la viabilité des levures de l'addition de ces trois solutés à de fortes
concentrations dans le milieu a été étudiée précédemment à pression atmosphérique
(MARECHAL et GERVAIS 1995a). Les concentrations en solutés ont d'ailleurs été
choisies non létales en référence à ces travaux.
Des levures en phase stationnaire ont été mises en suspension dans des milieux
binaires contenant une quantité variable des trois solutés choisis. Ces différents
échantillons ont été traités pendant 15 mn à 270 MPa ou 320 MPa.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 121
Figure 23 : Effet de l'addition de différents solutés sur la viabilité de Saccharomyces
cerevisiae à deux niveaux de pression 270 et 320 MPa appliqués durant 15 mn.
Erreur ! Liaison incorrecte.
Figure 24 : Effet de l'activité de l'eau du milieu sur la viabilité de Saccharomyces cerevisiae à
deux niveaux de pression (270 et 320 MPa) appliqués durant 15 mn.
Erreur ! Liaison incorrecte.
122 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
B.2.1.1 Effet des solutés sur la résistance des levures
Les taux de viabilité obtenus par UFC en fonction des différents milieux sont
représentés sur la Figure 23. Cette expérience montre clairement que l'addition
de soluté augmente la viabilité cellulaire, quel que soit le soluté. Pour obtenir
un niveau de destruction similaire, le traitement de microorganismes dans un
milieu concentré exige donc un niveau de pression plus élevé ou un temps de
traitement plus long. L'addition de 15 g de glycérol, 20 g de sorbitol ou 30 g de
fructose à 100 g d'eau réduit l'efficacité d'un traitement à 320 MPa au niveau
obtenu à 270 MPa avec de l'eau seule.
D'autres mesures, à une pression de 400 MPa, ont montré une viabilité
supérieure à 50 % dans un milieu binaire contenant 75 g de fructose pour 100 g
d'eau. A concentration égale le glycérol est le plus baroprotecteur,
contrairement à certaines données bibliographiques (TIMSON et SHORT 1965). Il
a aussi le plus faible poids moléculaire, l'effet du soluté serait donc plutôt lié à
sa fraction molaire.
B.2.1.2 Effet d'une diminution de l'activité de l'eau sur la résistance des levures
L'ajout d'un soluté permet de diminuer l'activité de l'eau du milieu suivant la
concentration molaire et le coefficient osmotique du soluté considéré. A pression
atmosphérique, l'activité de l'eau a une grande importance sur le métabolisme des
microorganismes (GERVAIS 1990). Il est donc intéressant de vérifier si la modification
de cette propriété n'est pas responsable de la baroprotection des levures.
La Figure 24 représente la viabilité cellulaire de levures soumises à un
traitement haute pression en fonction de l'activité de l'eau du milieu. En fait, les
résultats précédents obtenus avec trois solutés et deux niveaux de pression
différents ont été représentés en fonction de cette propriété du milieu. Cette
représentation fait apparaître une liaison linéaire entre l'activité de l'eau du
milieu et la viabilité finale pour un niveau de pression donné. Une diminution
de 0,045 unité d'activité de l'eau, ce qui revient à une augmentation de pression
osmotique d'environ 5 MPa, compense une élévation de 50 MPa de pression
hydrostatique dans la gamme de pression étudiée.
OXEN et KNORR obtiennent des résultats comparables avec la levure Rhodotorula
rubra et d'autres solutés (NaCl, saccharose) (OXEN et KNORR 1993). Dans ces travaux,
les auteurs postulent que l'aw du milieu augmente la barorésistance de la levure
uniquement lorsque la croissance cellulaire est inhibée par ce potentiel hydrique à
pression atmosphérique. Saccharomyces cerevisiae est capable de se développer à une
aw de 0,92 (MARECHAL 1992). Les résultats obtenus ici concernant l'action de l'aw sur
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 123
la barorésistance de Saccharomyces cerevisiae, montrent cependant qu'un effet
significatif est obtenu pour des activités de l'eau supérieures à 0,92.
De même, les modifications membranaires induites par une pression osmotique élevée
à pression atmosphérique (TUNBLAD-JOHANSSON et ADLER 1987) pourraient protéger
la cellule des effets des hautes pressions. Certains solutés sont capables à pression
atmosphérique de prévenir une dénaturation de la bicouche lipidique ainsi qu'une
fusion des lipides membranaires (ARAKAWA et TIMASHEFF 1982; STRAUSS et al.
1986).
L'addition de soluté stabilise les biomolécules et atténue la dénaturation par haute
pression (DUMAY et al. 1994; OLIVEIRA et al. 1994).
Ces résultats confirment donc l'importance de l'activité de l'eau dans l'inactivation des
levures par haute pression. La forte protection conférée par la diminution d'aw signifie
que l'aw et la pression hydrostatique agissent de façon opposée sur les mêmes cibles
cellulaires.
124 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
B.2.2 Effet du pH du milieu sur la viabilité des levures
L'influence du pH du milieu sur la barotolérance des microorganismes est très
importante chez les bactéries (KAJIYAMA et al. 1993; MACKEY et al. 1995). Par contre
chez les levures, naturellement résistantes aux milieux acides, l'effet est plus modéré et
des pH inférieurs à 3 sont nécessaires pour accroître l'inactivation cellulaire (OXEN et
KNORR 1993; PANDYA et al. 1995).
Afin de vérifier l'effet du pH sur la barotolérance des levures, un même traitement
(250 MPa/15 mn) a été appliqué dans différents milieux : eau distillée (5,8), milieu de
culture (4,5), solutions aqueuses d'acide phosphorique, d'acide acétique et d'acide
chlorhydrique.
L'acide chlorhydrique est totalement dissocié dans l'eau et la pression fait donc peu
varier le pH de la solution ; par contre les acides acétique et chlorhydrique sont des
acides faibles et ne sont pas complètement dissociés dans l'eau aux pH utilisés.
L'augmentation de la pression modifie leur équilibre de dissociation, entraînant une
légère diminution du pH (cf. § A.3.2.1 p. 26).
Cette variation de pH à 250 MPa peut être calculée à partir de l'équation ( 42 ) (p. 28)
et des valeurs du Tableau 3 (p.31) :
-0,16 à pH 4 et -0.23 à pH 3 pour l'acide acétique,
-0,005 à pH 4 et -0.05 à pH 3 pour l'acide phosphorique.
Les viabilités sont estimées par rapport à un témoin maintenu au même pH à pression
atmosphérique. Pour tous les témoins et donc pour la gamme de pH retenue aucune
variation de viabilité de Saccharomyces cerevisiae n'a été observée.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 125
Figure 25 : Effet de l'abaissement du pH du milieu sur la viabilité de Saccharomyces
cerevisiae après un traitement de 250 MPa/15 mn.
Erreur ! Liaison incorrecte.
126 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Les résultats présentés sur la Figure 25 confirment que, pour un pH supérieur
ou égal à 4, l'acidité du milieu n'a pas d'influence sur la viabilité de
Saccharomyces cerevisiae lorsqu'il est maintenu à 250 MPa pendant 15 mn. Par
contre à pH 3, la présence d'acide acétique entraîne un effet destructeur
important alors que les deux autres acides restent inefficaces.
L'action spécifique de l'acide acétique peut certes être due à la variation de pH, plus
importante sous pression. Mais surtout, la forme non dissociée de l'acide acétique est
majoritaire à pH 3 (environ 95 %), du fait d'une constante de dissociation (pKa = 4,2)
supérieure au pH, contrairement à l'acide phosphorique (pKa = 2,2). Or, une substance
de faible poids moléculaire pénètre passivement dans les cellules d'autant plus
facilement qu'elle ne porte aucune charge. A ce pH, l'acide acétique sous sa forme non
dissociée pénètre donc plus facilement dans le milieu intracellulaire. Le cytosol ayant
un pH plus élevé que le milieu, cet acide a tendance à se dissocier et à abaisser
localement le pH lorsqu'il a pénétré dans la cellule. Sous pression, l'acidification
intracellulaire s'accentue par une dissociation supplémentaire de l'acide acétique, mais
aussi par l'inactivation des systèmes de régulation cellulaire du pH, notamment les
systèmes ATPasiques (DE SMEDT et al. 1979; DREYFUS et al. 1988). Cette
acidification du milieu intracellulaire peut agir en conjonction avec la pression pour
modifier les structures cellulaires. A 20°C, la myoglobine, par exemple, est
majoritairement dénaturée à 400 MPa dans un milieu à pH 6 alors que 150 MPa
suffisent dans un milieu à pH 4 (WEBER et DRICKAMER 1983).
Ces expériences montrent que les levures sont peu sensibles à l'acidification du milieu
jusqu'à un pH 3, il n'y a pas d'effet conjugué de la pression et du pH du milieu
extérieur. Par contre, une acidification du milieu intracellulaire favorise l'inactivation
cellulaire par haute pression.
La différence de pH entre le milieu et l'eau distillée n'induit pas de différence
significative sur la viabilité des levures après un traitement haute pression.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 127
Conclusion des expériences préliminaires
Ces expériences ont permis de définir l'influence du traitement et du milieu sur la
viabilité de levures. Pour observer sous pression à la fois des cellules mortes et des
cellules viables à la fin du traitement, les conditions suivantes ont été retenues à partir
des résultats préliminaires :
niveau de pression : 250 MPa,
temps de traitement : 15 mn,
milieu de pressurisation : eau (pH = 6, aw 1) ou milieu de culture cellulaire
(pH = 4,5, aw = 0,997).
Ces expérimentations ont permis de préciser les conséquences sur la viabilité des
levures induites par des variations physico-chimiques du milieu (pH, aw) et de
présenter quelques hypothèses concernant l'inactivation cellulaire par haute pression.
L'augmentation de température due à l'élévation de la pression est négligeable sur le
matériel expérimental, du fait de la vitesse de pressurisation modérée et de la faible
section des tuyauteries qui permet un échange thermique efficace avec l'extérieur.
128 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C Évolution du volume de cellules et de
liposomes au cours d'un traitement haute
pression
La variation du volume cellulaire constitue une variable particulièrement intéressante
pour appréhender l'équilibre thermodynamique de la cellule : les transferts de masses
induits, les modifications des équilibres physico-chimiques des cellules ou la
compression de la cellule.
Des études ont montré que ce volume pouvait varier chez Saccharomyces cerevisiae
de 110 à 40 % lors d'un stress hydrique à pression atmosphérique (MARECHAL 1992).
Dans ce cas la variation de volume est étroitement liée à des transferts d'eau. Des
travaux complémentaires ont montré que la cinétique de variation de volume, lors d'un
choc osmotique, est même directement liée à la viabilité cellulaire résultante
(MARECHAL et GERVAIS 1995a).
Les travaux sur les hautes pressions prenant en compte les variations du volume
cellulaire sont peu nombreux. Une étude a estimé la variation de volume cellulaire
d'Escherichia coli par perméabilisation chimique (EDTA) et mesure du relargage d'un
composé marqué suite à la compression de la cellule. Avec cette technique, POLLARD
et WELLER obtiennent une diminution de 17,5 % à 200 MPa (POLLARD et WELLER
1966). Cependant la technique est fortement critiquable : seule la différence de
compression entre la paroi cellulaire et le milieu intracellulaire peut être prise en
compte et dans ce cas la mesure semble donc excessive.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 129
La cellule de visualisation développée permet de suivre le volume cellulaire par
microscopie en continu avec une précision raisonnable (cf. § A p.108). Cette approche
originale a été effectuée principalement sur les deux levures Saccharomyces cerevisiae
et Saccharomycopsis fibuligera. Cependant, afin de confirmer les hypothèses
avancées, deux autres modèles ont été étudiés :
des cellules sanguines humaines (K562),
des liposomes, qui permettent de modéliser les éventuelles variations d'une
bicouche lipidique.
130 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.1 Variations du volume cellulaire de cellules fixées
Les variations du volume de cellules individualisées lors d'un traitement haute
pression ont été étudiées progressivement, en trois temps :
la variation du volume cellulaire en fonction de la vitesse d'élévation de la pression,
les variations de volume provoquées par l'élévation de la pression et la détente au
cours d'un traitement haute pression,
la cinétique de variation de volume lors du maintien sous pression.
PARTIE I : MESURE DES VARIAT IONS DU VOLUME CELLU LAIRE SOUS HAUTES PR ESSIONS 131
Figure 26 : Variations moyennes du volume de cellules de Saccharomyces cerevisiae fixées,
au cours d'une augmentation de pression jusqu'à 400 MPa à différentes vitesses.
Les barres d'erreurs représentent l'intervalle de confiance à 95 %.
0%
Volume cellulaire relatif
(% du volume initial)
0%
0%
0%
0%
0%
0 100
Pression (MPa)
132 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CEL LULES ET DE LIPOSOME S AU COURS D'UN TRAI TEMENT HAUTE PRESSION
105%
100% Pressurisation
95%
90%
Volume cellulaire relatif
Maintien en
(% du volume initial)
pression
85% 250 MPa/15
minutes
Dépressurisation
80%
75%
70%
65%
60%
0 100 200
Pression (MPa)
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLUME CELLULAIRE SOUS HAUTES PRESSIONS 133
Les résultats présentés Figure 26 montrent l'évolution du volume cellulaire en
fonction de la pression. Une contraction similaire est obtenue quelle que soit la
cinétique utilisée. Cette diminution de volume, d'environ 10 % à 200 MPa et
15 % à 400 MPa, est proche de la compression théorique du milieu (eau), soit
7 % à 200 MPa et 11,4 % à 400 MPa (MAKITA 1992). La variation de volume
cellulaire induite par l'augmentation de pression est donc indépendante de la
cinétique d'élévation de pression, tout au moins dans la gamme utilisée et pour
la levure étudiée.
134 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPOSOMES AU COU RS D'UN TRAITEMENT H AUTE PRESSION
dénaturation protéique par exemple implique une variation moyenne
d'environ - 0,2 % (LÜDEMANN 1988). Elles seront donc négligées par la suite.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLUME C ELLULAIRE SOUS HAUTE S PRESSIONS 135
Figure 28 : Images de cellules de Saccharomycopsis fibuligera suite à une élévation et un
maintien en pression.
Une ligne rouge délimite la surface prise en compte par l'analyse d'image.
136 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPO SOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Durant la montée et la descente en pression, si l'on suppose la compressibilité
cellulaire proche de celle du milieu, le terme de compression semble dominant et les
transferts réduits. Par contre, pendant le maintien en pression, la variation de la
pression est nulle (dP = 0) ; la variation de volume ne peut alors s'expliquer que par
une sortie de matière de la cellule (eau et/ou soluté).
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 137
Figure 29 : Cinétique de variation du volume moyen de cellules de Saccharomycopsis
fibuligera fixées, pendant un cycle de pression de 250 MPa/15 mn.
100%
250
90%
200
Volume cellulaire relatif
(% du volume initial)
80%
Pression (MPa)
150
70%
100
60%
50% 50
40% 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Temps (minutes)
200
(% du volume initial)
80%
Pression (MPa)
150
60%
100
40%
20% 50
0% 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Temps (minutes)
138 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.1.3.1 Évolution du volume moyen des cellules en fonction de la viabilité
La Figure 29 présente les variations du volume moyen des cellules de
Saccharomycopsis fibuligera pendant un traitement haute pression en fonction
du temps. Les volumes moyens des deux sous-ensembles identifiés après retour
à pression atmosphérique sont aussi calculés : les cellules viables, non teintées
par la coloration et celles inactivées qui, elles, sont perméables au colorant.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLUME CELLULA IRE SOUS HAUTES PRESSIONS 139
Figure 31: Cinétiques de variation du volume moyen de cellules de Saccharomycopsis
fibuligera lors d'un second cycle de pression à 250 MPa/15 mn.
110%
250
100%
Volume cellulaire relatif
90% 200
(% du volume initial)
Pression (MPa)
80% 150
70%
100
60%
50
50%
40% 0
0 5 10 15 20 25 30
Temps (minutes)
140 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.1.3.3 Évolution du volume moyen lors d'un second cycle de traitement
Un cycle supplémentaire de pression, effectué sur les mêmes cellules, a permis
de vérifier l'action de la pression sur le volume des levures inactivées. Les
variations observées sont présentées Figure 31, où elles sont réparties en trois
ensembles : les cellules viables, les cellules viables avant et inactivées après le
second traitement et les cellules mortes avant le traitement. Pour les deux
premières populations, la cinétique de variation de volume est conforme à celle
obtenue lors du premier cycle. Les cellules inactivées, par contre, ne subissent
pas de variations de volume, si ce n'est une légère diminution initiale du volume
attribuée à la compression.
Conclusion
Ces résultats montrent une variation du volume cellulaire des levures, une partie
(10 %), due à la compression, est réversible, l'autre partie (de 0 à 50 %) est en relation
avec l'inactivation des levures et est irréversible. Cependant, même si ces expériences
ont l'avantage de suivre chaque cellule individuellement durant l'ensemble du
traitement, elles sont réalisées sur de très faibles échantillons (moins de 50 individus).
C'est pourquoi une vérification des conclusions obtenues sur cellules fixées a été
effectuée sur un échantillonnage significatif de la population.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 141
Figure 32 : Évolution du volume de la population de Saccharomycopsis fibuligera pendant un
traitement à 250 MPa/15 mn.
Population initiale
Population à 250 MPa après 15 mn
Population après traitement
20%
(% de la population échantillonnée)
18%
16%
14%
12%
10%
Fréquence
8%
6%
4%
2%
0%
142 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPOSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.2 Variations du volume cellulaire d'une population microbienne
L'échantillonnage de la population de levures a tout d'abord été effectué aux moments
clés du traitement observés (cf. Figure 27) :
avant traitement,
après 15 mn à 250 MPa,
après traitement.
La relation entre volume et viabilité a ensuite été vérifiée à pression atmosphérique en
comparant les distributions avant et après traitement. Les modifications des conditions
de traitement ont enfin permis de confirmer cette relation.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 143
Figure 33 : Évolution du volume cellulaire de la population de Saccharomycopsis fibuligera
avant et après un traitement à 250 MPa/15 mn en fonction de la viabilité finale.
18%
16%
14%
12%
10%
Fréquence
8%
6%
4%
2%
0%
5 12 34 92 250 678
Classes de volumes de S. fibuligera (m3)
144 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Cette expérience confirme donc la diminution irréversible du volume de levures après
un traitement de 250 MPa/15 mn. Cependant la Figure 29 montre, sur cellules fixées,
une rétraction est essentiellement due aux cellules inactivées, ce qui n'apparaît pas sur
la distribution finale observée : la population n'est pas bimodale.
Ces résultats confirment donc la relation entre viabilité et diminution de volume final
mise en évidence sur les cellules fixées (cf. § C.1.1.3.C.1.1.3.4 p. 141). Les variations
obtenues pour chaque sous-population sont cependant différentes pour chaque
protocole. La rétraction des cellules viables apparaît plus importante par
échantillonnage de la population. Cet écart peut être dû à la méthode de détection de
viabilité (automatique pour la population), mais aussi au fait que seules quelques
cellules particulières sont choisies lors d'un suivi individualisé de volume.
Le volume moyen obtenu par échantillonnage constitue une valeur plus représentative
des phénomènes affectant l'ensemble de la population.
La variation du volume cellulaire moyen ainsi obtenue peut être pour les levures un
indicateur de l'efficacité d'inactivation du traitement haute pression.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS HAUTES PRESSIONS 145
Figure 34 : Évolution du volume cellulaire moyen final de Saccharomycopsis fibuligera en
fonction du niveau de pression et du temps de séjour.
110% 120%
90% 80%
80% 60%
70% 40%
60% 20%
50% 0%
Témoin 0 2,5 5 7,5 10 15
Temps à la pression nominale (minutes)
146 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.2.3 Évolution du volume cellulaire final moyen suivant les conditions de traitement
Afin de vérifier la relation viabilité-volume, des mesures du volume de populations
après différents traitements ont été réalisées. Seule la moyenne a été représentée car
les expériences précédentes montrent que toutes les classes de volume sont affectées
de la même façon. L'évolution de la moyenne constitue donc une bonne estimation de
la diminution de volume de la population.
L'influence sur le volume cellulaire de deux facteurs étudiés ci-dessus (cf. § B.B.1
p. 115 et § B.2.B.2.1 p. 121) a été successivement mesurée.
C.1.2.3.1 Évolution du volume cellulaire moyen final en fonction du temps sous pression
La Figure 34 montre l'évolution du volume final moyen des cellules de
Saccharomyces cerevisiae en fonction du temps sous pression.
La diminution du volume final est bien corrélée à la perte de viabilité des
levures provoquée par l'augmentation du temps de maintien en pression. En
négligeant la variation de volume des cellules viables, le volume des cellules
mortes peut être calculé à partir du volume moyen de la population. La
contraction ainsi obtenue est d'environ 25 % quel que soit le traitement
considéré.
Ce calcul confirme donc que les variations des volumes moyens observées sur
l'ensemble d'une population sont dues à l'augmentation de l'inactivation cellulaire.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 147
Conclusion
148 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COU RS D'UN TRAITEMENT H AUTE PRESSION
C.2 Analyse du volume cellulaire de cellules humaines sanguines
Les expériences ont été réalisées sur des cellules sanguines humaines issues de
tumeurs (lignée K562). Ces cellules ont l’avantage de se cultiver facilement et d’être
relativement résistantes aux facteurs externes. Elles constituent de plus un matériel
intéressant pour l’étude microscopique, du fait de leur taille comprise entre 10 et
20 µm de diamètre.
Le protocole retenu pour ces expérimentations est identique à celui utilisé pour les
levures à l'exception de quelques modifications :
la fixation s'est avérée superflue, car les cellules, attirées par gravité à la surface du
saphir inférieur, sont suffisamment adhérentes pour ne pas être entraînées par le
flux créé par la compression du milieu,
la température de la chambre doit être élevée afin de maintenir une température du
milieu proche de 37°C à l'intérieur de la chambre d'observation,
un nombre moins important de cellules peut être analysé pour chaque expérience
car les cellules sanguines sont beaucoup plus grosses et la concentration cellulaire
moins importante. Cette diminution du nombre d'informations est en partie
compensée par la meilleure qualité des images.
Seules des mesures sur cellules individuelles ont été effectuées, car un échantillonnage
de ce type de cellule implique un nombre d'images très élevé. L'augmentation de la
concentration cellulaire par dépôt d'un volume de culture plus grand entraîne une
agrégation naturelle des cellules qui empêche toutes mesures.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 149
Figure 35 : Évolution du volume moyen des cellules K562 en fonction de la pression
120%
115%
(% du volume cellulaire initial)
110%
Volume cellulaire relatif
105%
100%
95%
90%
85%
80%
0 50 100 150 200 250 300
Pression (MPa)
150 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAU TE PRESSION
Figure 36 : Cinétique de l'évolution du volume de cellules K562 pendant un traitement haute
pression (250 MPa/15 mn)
1,3
250
1,2
(% du volume cellulaire initial)
200
1,1
Volume cellulaire relatif
Pression (MPa)
1
150
0,9
0,8 100
0,7
50
0,6
0,5 0
0 5 10 15 20 25
Temps (minutes)
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 151
C.2.1 Évolution du volume de cellules K562 dans un milieu isoosmotique
Dans un premier temps, les cellules ont été traitées en utilisant du milieu RPMI
(cf. C.C.3 p. 91) comme fluide de pressurisation. La variation de volume
observée a été analysée, comme pour les levures, en deux parties : tout d'abord
pendant l'élévation de pression, puis lors d'un cycle complet.
C.2.1.1 Variation du volume des cellules K562 lors d'une élévation de pression
L'évolution du volume moyen des cellules durant l'élévation de pression est
présentée Figure 35. Contrairement aux résultats obtenus avec les levures, le
volume moyen des cellules K562 augmente d'un peu moins de 10 % avec un
bon intervalle de confiance. Cette variation paradoxale n'est pas justifiée par
une compression du contenu cellulaire. En effet, si la compression du volume
cellulaire initial est proche de celle du milieu, une élévation de 250 MPa devrait
provoquer une contraction d'environ 8 %.
C.2.1.2 Variation du volume des cellules K562 lors du maintien à 250 MPa pendant 15 mn
Comme pour les levures, des études ont été menées afin de suivre le comportement
des cellules K562 pendant le temps de maintien sous pression. Ces cellules offrent à
l'observation visuelle un comportement morphologique caractéristique, là où les
levures ne montrent aucune modification apparente.
152 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Figure 37 : Images de cellules K562 lors d'un traitement haute pression dans un milieu
isoosmotique.
Cellules avant traitement (0,1 MPa - 0 mn) Cellules sous pression (250 MPa - 10 mn)
Cellules sous pression (250 MPa - 15 mn) Cellules après traitement (0,1 MPa - 20 mn.)
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 153
Pendant le temps de maintien sous pression, les cellules changent brusquement
d'aspect (cf. Figure 37) les unes après les autres. Initialement sphériques avec
des contours bien définis, elles évoluent spontanément vers une forme floue
difficile à focaliser avec le microscope. En présence de colorant vital, ces
cellules altérées se concentrent rapidement et deviennent opaques (cf. Figure
37). Elles sont donc vraisemblablement mortes. La rapidité du changement et la
diminution apparente du volume cellulaire rapprochent ce phénomène d'une
rupture membranaire.
Les résultats de l'analyse d'images n'ont pas été représentés sous forme de moyenne
car ce changement d'aspect se traduit par une diminution du volume cellulaire non
simultané de toutes les cellules. De plus, après cette inactivation brutale, l'évolution du
volume, quand elle est possible, n'est pas toujours précise car la cellule ne peut être
focalisée convenablement. La variation de volume consécutive à cette inactivation
brutale est représentée sur la Figure 36.
Ces résultats montrent qu'une partie des cellules reste viable et maintient un
volume constant (105 % du volume initial) au cours d'un séjour à 250 MPa
pendant environ 15 mn. De retour à pression atmosphérique, le volume
cellulaire final n'est pas significativement différent de l'initial. L'expansion liée
à l'élévation de pression apparaît donc dans ce cas réversible.
Les variations de volume des cellules K562 contrastent avec les résultats
obtenus sur les levures :
augmentation de volume lors de l'élévation de pression,
rétraction brutale lors de l'inactivation.
La variation de volume initiale, apparemment en contradiction avec le principe
de LE CHATELIER, implique une entrée de matière mais aussi une tension plus
importante sur la membrane. Afin de vérifier les conséquences de ce transfert
de masse, la tension initiale de la membrane a été augmentée par un léger choc
hypoosmotique précédant le traitement haute pression.
154 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Figure 38 : Évolution du volume de cellules K562 après un choc hypoosmotique d'activité de
l'eau de 0,982 à 0,995.
250%
200%
Volume cellulaire relatif
(% du volume initial)
100%
50%
Choc osmotique
aw 0,982 à 0,995
0%
0 50 100 150 200
Temps (secondes)
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 155
Figure 39 : Cinétique de variation du volume de cellules K562 lors d'un traitement haute
pression (250 MPa/15 mn) suite à un choc hypoosmotique, d'activité de l'eau de
0,982 à 0,988.
150%
250
140%
130%
200
Volume cellulaire relatif
120%
(% du volume initial)
Pression (MPa)
70% 50
60%
50% 0
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Temps (minutes)
156 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.2.2.1 Analyse préliminaire de l'effet d'un choc hypoosmotique à pression atmosphérique
C.2.2.2 Effet d'une élévation de pression hydrostatique sur des cellules K562 en milieu
hypotonique
Une élévation de pression hydrostatique a donc été appliquée immédiatement après un
choc hypoosmotique modéré (aw = 0,988).
Les variations de volume provoquées par les différents traitements sont
représentés Figure 39. Le changement d'aw du milieu induit donc une variation
de volume de 20 %. L'élévation de pression provoque, comme en milieu
isotonique (cf. Figure 35 p. 150), une augmentation supplémentaire du volume
d'environ 15 %. Après 4 mn à 250 MPa, les cellules "explosent" toutes à
quelques secondes d'intervalle. Le changement de morphologie observé
(cf. Figure 40) dans ce cas est tout aussi brusque que le précédent (cf. Figure
37 p. 153) mais s'apparente davantage à l'éclatement observé par choc
hypotonique.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 157
Figure 40 :Images de cellules K562 lors d'un traitement haute pression dans un milieu
hypoosmotique.
Cellules avant traitement (0,1 MPa - 0 mn) Cellules sous pression (250 MPa - 3 mn)
Cellules sous pression (250 MPa - 8 mn) Cellules sous pression (250 MPa - 8 mn 30s)
158 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Après 5 mn à 250 MPa; il ne reste plus que des enveloppes cellulaires vides qui,
contrairement à l'inactivation en milieu isotonique, ne concentrent pas le colorant
vital.
Malgré la faible aw du milieu, la pression provoque donc une augmentation du volume
des cellules K562. En considérant la compression physique du milieu, cette
augmentation de volume représente un transfert de masse inférieur à 50 % du volume
cellulaire initial en milieu isotonique.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLUME CELLULA IRE SOUS HAUTES PRESSIONS 159
Figure 41 : Variation de volume de sphéroplastes de Saccharomyces cerevisiae lors d'un
traitement 250 MPa/15 mn.
130% 300
120%
250
110%
100% 200
Volume cellulaire relatif
Pression (MPa)
(% du volume initial)
90%
150
80%
70% 100
60%
50
50%
40% 0
0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 22,5 25
Temps (minutes)
160 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.3 Analyse du volume de sphéroplastes de levures
Afin de mieux comprendre les causes des variations observées dans les deux
paragraphes précédents, la paroi des levures a été digérée par action enzymatique
(cf. § C. p. C.291). Les levures prennent alors une forme parfaitement sphérique.
Le suivi du volume sur ces sphéroplastes présente de nombreuses difficultés, il est en
effet impossible de les fixer au saphir et le contraste de la membrane est bien inférieur
à celui de la paroi.
Ces observations sont particulièrement intéressantes car elles font le lien entre les
observations recueillies sur les cellules sanguines et sur les levures. Les sphéroplastes
ont un comportement intermédiaire aux deux types cellulaires précédemment
analysés :
une légère augmentation de volume pendant l'élévation de pression,
pas de chute brutale du volume pendant le temps de maintien sous pression.
Cependant la faible qualité des images ne permet pas dans l'immédiat de conclure sur
les transferts de masse de ce matériel cellulaire.
Il apparaît donc que la compression de la paroi évite un transfert de masse simultané à
l'élévation de pression. Une compression comparable a été attribuée à la membrane
plasmique dans toutes les expériences, compression parfois masquée par un transfert
de masse. Étant donné l'importance de la membrane lors de ces variations de volume,
il nous a paru indispensable de vérifier cette compression sur un modèle pour lequel
aucun transfert osmotique ou diffusionnel ne peut être induit par la pression.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 161
Figure 42 : Évolution du volume de liposomes fabriqués à partir de phospholipides de jaune
d'oeuf, avec ou sans cholestérol, en fonction de la pression.
110%
100%
(% du volume initial)
Volume relatif
90%
80%
70%
60%
0 50 100 150 200 250 300
Pression (MPa)
162 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPOSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.4 Analyse du volume de liposomes individualisés
Les expériences précédentes mettent en évidence l'importance de la membrane dans
les transferts provoqués par la pression, notamment chez la cellule sanguine dont la
membrane, sans protection pariétale, est très sensible aux variations de volume. Une
élévation de pression en milieu légèrement isotonique entraîne apparemment une
rupture membranaire (cf. Figure 40).
Afin de préciser le rôle mécanique de la membrane, une investigation a été réalisée sur
des liposomes de grande taille, pourestimer le rôle de la bicouche phospholipidique
lors du maintien en pression et d'observer d'éventuelles différences de compressibilité
entre la bicouche et le milieu interne. L'observation de liposomes sous pression est
beaucoup plus difficile que celle des levures car, comme les sphéroplastes, ils ne
peuvent être fixés à la fenêtre de saphir. De plus, leur densité est proche de celle du
milieu, ils sont donc facilement entraînés par le flux créé par la compression. Seuls les
liposomes d'une taille suffisamment élevée (> 5 µm de diamètre) peuvent être pris en
compte, or ils constituent la partie minoritaire de l'échantillon. Deux liposomes d'une
taille comparable sont donc rarement dans le même champ microscopique, la
focalisation ne peut s'effectuer alors que sur un seul, voire deux. Ces expériences ont
été réalisées sur des liposomes à base de phospholipides du jaune d'oeuf avec et sans
cholestérol (cf. § C.C.4 p. 92).
Les variations de volume de ces deux types de liposomes ont été analysées d'abord
pendant l'élévation de pression (compression), puis pendant le maintien et le retour à
pression atmosphérique.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 163
La diminution de compressibilité observée à 150 MPa sur les liposomes sans
cholestérol peut être attribuée à un changement de phase
Les phospholipides étant à température et à pression ambiantes dans une phase
liquide-cristalline (LC), ils peuvent sous l’influence de paramètres physiques évoluer
vers une phase gel. Or, la compressibilité des phospholipides est plus importante en
phase liquide-cristalline qu'en phase gel (BÖTTNER et al. 1994). Pour les lipides
considérés, cette transition a théoriquement lieu entre - 10°C et 0°C à pression
atmosphérique. L'augmentation de pression élevant la température de transition de 17
à 22°C pour 100 MPa, la transition de phase a donc théoriquement lieu entre 150 MPa
et 200 MPa, ce qui confirmerait cette interprétation.
164 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Figure 43 : Évolution d'un liposome à base de phospholipides du jaune d'oeuf au cours de deux
cycles de pressurisation-détente.
A - (0,1 MPa - 0 mn) B - (300 MPa - 4 mn) C - (250 MPa - 6,5 mn)
D - (225 MPa - 7 mn) E - (100 MPa - 8,5 mn) F - (0,1 MPa - 9,5 mn)
G - (120 MPa - 10,5 mn) H - (300 MPa - 11,5 mn) I - (0,1 MPa - 16 mn)
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 165
Figure 44 : Modèle géométrique simplifié utilisé pour l'analyse de liposomes "bourgeonnant".
4 h 2 h 3
Vcalculé R 3 r 2 l r
3 2 3 6
Scalculé 2R 2 R h 2r r h
r2 1 r
S projection R 2 2rh R 2 arcsin r ( R h)
2 2 R
l L R r R2 r 2
h R R2 r 2
130% 350
300
120%
250
(% du volume initial)
110%
Pression (MPa)
Volume relatif
200
100%
150
90%
100
80% 50
70% 0
-4 1 6 11 16
Temps (minutes)
166 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAU TE PRESSION
C.4.2 Modifications morphologiques lors du retour à pression atmosphérique
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 167
cryofracture une discontinuité dans une membrane mitochondriale lors d’un traitement
à 170 MPa, attribuée à une séparation de phase de la membrane lipidique (WATTIAUX
DE CONINCK et al. 1980). Ces discontinuités ou diminutions locales du rayon de
courbure, bien que de moindre importance, semblent comparables aux modifications
observées sur les liposomes.
L'affirmation d'une relation entre transition de phase et modification de forme est
confirmée par le maintien de la forme sphérique de liposomes contenant du
cholestérol, tout au moins jusqu'à 350 MPa. De plus, à pression atmosphérique, il
existe des descriptions de vésiculation suite à la diminution de température
(STEPONKUS et LYNCH 1989) attribuée à une transition de phase.
Des "ondulations" de la membrane ont été mises en évidence sur des liposomes suite à
l'addition d'alcool (NAGEL et al. 1992). Dans ce cas, les déformations sont attribuées à
une modification structurale de la bicouche lipidique (transition de la phase gel à une
phase gel interdigité) provoquant une séparation entre les phospholipides de chaque
phase. Cette séparation est décrite comme responsable des "ondulations"
membranaires.
Il est donc probable que le phénomène observé soit la conséquence d'une séparation de
phase lipidique durant une transition (soit LC à gel, soit gel à gel interdigité). Cette
transition a lieu durant l'augmentation de pression, mais elle ne peut s'observer du fait
de la forte compaction des phospholipides imposée par la pression. Par contre, la
diminution de pression entraîne une modification de la forme des liposomes car, les
différentes phases n'ayant pas les mêmes propriétés (compressibilité, tension de
surface), leur expansion est différente durant la détente. Ce processus aboutit à des
formes stables à pression atmosphérique bien que ces liposomes soient à nouveau
homogènes. En effet, MICHALET et coll. montrent par des modèles mathématiques que
la sphère n’est pas la seule forme à minimiser l’énergie de courbure (MICHALET et al.
1994).
Conclusion
Ces expériences sur les liposomes ont permis de décrire le comportement de la
bicouche lipidique sous l'action de la pression. Une diminution de volume consécutive
168 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
à l’augmentation de pression a été observée, elle est comparable à celle de l'eau ou à
celle des levures pour les mêmes pressions.
Des phénomènes morphologiques caractéristiques en relation avec une séparation de
phase ont été mis en évidence. En l'absence de cholestérol, la diminution de pression
induit une rupture de symétrie du liposome et la formation d'une excroissance
caractéristique. Une corrélation avec des analyses structurales est cependant nécessaire
à une description complète du phénomène. Malgré les nombreuses différences qui
existent entre les membranes cellulaires et les liposomes, la plupart des phénomènes
observés ont aussi été décrits sur des membranes à pression atmosphérique ou sous
pression (MACDONALD 1984; BRAGANZA et WORCESTER 1986b). Ces changements et
séparations de phases peuvent avoir, au niveau cellulaire, des conséquences très
importantes : perméabilisation passive, fragilité mécanique, modification des enzymes
membranaires. Cette expérience semble bien identifier la membrane comme cible
privilégiée des hautes pressions.
PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 169
170 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
PARTIE II : Causes et conséquences de la
variation de volume
Les résultats de l'expérimentation conduite sur les levures ont mis en évidence une
variation de volume qui se décompose en :
une variation due à la compression durant l'élévation de la pression qui est
semblable celle obtenue sur les liposomes,
une variation durant le temps de maintien sous pression due à un transfert de masse,
encore appelé flux de volume (Jv).
Chez les cellules sanguines, ces deux variations semblent se contrarier car les
phénomènes impliqués sont différents.
En supposant que ces flux de matière et de chaleur sont découplés, les transferts de
matière peuvent être décrits par la relation :
1 ~ dni
Smatière ( 61 )
T0 i dt
i
Le flux de chaleur est lié à la pression alors que le flux de matière n'en dépend pas
directement.
Ces flux correspondent à des variations du volume cellulaire : une compression
physique et une contraction due à un transfert de masse.
Nous nous proposons donc d'interpréter successivement ces deux variations du volume
cellulaire ainsi que leurs relations avec la viabilité cellulaire.
172 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPOSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
A Causes de la variation du volume cellulaire
pendant l'élévation de pression et relation avec
la viabilité
La variation de volume relevée chez les levures lors d'une augmentation de pression se
mesure par analyse d'images. Pour un niveau de 250 MPa, la diminution du volume
cellulaire est comprise entre 10 et 15 % du volume initial. De nature physique, elle ne
dépend que du niveau de pression utilisé (cf. Figure 26 p. 132). En effet, une variation
similaire est obtenue sur des levures mortes (cf. Figure 31 p. 140) et sur des liposomes
(cf. Figure 42 p. 162).
Cette variation de volume est apparemment sans conséquence pour la cellule car
elle est réversible et une variation rapide de pression au niveau considéré
n'entraîne pas de destruction cellulaire immédiate chez Saccharomyces cerevisiae.
Ce paramètre est cependant important car il représente le résultat macroscopique de la
variation de pression sur l'objet étudié. Nous nous proposons donc d'étudier ici
l'influence éventuelle de cette diminution de volume sur la viabilité, puis les bases de
cette relation.
Cette étude portera uniquement sur les levures car les données de viabilité sur les
cellules sanguines sont peu nombreuses et la compression physique de ces cellules est
apparemment masquée par un transfert de masse.
Si l'on considère le système constitué par la cellule fermé et non réactif durant
l'élévation de la pression, la compression isotherme définie par ( 57 ), peut se réduire
ainsi :
dV
T dP ( 62 )
V
174
La variation de volume de 15 % constatée sur les levures peut servir d'inducteur au
transfert de masse obtenu durant le maintien sous pression, alors qu'une compression
plus faible obtenue à un niveau de pression moindre ou par une concentration plus
élevée du milieu serait moins pénalisante pour la cellule.
De plus, une liaison entre compression du milieu et viabilité cellulaire apparaît
clairement :
Différentes solutions aqueuses de glycérol, sorbitol, fructose, NaCl et urée ont été
préparées jusqu'à saturation de la solution. Des concentrations importantes (fractions
molaires comprises entre 1 et 90 %) ont été utilisées car la précision du système de
mesure (cf. § F.F.3 p. 104) est insuffisante. Il est en effet impossible de mesurer ainsi
une différence d'évolution volumique entre de l'eau et des solutions à très faible
concentration, donc a fortiori d'obtenir la compressibilité apparente partielle du soluté
avec une grande précision.
PARTIE II : CAUSES ET CONSEQU ENCES DE LA VARIATIO N DE VOLUME 175
Figure 46 : Variations du volume relatif de différentes solutions aqueuses d'urée, de glycérol,
de fructose, de NaCl et de sorbitol à 400 MPa en fonction de la fraction molaire en
soluté.
11%
Variation relative de volume ([V0-V]/V0) à 400 MPa
10%
Urée
9%
Glycérol
Sorbitol
NaCl
8%
Fructose
7%
0.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0%
Fraction molaire
Les coefficients de cette équation sont obtenus par régression linéaire. Cette équation
permet aussi une estimation de la compressibilité à toutes les pressions :
B0
T ( 64 )
BP ( BP P )
Les résultats numériques de cette expérience ainsi que les paramètres de l'équation
( 29 ) ont été regroupés dans le Tableau 11.
Il est possible à partir de ces données d'obtenir la compression d'une solution de
concentration quelconque par interpolation.
Vapp Vi VSh VSw nh0 hS Sw nh ( 65 )
Conclusion
La compression du milieu intracellulaire estimée par la concentration isoosmotique de
glycérol intracellulaire est un paramètre prédictif de la viabilité après un traitement
haute pression. Cette relation est valable quel que soit le soluté ou le niveau de
pression utilisé mais pour un temps de traitement donné. La compression induit donc
des perturbations agissant avec un certain retard.
J v Lp P Lp P RTcs
( 66 )
J s Ps cs 1 cs J v
De nombreux auteurs ont utilisé ces équations afin de caractériser la réponse cellulaire
à un stress hydrique (MARECHAL 1992).
Une cellule ne contrôle pas directement ses flux d’eau du fait d’une forte perméabilité
naturelle de la bicouche lipidique et de l’absence de « pompes à eau ». Il existe
pourtant des pores aquifères dont le rôle essentiel est de permettre un passage d’eau
plus rapide notamment lors de chocs osmotiques.
Les flux d’eau sont donc régulés au niveau cellulaire par des flux de solutés. Des
différences de concentrations entre les milieux intra et extracellulaires sont maintenues
par un équilibre entre transport actif, transport couplé ou facilité et perméabilité
passive.
Une pression supérieure à 200 MPa inactive ou déprime fortement tous les transports
actifs. La cellule ne peut donc plus réguler ses transferts de matières qui sont alors
déterminés par :
PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 185
les conditions initiales, c’est-à-dire la différence de potentiel généralisé entre le
milieu de pressurisation et le milieu intracellulaire (, Cs, ) et son évolution
en fonction de la pression,
la perméabilité de la membrane (Ps, ) et son évolution sous pression. Cette
perméabilité conditionne la cinétique des différents flux, notamment les flux de
solutés.
La variation de volume observée dans les expériences précédentes correspond au flux
de volume qui peut être assimilé en valeur en raison de la forte teneur en eau du
système, à un flux d’eau ( J v JiVi J wVw ).
Pour expliquer ces flux, il est nécessaire de connaître les éventuels flux de solutés
induits par le maintien sous une pression hydrostatique élevée.
1 8C6A U S E S D E L A VA R I A T I ON DU VO L U ME C EL L UL A I R E PE N D A NT L E M AI NT I EN SO US PR E S S I ON ET R E L A T ION A VE C L A VI A B I LI T E
Figure 50 : Sortie d'ions du milieu intracellulaire de levures et viabilité suite à un traitement
haute pression.
Ca++ Na+ K+
Viabilité cellulaire (coloration)
6 100%
90%
(% de cellules viable)
5 80%
(g/108 cellules)
Sortie d'ions
4 70%
60%
3 50%
40%
2 30%
1 20%
10%
0 0%
Témoin 2,5 7,5 15
Temps à 200 MPa (minutes)
188 CONCLUSION
En s'appuyant sur les flux de volume mis en évidence par l'analyse d'images et les flux
de solutés mentionnés dans la bibliographie et confirmés expérimentalement pour les
levures, les transferts de masse transmembranaires peuvent être expliqués à travers
deux hypothèses :
1. une modification de la perméabilité membranaire largement abordée dans la
bibliographie (transfert diffusionnel),
2. une modification de la différence de pression osmotique entre le milieu
intracellulaire et le milieu extracellulaire (transfert osmotique).
Les pressions de turgescence sont très variables suivant les espèces (ZIMMERMANN
1978), le type de paroi mais aussi l'état physiologique des cellules. Du fait de la
difficulté de l'estimation de ce paramètre, seules de rares mesures pertinentes ont été
réalisées sur les levures. MARECHAL, avec une technique de microscopie couplée à un
système d'analyse d'images, obtient pour Saccharomyces cerevisiae des pressions de
turgescence comprises entre 0,28 MPa et 2,31 MPa (MARECHAL 1992).
De même, à l'aide de variations de la pression osmotique, des études permettent de
calculer un module d'élasticité de la paroi : 2 à 7 MPa sur Saccharomyces cerevisiae
(CONWAY et DOWNEY 1961), de 0,9 à 8,5 MPa sur Chlorella emersonii une algue
unicellulaire à paroi (MUNNS et al. 1983). En considérant la cellule comme une sphère
homogène, le module d'élasticité peut être relié à sa géométrie suivant la relation :
e
( 68 )
r
Si cette relation permet de décrire des variations d'élasticité obtenues suivant l'âge et le
stade physiologique de la cellule, elle est insuffisante pour décrire la forte diminution
de ce coefficient lorsque l'aw du milieu est élevée (MUNNS et al. 1983).
190 CONCLUSION
B.2.1.2 Déplacement de l'équilibre osmotique par diffusion d'un soluté
Afin d'évaluer l'impact de la fuite de solutés sur la chute de volume et de simplifier
l'expression, la pression osmotique de la cellule sera attribuée à un seul soluté (indice
SI) susceptible de diffuser à travers la membrane sous l'effet d'une augmentation de
pression. De même, l'activité de l'eau du milieu extérieur sera attribuée uniquement à
un soluté (indice SE.).
A partir de l'équation ( 68 ), l'équilibre mécanique cellulaire peut être décrit ainsi :
V V0
I E RT ( SI cSI SE cSE ) ( 69 )
V0
où E, I sont les pressions du milieu extracellulaire et du milieu intracellulaire (en
Pa),
E, I sont les coefficients osmotiques pratiques des solutés extracellulaires et
intracellulaires,
cSE, cSI sont les concentrations molaires des solutés extracellulaires et
intracellulaires (en mol.m-3).
Cette équation n'est valable que si le module d'élasticité reste constant. La résolution
de l'équation ( 70 ) en fonction du volume final V aboutit rigoureusement à une
équation du second degré ; par contre en négligeant la variation de concentration due à
n n dn dn
la variation de volume soit dc l'équation ( 70 ) devient :
V b V dV b V
V0
dV RT SI dnSI SE dnSE ( 71 )
(Vi b)
où b représente la partie du volume n'intervenant pas dans les échanges osmotiques
(en m3),
dnSI, dnSE sont les variations élémentaires du nombre de moles de solutés dans la
cellule (en mol),
Vi, le volume cellulaire initial.
D'après la relation ( 72 ), la fuite de soluté par diffusion peut donc entraîner une
diminution de volume conséquente. L'ampleur du flux de volume dépend de la
quantité de soluté pouvant diffuser et de l'activité de l'eau du milieu externe :
Si la sortie de soluté reste inférieure à la pression de turgescence, la variation de
volume est créée par la détente élastique de la membrane qui s'équilibre avec la
pression osmotique interne. Pour une fuite de soluté donné, l'amplitude de la
variation dépend du module d'élasticité () et de la pression de turgescence. Ces
deux paramètres diminuent lorsque l'aw du milieu est abaissée (MUNNS et al. 1983).
Si la fuite de soluté est plus forte que la pression de turgescence ou si la pression de
turgescence est nulle, la sortie de soluté provoque alors une diminution du potentiel
hydrique interne qui devient inférieur à celui du milieu extérieur. Ce différentiel
entraîne pour des raisons osmotiques une sortie d'eau mais aussi une éventuelle
rentrée de soluté dépresseur, similaire au cas d'une rampe de pression osmotique
externe (MARECHAL et al. 1995b). La chute de volume dépendra dans ce cas des
vitesses de diffusion du soluté dépresseur à l'intérieur de la cellule.
Dans les différentes expériences d'analyse du volume cellulaire, le milieu est soit de
l'eau distillée (cellules fixées), soit du milieu de culture à une aw supérieure à 0,997
(population). Les mesures de relargage d'ions ont aussi été réalisées dans de l'eau pure.
La variation de volume est donc décrite par le premier cas.
192 CONCLUSION
B.2.1.3 Application aux résultats expérimentaux obtenus
Un calcul a été effectué à partir de l'équation ( 71 ) et des résultats de sortie d'ions
(cf. Figure 50) afin de déterminer les transferts de matières susceptibles d'être induits.
Les valeurs initiales choisies ont été calculées lors de rampes osmotiques (MARECHAL
1992) :
V b
i 0,5 MPa , 2,4 MPa , 1 , 60 % ,Vi 150 m3
V
Avec ces valeurs, dans de l'eau distillée, une diminution moyenne de 6 % est obtenue
pour l'ensemble de la population à partir des fuites d'ions analysées après 15 mn à
200 MPa (cf. Figure 50 p. 187). Par contre, si le volume des seules cellules inactivées
diminue, la variation entraînée par la fuite de Na+, K+ et Ca2+ et des anions
correspondants est de 12 %. Cette valeur est encore inférieure à la variation de volume
observée, cependant seuls trois ions ont été pris en compte dans cette approche alors
que SHIMADA et coll. montrent que cette perméabilisation s'étend aux acides aminés et
à d'autres substances dont l'effet osmotique n'est pas négligeable (SHIMADA et al.
1993).
D'ailleurs un calcul similaire sur la base des concentrations de solutés obtenues par ces
auteurs conduit à une variation de volume moyen de 20 % qui représente la perte de la
pression de turgescence ( étant considéré constant).
Cette variation reste inférieure à celle observée par analyse d'images, probablement
parce que la valeur de dans de l'eau distillée est inférieure à celle choisie (déterminée
à partir d'une aw de 0,99 (MARECHAL 1992)).
Dans l'eau, la perte de la pression de turgescence signifie que le milieu intracellulaire
est extrêmement dilué et donc que le volume de la cellule est uniquement déterminé
par l'équilibre mécanique de la paroi, la perte de matériel cellulaire ne modifiant en
rien son volume final.
La cinétique de la sortie de soluté peut être reliée à celle de la variation de volume en
rapportant la variation obtenue en ( 71 ) par unité de temps et en supposant que le
soluté extracellulaire ne rentre pas dans la cellule :
dn SI Vi b dV
. ( 73 )
dt V0 RT SI dt
où CSI est la différence de concentration entre le milieu intra et extra cellulaire (en
mol.m-3), cette différence est égale à la concentration intracellulaire (CSI) si l'on
suppose le milieu extracellulaire suffisamment dilué;
A, la surface de la membrane cellulaire (en m2),
kSI, le coefficient de perméabilité cellulaire au soluté intracellulaire (en m.s-1).
La variation moyenne du volume des cellules mortes représentée Figure 28 peut être
estimée à 30 % en 10 mn, soit pour un volume cellulaire moyen de 150 m3, une
variation de 0,075 m3.s-1. En supposant la surface cellulaire constante et égale à
130 m2, la valeur de perméabilité obtenue est d'environ 10-11 m.s-1. Cette valeur est
du même ordre de grandeur que celle obtenue pour un soluté perméant comme le
glycérol (BERNER 1994a).
Dans le cas extrême où il y a rupture de membrane, l'eau et les solutés sortent
ensemble pour des raisons essentiellement mécaniques. Le volume final d'équilibre
doit être le même, la paroi délimitant toujours un volume du fait de sa rigidité.
Cependant la rapidité d'un tel phénomène ne semble pas coïncider avec les cinétiques
observées.
L'analyse de l'équilibre mécanique de la cellule et son application aux résultats
expérimentaux montre qu'il est possible d'interpréter la variation de volume par une
perméabilisation de la membrane cellulaire. Cette variation est directement liée à la
présence de la paroi qui autorise l'existence d'une différence de pression osmotique.
Les causes de cette perméabilisation sont évoquées au le paragraphe suivant.
194 CONCLUSION
B.2.2.1 Transport passif
Des pressions plus importantes (> 150 MPa) favorisent une transition de phase de la
bicouche de l'état liquide-cristallin à l'état gel. La température de transition dépend des
phospholipides considérés et est en général comprise entre 0 et 40°C pour des lipides
purs à pression atmosphérique (HEREMANS 1995). La pression augmente cette
transition de 20°C/100 MPa. Dans le cas de mélange de lipides et particulièrement
pour les membranes naturelles, cette transition de phase est moins marquée ("moins
coopérative").
Le changement de phase provoqué par augmentation de température sur des
liposomes, provoque une forte augmentation de la perméabilité à différents solutés
(saccharose, sodium) (PAPAHADJOPOULOS et al. 1973). Un phénomène similaire est
observé sur les membranes cellulaires aussi bien par augmentation de température
(HAEST et al. 1972) que par l'augmentation de pression (WATTIAUX DE CONINCK et al.
1980). Cette modification transitoire de la perméabilité serait liée à la séparation de
phase induite par la transition de phase : les lipides dans le même état se rassemblent,
formant des zones aux propriétés différentes. L'interface gel-LC serait responsable de
la plus grande perméabilité aux solutés.
Cette transition de phase a été mise en évidence expérimentalement par observation
microscopique de liposomes (cf. §. C.4 p. 163). Les phénomènes observés lors de cette
expérience montrent une forte perturbation structurale conduisant à une rupture de
symétrie et à une formation d'une vésicule stable à température ambiante.
Au niveau cellulaire de telles perturbations, si elles ont lieu, sont susceptibles de
modifier la structure de la membrane et ses fonctionnalités.
Equilibre
0,1 MPa 0 mn 100 % mécanique
Pt
Pressurisation
Sortie de solutés
Sortie d'eau
90 %
250 MPa 3 mn
90 %
Maintien 85 %
en pression
60 %
250 MPa 18 mn
Dépressurisation
90 %
0,1 MPa 21 mn
65 %
196 CONCLUSION
La transition de phase lipidique semble un phénomène prépondérant dans l'altération
de la membrane cellulaire et ses fonctions.
Conclusion
La variation de volume des levures peut être en partie expliquée par une sortie de
solutés accompagnée d'un flux d'eau. Cette fuite de solutés est attribuée à une
modification de la perméabilité membranaire.
L'augmentation de la diffusion passive permet d'expliquer les variations de volume des
levures inactivées. Les causes de cette perméabilisation ne sont pas encore
formellement établies, cependant les phénomènes membranaires de transition et de
séparation de phase, confirmés par l'observation morphologique des liposomes
(cf. § C.C.4 p. 163) pourraient largement contribuer à la sortie de solutés.
Cependant, les variations de volume ainsi calculées restent inférieures à celles
observées expérimentalement. De plus, ces phénomènes ne permettent pas a priori de
décrire l'augmentation de volume observée sur les sphéroplastes et sur les cellules
sanguines.
VwA VwB
Tw ( 75 )
P T ,ni Vw
La pression semble favoriser les interactions dans le sens d'une diminution de l'aw :
198 CONCLUSION
la compressibilité des solutés est en général inférieure à celle de l'eau, accentuant
ainsi l'écart de volume spécifique entre les solutés et le solvant,
l'hydratation implique en général une variation de volume négative et est donc
favorisée par la pression, c'est notamment le cas de l'électrostriction,
la pression hydrostatique favorise généralement la dissociation de solutés, ce qui
diminue l'activité de l'eau.
Une augmentation de la pression hydrostatique d'un milieu induit donc généralement
une augmentation de la pression osmotique due à la compressibilité de l'eau mais aussi
à l'augmentation des interactions eau-solutés.
Par contre, si l'on envisage une élévation de pression plus importante, cette variation
devient importante :
Pour 250 MPa et Vw 10 6 m3 . mol 1 (supposée constante sur l'intervalle)
a w ( p)
alors 0,9
a w (1)
200 CONCLUSION
B.3.3 Conséquence sur la viabilité cellulaire
Cette variation de pression osmotique semble avoir des conséquences mineures chez la
levure, capable de supporter des chocs hypoosmotiques plus importants.
Cependant, l'action combinée du froid et d'un choc hypoosmotique est décrite comme
destructrice, même pour des levures (ROSE 1976). Une action combinée similaire peut
être envisagée pour la pression hydrostatique.
Plus vraisemblablement, cette modification de la pression osmotique est susceptible
d'accentuer la sortie de soluté consécutive à la perméabilisation, décrite au paragraphe
précédent.
Conclusion
Même si la pression induit une variation de la pression osmotique non négligeable, il
semble que cet effet est mineur sur les levures au niveau des transferts de masse
observés sous haute pression. Tout au plus, peuvent-ils accélérer la sortie de soluté due
à la perméabilisation membranaire et accentuer la variation de volume.
Nous reprendrons brièvement pour les cellules sanguines les phénomènes analysés sur
les levures :
flux de solutés,
perméabilisation,
modification de la pression osmotique.
B.4.2 Perméabilisation
Les cellules sanguines n'ayant pas de paroi ne peuvent maintenir une différence de
pression osmotique entre le milieu interne et le milieu externe. Par contre, grâce à un
système de transport actif et de perméabilité sélective, les cellules maintiennent des
gradients de solutés (essentiellement des ions).
Ceux-ci entraînent un déséquilibre ionique entre le milieu intracellulaire et le milieu
extracellulaire appelé potentiel de membrane. Le Tableau 12 donne la composition
moyenne intra et extracellulaire d'une cellule de mammifère et montre un déséquilibre
apparent en charges électriques et en potentiel hydrique, compensé par la présence au
202 CONCLUSION
niveau cellulaire de composés chargés négativement (phosphates, protéines, acides
aminés, acides nucléiques).
L'analyse des variations de volume des cellules sanguines permet de proposer deux
interprétations de l'entrée d'eau observée par analyse d'image : une augmentation de la
pression osmotique interne simultanément à l'élévation de pression et/ou une diffusion
de Na+ plus rapide que la sortie de K+. Ces phénomènes sont susceptibles de
provoquer l'éclatement cellulaire en milieu hypoosmotique. En milieu isotonique, la
mortalité semble plutôt liée à une rupture de la membrane cellulaire dont les causes
restent à élucider.
204 CONCLUSION
Conclusion générale sur les causes de transferts de masse provoquées par
l'élévation de la pression
L'interprétation des phénomènes de transferts de masse observés sur les levures fait
apparaître le rôle essentiel joué par la membrane plasmique qui, altérée, devient plus
perméable aux solutés. La diminution du potentiel de turgescence serait alors
responsable de l'expulsion d'un flux d'eau et de la variation du volume.
Une augmentation de la pression osmotique due à l'élévation de pression hydrostatique
permettrait d'augmenter la pression de turgescence des levures et la diminution du
volume cellulaire consécutive à sa perméabilisation.
Des observations similaires de variation de volume cellulaire ont été observées par
augmentation de température (MARTINEZ DE MARANON, communication personnelle).
Une variation de volume de 20 % liée, comme pour la pression hydrostatique, à la
viabilité est observée aussi bien dans de l'eau pure que dans une solution à a w plus
faible. Dans les deux solutions la diminution de volume peut être attribuée à une
perméabilisation et/ou à une rupture de l'enveloppe conduisant à une perte de matériel
cellulaire. L'action de la pression semble plus modérée que celle de la température car
elle permet de préserver une grande partie des composés intracellulaires. Cette
particularité est exploitée pour les bactéries induisant la nucléation de la glace qui,
bien qu'inactivées par haute pression, gardent leur propriété physique (HONMA et al.
1993).
Les premières observations faites sur différents types de cellules ont montré une
variation de volume significative pour un traitement à 250 MPa pendant 15 mn. La
cellule étant un système thermodynamique ouvert, cette variation peut être attribuée à
un transfert de masse et/ou à une compression du milieu intracellulaire et de
l’enveloppe (paroi et membrane plasmique).
206 CONCLUSION
La contraction initiale des levures liée à la compression moléculaire du milieu
intracellulaire peut être directement reliée à la mortalité cellulaire observée après
15 mn sous pression. Cependant, si ce paramètre physique permet de prévoir la
destruction cellulaire, il n'explique pas les mécanismes d'inactivation des levures, qui
demandent un temps de maintien sous pression important. La compression, par ces
implications aux niveaux biochimiques et structuraux, agit donc uniquement en
induisant des perturbations susceptibles de conduire, après un temps de réponse
variable, à l'inactivation cellulaire.
Pendant le temps de maintien sous pression, les transferts de masse sont provoqués par
une perméabilisation des levures et une disparition progressive des gradients
physiologiques de la cellule (pression de turgescence, potentiel de membrane).
L'analyse des transferts de masse, notamment les sorties d'ions mesurées sur les
cellules de levures, montre que la perméabilité membranaire est altérée par
l'application de hautes pressions. Cette perméabilisation peut être la conséquence de la
compression du milieu évoquée précédemment et peut aussi être rapprochée des
phénomènes de séparations de phases des phospholipides membranaires mis en
évidence chez les liposomes.
Les cellules sanguines, ne bénéficiant pas de la protection d'une paroi rigide, sont très
sensibles à un déséquilibre de concentration et/ou de pression osmotique. Les
modifications de ces gradients ainsi qu'une probable fragilisation de la membrane
plasmique induisent une inactivation brutale de la cellule par éclatement ou rupture
membranaire.
L'ensemble de ces travaux sur ces deux types de cellules montre qu'une élévation de
pression suivie d'une phase de maintien de 15 mn agit sur les propriétés mécaniques et
physiologiques de la membrane provoquant une perméabilisation aux solutés et une
sortie d'eau ou une rupture prématurée de la membrane en l'absence de paroi.
CONCLUSION 207
Nous avons par ailleurs montré qu'une cinétique rapide de pressurisation-
dépressurisation avec un temps de maintien sous pression réduit n'affectait pas les
levures. Les temps de maintien sous pression ont donc plus d'effet sur la viabilité que
la cinétique d'élévation de pression.
Des expériences complémentaires doivent être initiées afin d'étudier plus précisément
les propriétés de perméabilité de la membrane sous pression.
L'avenir des hautes pressions réside probablement dans l'action combinée de plusieurs
traitements (physiques ou chimiques), en tirant avantage des modifications cellulaires
induites par le traitement haute pression (perméabilisation transitoire, fragilisation de
la membrane). Dans ce type d'approche, la compréhension des mécanismes induits par
les hautes pressions apparaît fondamentale.
CONCLUSION 209
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