COLESTEROL

Enzimático AA

MÉTODO ENZIMÁTICO COLORIMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN

SUERO O PLASMA EMPLEANDO TÉCNICA MANUAL O AUTOMATIZADA

SIGNIFICACIÓN CLÍNICA: PRESENTACION:

Dado que hay una relación estadística importante
entre la hipercolesterolemia, las enfermedades
cardiacas coronarias y los problemas
arterioescleroticos, la determinación de colesterol
sérico es fundamental en el control de los factores
de riesgo.
Se observan valores elevados de colesterol sérico
en casos como: enfermedades biliares, hepatitis
aguda, diabetes Mellitus, Síndrome nefrotico,
alteraciones del sistema endocrino; mientras que
se han encontrado valores dis minuidos en
insuficiencia hepática, y enfermedad de Addison.
FUNDAMENTOS DEL MÉTODO:
Los esteres del colesterol son hidrolizados por una
colesterol esterasa y el colesterol producido en esta
reacción, más el colesterol libre, es oxidado por
acción de una colesterol oxidasa con formación de
peróxido de hidrogeno. Este ultimo, en presencia de
peroxidasa, oxida el cromogeno 4-Aminofenazona
/fenol a un compuesto de color rojo.
Este equipo permite realizar 400 DET. con la técnica
manual. Se presenta conteniendo:
# Reactivo 4 AF/Enzimas: 4 unidades
# Reactivo Fenol: 4 x 100 ml
# 5 ml Standard
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO:
Disolver el contenido de una unidad del
Reactivo 4 AF/Enzimas en el contenido de un
envase de reactivo Fenol.
Esta solución de trabajo tiene una estabilidad de 50
días a partir de la fecha de su preparación, cuando
se la guarda en heladera (2-10 ºC) y protegida de la
luz.
MUESTRA:
Suero o plasma heparinizado. Si bien se
recomienda procesar las muestras dentro de las
48/72 hs, las mismas pueden conservarse una (1)
semana en heladera y dos (2) meses en
congelador.

TÉCNICA OPERATORIA MANUAL:

CE
Esteres de colesterol +H 2O → colesterol + ácidos grasos

CHOD
Pipetear en tubos de ensayo:
Colesterol + O2+ H2O  → colesten-3-ona + H2O2
Blanco Standard Muestra
Muestra --- --- 10 µl
2 H2O2 + 4AF + Fenol POD
→ quinoneimina + 4 H2O
Standard --- 10 µl ---
Rvo. de trabajo 1 ml 1 ml 1 ml
REACTIVOS PROVISTOS: Mezclar e incubar a 37 °C durante 10 minutos o 15
Estos reactivos son para USO IN VITRO: minutos a 20-25 ºC.
• Reactivo 4AF/Enzimas: Polvo conteniendo 4AF y Leer a 520 nm en espectrofotómetro llevando a
enzimas para las siguientes concentraciones cero con el blanco de reactivos.
finales: 4AF 0.4 mmol/l, CE (> 200 U/l), CHOD
(> 200 U/l), POD (>1300 U/l).
• Reactivo Fenol: Solución de Fenol 5 mmol/l en El color es estable durante una hora a 20-25 ºC.
buffer de fosfato 50 mM, pH= 7.00
• Standard : Solución de Colesterol 2,00 g/l CALCULO DE RESULTADOS :

ESTABILIDAD:
Colesterol (g/l) = 2,00 A Muestra
Estos reactivos son estables en heladera (2-10 ºC) A Standard
hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
Se recomienda no exponer a temperaturas Colesterol (mmol/l) = 5,17 A Muestra
elevadas durante tiempos prolongados. A Standard

SOCIEDAD DE BIOQUIMICOS DE SANTA FE. AVENIDA URQUIZA 2657-3000 SANTA FE.TE/FAX (0342) 455 2708

e-mail: sbstafe@ceride.gov.ar
ESPECIFICACIONES ANALÍTICAS DE APLICACIÓN VALORES DE REFERENCIA:
PARA AA : La concentración de colesterol es dependiente de la
edad, sexo, dieta, raza, etc., por lo que se
recomienda que cada laboratorio establezca sus
PRINCIPIO DE LA REACCIÓN: Trinder propios márgenes de referencia, siendo uno de
TIPO DE REACCIÓN: Punto final único los aceptados : 1,50 - 2,50 g/l, para suero de
DIRECCCIÓN DE LA REACCIÓN: Positiva adultos.
LONGITUD DE ONDA PRIMARIA : 505
LONGITUD DE ONDA SECUNDARIA : 600-700 BIBLIOGRAFÍA :
UNIDADES: g/l • Trinder, P. Ann.Clin.Biochem. - 6 (1969) 24.
TIEMPO DE INCUBACION REACTIVOS (seg): 600 • Allain, C.C.; Poon, L.S. Clin.Chem. - 20 (1974) 470
TIEMPO DE LECTURA (seg): 5-20
LINEALIDAD (conc): 6.00
ABSORBANCIA LÍMITE DEL BLANCO (Abs): 0.300
LÍMITE DE ABSORBANCIA (Abs): 2.000
RELACIÓN MUESTRA /REACTIVO: 1:100

CALIBRACIÓN: emplear calibradores nivel I y II

CONTROL DE CALIDAD: emplear sueros control nivel I
y II.

RENDIMIENTO ANALITICO PARA LA TECNICA MANUAL:

* Linealidad : La reacción de color sigue la ley de
Beer al menos hasta 5 g/l. Para valores superiores
diluir la muestra con solución fisiológica y repetir la
determinación. Afectar el resultado por la dilución
efectuada.
* Inexactitud : Se obtuvieron en experimentos de
recuperación valores comprendidos entre 98-101%.
* Imprecisión: Se obtuvieron para replicados de una
misma muestra coeficientes de variación del orden
de ± 2,10 %.

OBSERVACIONES :
* Se debe tener cuidado con la contaminación del
reactivo de trabajo, ya que los oxidantes colorean el
mismo aumentando los blancos, los reductores
disminuyen la respuesta de color y los detergentes,
metales pesados y cianuros son inhibidores
enzimaticos.
* Valores de hemoglobina inferiores a 100 mg/dl y
de bilirrubina inferiores a 20 mg/dl no interfieren en
la prueba. En caso de sueros lipemicos, puede
observarse turbidez al final del procedimiento, se
debe entonces diluir al ½ con reactivo de trabajo,
incubar a 37 °C 5-10 minutos, teniendo en cuenta la
dilución en el calculo de resultados.