REVISIÓN

Hacia una comprensión agregado de Hidrólisis

Enzimática de celulosa no complejados de celulasa
Sistemas

Yi-Heng Percival Zhang, 1 Lee R. Lynd 1,2

1 Thayer School of Engineering, Dartmouth College, Hanover, New Hampshire 03755; e-mail:
percival.zhang@dartmouth.edu , Lee.R.Lynd@dartmouth.edu

2 Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Dartmouth, Hanover, New Hampshire

03755

Recibido el 2 de junio de 2004; 29 aceptada de julio de de 2004

Publicado en línea el 10 de noviembre de 2004 Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002 / bit.20282

Resumen: La información relativa a la hidrólisis enzimática de la celulosa por
sistemas de enzimas celulasa no complejados se revisa con un énfasis particular en
el desarrollo de la comprensión agregada que incorpora características de sustrato
además de la concentración y múltiples componentes de celulasa. Temas
considerados incluyen propiedades de celulosa, adsorción, hidrólisis de la celulosa,
y los modelos cuantitativos. Se propone un esquema de clasificación para los
modelos cuantitativos para la hidrólisis enzimática de la celulosa basado en el
número de actividades solubilizantes y variables de estado sustrato incluidos.
Sugerimos que ha llegado el momento de revisar y revitalizar el modelado funcional
de hidrólisis de la celulosa, segundo 2004Wiley periódicos, Inc.
Henrissat, com. Commun.). También durante este periodo, se han introducido
sistemas de clasificación basados ​estructuralmente extensas para ambos
módulos catalíticos y de unión a celulosa, y han dado lugar a nuevos
conocimientos e hipótesis con respecto a la evolución de los sistemas de
celulasas (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993, 1996 ), actualizado con
frecuencia en http //: afmb.cnrs.mrs.fr/CAZY.
Para que el gran volumen de información disponible en componentes de
celulasa para ser ejercida sobre las aplicaciones principales que motivan
interés en la hidrólisis de celulosa,
por ejemplo, la conversión de biomasa producida renovable a los combustibles y productos

químicos de los productos básicos, es necesario incorporar esta información en una comprensión

de los sistemas de celulasa compuestos de múltiples componentes con distintos modos de acción.

La situación se complica aún más debido a la acción de los sistemas enzimáticos de celulasa se ve
palabras clave: adsorción; celulosa; celulasa; hidrólisis; modelo cinético
afectada por las propiedades del sustrato además de la concentración como el grado de

polimerización, cristalinidad, área accesible, la presencia de lignina-que dependen del sustrato

particular que está siendo investigado y el cambio como la avanza la reacción. En el curso de la
INTRODUCCIÓN búsqueda de una 'comprensión de la hidrólisis enzimática de la celulosa '' agregados' que incorpora

información sobre componentes de celulasa y características de sustrato, además de la

La importancia potencial de la hidrólisis de celulosa en el contexto de la conversión de la
concentración, modelos cuantitativos son tremendamente valioso. De particular importancia,
biomasa vegetal a los combustibles y productos químicos es ampliamente reconocidos
parámetros medidos para componentes de celulasa y sustratos podrían, en principio, ser
(Lynd et al, 1991, 1999;.. Himmel et al,
incorporados en modelos utilizados para predecir el comportamiento de sistemas de enzimas
1999), y la hidrólisis de celulosa también representa uno de los mayores
celulasa multicomponente. Comparación de tales predicciones a mediciones experimentales es el
flujos de materiales en el ciclo global de carbono (Falkowski et al., 2000). La
medio más sistemáticos y rigurosos disponibles por los cuales para probar si la comprensión de
cantidad de información científica sobre los componentes del sistema de
componentes de celulasa y sus interacciones es suficiente para explicar una observación dada.
enzima que hidroliza la celulosa se ha expandido dramáticamente en los
Además, una vez que se valida un modelo cuantitativo, que puede ser utilizado para formular
últimos años. Durante el periodo de 12 años 1991 a 2003, por ejemplo, el
rápidamente nuevos hipótesis de importancia en ambos contextos fundamentales y aplicadas.
número de glicosil hidrolasas conocidas secuencias de genes ha aumentado
Comparación de tales predicciones a mediciones experimentales es el medio más sistemáticos y
de F 300 a> 10.000, y el número de estructuras cristalinas de celulasa ha
rigurosos disponibles por los cuales para probar si la comprensión de componentes de celulasa y
aumentado de varios para F 230 (H.
sus interacciones es suficiente para explicar una observación dada. Además, una vez que se valida

un modelo cuantitativo, que puede ser utilizado para formular rápidamente nuevos hipótesis de

importancia en ambos contextos fundamentales y aplicadas. Comparación de tales predicciones a

Correspondencia a: Y.-HP Zhang o LR Lynd
mediciones experimentales es el medio más sistemáticos y rigurosos disponibles por los cuales
patrocinadores del contrato de subvención: Departamento de Energía y el Instituto Nacional de Estándares y

Tecnología para probar si la comprensión de componentes de celulasa y sus interacciones es suficiente para

números de contrato de subvención: DE-FG02-02ER15350 y 60NANB1D0064 explicar una observación dada. Además, una vez que se valida un modelo cuantitativo, que puede ser utilizado para f

segundo 2004 Wiley publicaciones periódicas, Inc.

 Este artículo revisa la información disponible en la hidrólisis enzimática por
los sistemas de celulasa no complejados; es decir, los sistemas basados ​en
componentes que actúan de forma discreta en lugar de complejos como
estables (Lamed et al, 1983;.. Tomme et al, 1995a). Una parte considerable de
esta revisión se gasta en las propiedades de la celulosa a la luz del papel
central que desempeñan tales propiedades en modelos cuantitativos basados
​mecánica de hidrólisis de la celulosa. En particular, la sección siguiente
considera cristalinidad, grado de polimerización, la accesibilidad, la preparación
y propiedades de sustratos modelo, y materiales lignocelulósicos pretratados.
La adsorción sección de celulasa se dedica a la adsorción conduce a la
formación de complejos de celulosa-celulasa, incluyendo los modelos de
adsorción, reversibilidad, y la movilidad de la enzima, así como la accesibilidad
inferido de celulosa a partir de adsorción celulasa. Después de ello, la
comprensión mecanicista de la hidrólisis de la celulosa por los sistemas no
complejados se aborda en hidrólisis de la celulosa, con atención a la
comprensión conceptual de hidrólisis de la celulosa, las características de la
ampliamente estudiada Trichoderma reesei sistema de celulasa, documentación
y comprensión de la sinergia entre los componentes de celulasa, y un resumen
de comprender el mecanismo actual. La sección de modelos cuantitativos
presenta un esquema de clasificación y resume las características de los
modelos descritos en la literatura. La última sección ofrece perspectivas finales
y destaca los desafíos pendientes asociados con la comprensión y el modelado
de sistemas de celulasas no complejados. Dado que nuestro enfoque principal
está en la función de celulasas en lugar de su estructura, utilizamos el,
nomenclatura mayores definido funcionalmente en lugar de la más nueva
nomenclatura basada en secuencia de aminoácidos y la estructura molecular.
CELULOSA
Todo celulosa es producida por biosíntesis. Mientras que la producción de
celulosa por las plantas superiores fotosintéticas y las algas se piensa que es de
lejos el más importante en términos de flujos globales de carbono, la producción
de celulosa por organismos no fotosintéticas (ciertas bacterias, invertebrados
marinos, hongos, mohos mucilaginosos y amebas) también ha sido
documentada (Coughlan , 1985; Jarvis, 2003;. Lynd et al, 2002; Tomme et al,
1995a).. La celulosa es un polímero de condensación lineal que consiste en
D-anhydroglucopyranose unidas entre sí por
h- enlaces 1,4-glicosídicos. Anhidrocelobiosa es la unidad de repetición de la
celulosa, ya que las moléculas de glucosa anhidra adyacentes se rotan 180 j con
respecto a sus vecinos (Fig. 1a). Esta rotación hace que la celulosa sea
altamente simétrica, ya que cada lado de la cadena tiene un número igual de
grupos hidroxilo. El acoplamiento de moléculas de celulosa adyacentes por
enlaces de hidrógeno y fuerzas de van der resultados de Waal en una
alineación paralela y una estructura cristalina. Los extensos enlaces de
hidrógeno entre cadenas de (2 por anhydroglucopyranose) y intracatenarios (2 F
3 por anhydroglucopyranose) produce fibras supramoleculares rectas,
estables de gran resistencia a la tracción (Gardner y Blackwell, 1974a, b;
798 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004
Krassig, 1993; Nevell y Zeronian, 1985). En contraste, el almidón contiene
amilosa y amilopectina conectado por
una- 1,4 y hasta cierto punto una- 1,6 enlaces glucosídicos, que forman una
estructura helicoidal fuertemente enrollado mantenida por puentes de hidrógeno
intercatenarios (Buleon et al, 1998;. Calvert, 1997). celulosa nativa, se hace
referencia como celulosa I, tiene dos formas de cristalitos distintas, I una, que es
dominante en celulosa de bacterias y algas, y yo h, que es dominante en las
plantas superiores (Atalla y Vanderhart, 1984). celulosa nativa (celulosa I) se
puede convertir en otras formas cristalinas (II-IV) mediante diversos tratamientos
(Klein y Snodgrass, 1993; Krassig, 1993; O'Sullivan, 1997).
La celulosa existe como hojas de anillos de glucopiranosa en un plano con
hojas sucesivas apiladas una encima de la otra para formar una partícula
tridimensional. Debido a esta disposición, la superficie de una partícula de
celulosa tiene distinta '' enfrenta '' que interactúan con las enzimas de medio
ambiente y acuosa de celulasa. Los seis átomos de carbono en el anillo de
glucopiranosa e interna h- enlaces glucosídicos encuentran en el plano ab o '110
'' cara', mientras que el plano de CA o 110 cara consta de los bordes de los
anillos (ver Fig. 1b). caras adicional presente reductoras y no reductoras
extremos, respectivamente. La unidad de repetición de la 110 cara es la celosía
celobiosa, que mide 1,04 nm a lo largo del eje de la molécula de celulosa y
0,54 nm en la dirección perpendicular. Sobre 100 glucanos de celulosa se
agregan en fibrillas elementales con una anchura cristalina de 4-5 nm
(O'Sullivan, 1997), y manojos de fibrillas elementales están incrustadas en
una matriz de hemicelulosa con un espesor de 7-30 nm. El proceso de
lignificación se produce tarde en el proceso de síntesis de fibras naturales,
por lo que la lignina se encuentra principalmente en el exterior de
microfibrillas donde se une covalentemente a la hemicelulosa (Fig 1c;. Klein
y Snodgrass, 1993).
La relación entre las características estructurales de la celulosa y las
tasas de hidrólisis enzimática ha sido objeto de estudio extensivo y varias
revisiones (Converse, 1993; Cowling y Kirk, 1976; Lynd et al, 2002;.
Mansfield et al., 1999; McMillian, 1994 ), pero aún no se conoce bien.
Características estructurales de celulosa comúnmente considerados como
factores de tasa-impactando incluyen índice de cristalinidad, el grado de
polimerización, y el área accesible.
Índice de cristalinidad (CRI)
La cristalinidad a menudo ha sido pensado como proporcionar una indicación
de la reactividad del sustrato, y es un lugar destacado en el modelo de Wood
(1975), así como otros modelos. La cristalinidad de las muestras de celulosa
secas se puede medir cuantitativamente a partir del patrón de difracción de
rayos X de amplio rango (Krassig, 1993). En el caso de celulosa-I, el índice de
cristalinidad (CRI) se calcula usando la fórmula:
ICr ¼ 1 h am = h cr ¼ 1 h am = re h nene h a.m Þ re 1 Þ
en base a la relación de la altura de celulosa cristalina en el 002 reflexión
en 2 u = 22.5 j ( h cr) a la altura de la celulosa amorfa (h a.m), yh tot = h CR + h a.m. Algodón
Figura 1. a: Estructura de la celulosa con repetición h 1,4-ligado unidades anhidrocelobiosa. segundo: cristalina de la celulosa I. Los ejes de la unidad de repetición (celobiosa) son: a = 0,817 nm, b =
1,04 nm, y c = 0,786 nm. Las caras de los anillos de glucopiranosa son paralelas al plano ab (110 cara) del cristal (Mosier et al., 1999). do: Organización de origanization lignocelulosa en fibrillas
elementales y microfibrillas (Klein y Snodgrass, 1993).

(Hoshino et al., 1997; Lee et al, 1982;.. Sinitsyn et al, 1991), celulosa 1999; . Fierobe et al, 2002) proporcionan ejemplos de celulosa altamente
bacteriana de xylinum Aacetobacter ( Boisset et al., 1999; Gilkes et al., cristalina, mientras que el ácido fosfórico de celulosa hinchadas y celulosa
1992; Valjamae et al., 1999), y la celulosa de la alga Valonia ventricosa ( Boissetmolino de bolas son considerados como celulosa amorfa (Hoshino et al., 1997;
et al., Lee et al, 1982;. Ooshima

Zhang y LYND: SISTEMAS celulasa no complejados 799

et al., 1983). sustratos modelo común derivadas de pastas de madera de causa y efecto. Por ejemplo, varios tratamientos que disminuyen la cristalinidad
comerciales blanqueados, tales como Avicel (Wood y Bhat, 1988; Wood, también aumentan el área de superficie, y se ha sugerido que el aumento de las
1988)., papel de filtro (Henrissat et al, tasas de hidrólisis observadas con los sustratos derivados de tales tratamientos
1985), y Solka Floc (Bertrain y Dale, 1985; Fan et al, 1980;.. Lee et al, pueden ser debido al aumento de capacidad de adsorción en lugar de reactividad
1982;.. Sinitsyn et al, 1991) son considerados como una mezcla de formas sustrato (Caulfield y Moore, 1974; Howell y atrapado, 1975; Lee y Fan, 1982). La
amorfas y cristalinas (Gilkes et al, comparación de las velocidades de hidrólisis en varias fuentes de sustratos
1991). Los valores típicos de CRI para diversos sustratos celulósicos modelo celulósicos modelo, Fierobe et al. (2002) concluyeron que la accesibilidad de la
se presentan en la Tabla I. El valor de CRI de aumentos de celulosa después celulosa es un factor más importante que el índice de cristalinidad en la
de un período de agua hinchazón debido a la recristalización (Fan et al, 1980;.. determinación de la velocidad de hidrólisis.
Lee et al, 1983; Fengel y Wegener, 1984 ), y las variaciones en condición de
secado antes de la medida de la IRC pueden causar diferencias entre sustratos
derivados del método de preparación del sustrato en lugar de propiedades del
sustrato per se (Lenze et al, 1990;.. Weimer et al, 1995). La presencia de
células residuales y proteínas también puede resultar en artefactos en el
Grado de polimerización
ensayo de CRI (Converse, 1993).
El grado de polimerización (DP) de sustratos celulósicos determina la
abundancia relativa de terminal y interior
las tasas de celulosa de hidrólisis mediada por celulasas fúngicas son h- enlaces glucosídicos, y de sustratos para la exo-actuación y enzimas endo
típicamente 3-30 veces más rápido para la celulosa amorfa, en de acción, respectivamente. DP se puede definir en términos de la media en
comparación con la celulosa altamente cristalino (Lynd et al, 2002;. Tabla número DP (DP NORTE), peso promedio DP (DP W), o DP inferirse de viscosidad
III). Esta observación condujo a los investigadores en los años 1980 a (DP V):
postular un modelo para la estructura de la celulosa que consta de
fracciones amorfas y cristalinas (Fan et al, 1980, 1981;.. Lee et al, 1983).
DP norte ¼ METRO norte ¼ PAGPAG
nortenorte yo= MW
yo METRO yo glu re 2 Þ
Si esta hipótesis fuera correcta, sería de esperar que la cristalinidad debe MW glu
aumentar durante el transcurso de la hidrólisis de celulosa como resultado
de la reacción preferencial de la celulosa amorfa (Betrabet y Paralikar,
1977; Ooshima et al., 1983). Sin embargo, varios estudios han encontrado DP W ¼ METRO W ¼ PAGPAG
nortenorte
yo
yo= MW
yo METRO 2 glu re 3 Þ
que la cristalinidad no aumenta durante la hidrólisis enzimática (Lenze et MW glu
al, 1990;. Ohmine et al, 1983;. Puls y Wood, 1991;. Schurz et al, 1985;.
Sinitsyn et al, 1989).
DP V ¼ METRO V PAG
¼ PAG norte
norte =
yo re
yo MW glu re 4 Þ
MW glu

donde N yo es el número de moles de una fracción dada yo tiene una masa

molar M yo, METRO norte es el peso molecular promedio en número, M w es el peso
molecular promedio en peso, M V es el peso molecular medio en viscosidad,
MW glu es el peso molecular de anhidroglucosa (162 g / mol), y re es la
Los futuros estudios dirigidos al desarrollo y la aplicación de métodos mejorados
viscosidad. Medición de DP comienza con la disolución de la celulosa
sería útil para resolver de manera más definitiva el papel de ERC en impactando
utilizando una técnica que no altera la longitud de cadena. Varios de tales
hidrólisis. En la interpretación de los datos de cristalinidad, y de hecho los datos para
métodos parecen satisfactorio, incluyendo:.. 1) soluciones de complejos
todas las propiedades físicas de celulosa, se debe tener cuidado de distinguir
metálicos tales como solución CUAM (Klemm et al, 1998) y
correlación
cupriethylenediamine (Klemen-Leyer et al,

1992, 1994, 1996); 2) la formación de derivados de la celulosa por reacción

Tabla I. Resumen de algunas propiedades físicas de los sustratos modelo celulósicas.
con disolventes orgánicos (Ng y Zeikus, 1980) o ácidos inorgánicos tales como
ácido nítrico (Whitaker, 1957); y 3) soluciones iónicas tales como N,
sustrato 1 ICr 2 SSA 2 ( metro 2 / sol) DP N2 F RE (%) N-dimetilacetamida (DMAc) / LiCl (Striegel, 1997). Después de la disolución,

Avicel 0,5-0,6 20 300 0.33 DP norte se puede medir por membrana o presión de vapor osmometría,
antes de Cristo 0,76-0,95 200 2000 0.05 crioscopía, ebulloscopia, la determinación de la reducción de la concentración
PASC 0-0,04 240 100 1.0 final, o microscopía electrónica (Krassig, 1993). DP W
Algodón 0,81-0,95 n / A. 1000-3000 ,1-,033
Papel de filtro - 0.45 n / A. 750 0.13
se puede medir sobre la base de dispersión de luz, equilibrio de sedimentación,
La pulpa de madera 0,5-0,7 61-55 500-1500 0,06-0,2
y de rayos X pequeña dispersión de ángulo, y DP V se mide en base a la
1 BC, celulosa bacteriana; PASC, ácido fosfórico celulosa hinchada; CrI marca el índice de
viscosidad. La viscosidad de celulosa o derivados de celulosa disuelta se ha
cristalinidad; SSA marca el área de superficie específica por BET; DP norte denota el grado de
encontrado a la igualdad:
polimerización promedio en número; F RE denota la fracción de extremos reductores.

2 Las referencias en el texto. re ¼ K metro METRO una þ 1 re 5 Þ

yo

800 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004

en la que K m = constante, con el valor de una por celulosa y derivados de celulosa en
la mayoría de los casos que van desde 0,75 a 1 (Krassig, 1993). Por lo tanto, DP V Se
puede escribir como:
yo
DP V ¼ PAG norte yoPAG norte
METRO yo 2
1:75 = MW glu
Desde celulosa se polidispersa, DP W z DP V> DP NORTE. el DP norte los valores son
adecuados en el tratamiento de hidrólisis de la celulosa, y DP W y DP V con
frecuencia muestran una buena correlación para las propiedades del polímero
(Klemm et al, 1998;. Krassig, 1993). La distribución de AD en una población de
moléculas de celulosa se puede medir por cromatografía de exclusión por tamaño
(Yau et al., 1979). El recíproco de DP corresponde a la fracción de reducir fines
relativos a todas las unidades de glucano presentes (F NR, sin unidades).
solubilidad de celulosa disminuye drásticamente con el aumento de DP
debido a enlaces de hidrógeno intermoleculares. Celodextrinas con DP de
2-6 son solubles en agua (Klemm et al, 1998;. Miller, 1963;. Pereira et al,
1988), mientras que celodextrinas de 7-13 o ya son algo solubles en agua
caliente (Zhang y Lynd, 2003;. Schmid et al, 1988). Un glucano de DP = 30
ya representa el polímero '' de celulosa '' en su estructura y propiedades
(Klemm et al., 1998).
El DP de sustratos celulósicos varía en gran medida, de <100 a> 15.000,
dependiendo de origen y preparación del substrato, como se muestra en la
Figura 2. El DP de la madera después de la fabricación de pasta se reduce a
500-1500 (Bertrain y Dale, 1985; Klein y Snodgrass , 1993; Lee et al, 1982;..
Swatloski et al, 2002). Después de la hidrólisis ácida parcial, el DP de Avicel se
reduce aún más a 130-800 (Hoshino et al, 1997;. Ng y Zeikus,
Figura 2. valores DP típicos de celulosa y celodextrinas solubles. NC, algodón natural; NW, madera
natural; P, pulpa; CT, borra de algodón; FP, papel de filtro.
Zhang y LYND: SISTEMAS celulasa no complejados
1980; Ross-Murphy, 1985; Steiner et al, 1988;. Wood, 1985), dependiendo
de las condiciones de hidrólisis (Dong et al, 1998) y el DP del sustrato
original (Wood, 1988).. Del mismo modo, el DP de algodón natural puede
ser tan alta como 15.000, pero se reduce a 1.000-3.000 o menos en la
preparación de borra de algodón que implican el tratamiento de lograr
re 6 Þ
desparafinado y de blanqueamiento (Kleman-Leyer et al, 1992, 1996;.
Okazaki y MooYoung, 1978; Ryu y Lee, 1982), y el filtro de papel hecho de
pulpa de algodón tiene un DP de 500-1000 o superior (Nisizawa, 1973;
Kongruang et al, 2004).. celulosa bacteriana (BC) tiene un DP medio de
2.000-3.000 (Hestrin, 1963; Fierobe et al, 2002;. Valjamae et al., 1999),
mientras que la celulosa microcristalina bacteriana (BMCC) preparado por
tratamiento de BC con ácidos oscila entre 130 -1300, dependiendo de las
condiciones de hidrólisis (Valjamae et al., 1999).
El cambio en la DP en el transcurso de la hidrólisis de sustratos celulósicos se
determina por la proporción relativa de las actividades exo- y endo-de actuación y
propiedades de celulosa. Exoglucanasas actúan en los extremos de cadena, y por
lo tanto disminuyen DP solamente de forma incremental (Kleman-Leyer et al,
1992, 1996;.. Srisodsuk et al, 1998). Las endoglucanasas actúan sobre las partes
interiores de la cadena y por lo tanto rápidamente disminuyen DP (KlemanLeyer et
al, 1992, 1994;. Selby, 1961; Srisodsuk et al, 1998;. Whitaker, 1957; Madera y
McCrae, 1978). Exoglucanasa se ha encontrado que tienen una marcada
preferencia para sustratos de menor DP (Wood, 1975), como era de esperar dada
la mayor disponibilidad de cadena termina con la disminución de DP. Es bien
conocido que la actividad de endoglucanasa conduce a un aumento en extremos
de cadena sin dar como resultado la solubilización apreciable (Irwin et al, 1993;.
Kruus et al., 1995; Reverbel-Leroy et al., 1997). No conocemos ninguna indicación
en la literatura que la tasa de creación extremo de la cadena de endoglucanasa se
ve afectada por sustrato DP.
Accesibilidad
Las enzimas celulasas deben unirse a la superficie de partículas de sustrato
antes de la hidrólisis de la celulosa insoluble puede tener lugar. La estructura
3D de tales partículas (incluyendo microestructura) en combinación con el
tamaño y forma de la enzima (s) de celulasa bajo consideración determinar
si
h- enlaces glucosídicos son o no son accesibles al ataque enzimático. partículas
celulósicos tienen ambas superficies externas e internas. En general, el área de
superficie interna de la celulosa es de 1-2 órdenes mayor que el área superficial
externa (Chang et al., 1981), pero esto no siempre es el caso, por ejemplo, en el
caso de la celulosa bacteriana. El área de superficie interna puede ser medida por
pequeño ángulo de dispersión de rayos X (SAXS), porosimetría de mercurio, de
sorción de vapor de agua, y de exclusión de tamaño (Grethlein, 1985; Neuman y
Walker, 1992;. Stone et al,
801
1969). El área de superficie interna de partículas de celulosa poroso
depende de la estructura capilar e incluye poros intraparticulate (1-10 nm),
así como huecos interparticulares (> 5 UNA m) (Marshall y Sixsmith, 1974).
Grethlein (1985) encontraron correlaciones lineales entre la velocidad de
hidrólisis inicial de biomasa pretratada y el tamaño de poro accesible a una
molécula con un diámetro de 51 Å, similar al tamaño de
T. reesei componentes de celulasa. Pero la superficie expuesta al dextrano no
puede distinguir el área específica de superficie activa de celulosa en el que la
hidrólisis enzimática se produce desde la zona de superficie que no es un sitio
para ataque enzimático (Chanzy et al, 1984;. Gilkes et al, 1992;. Lehtio et al. ,
2003), lo que resulta en el potencial sobreestimación de área
cellulaseaccessible eficaz. Las técnicas para medir superficie interna
generalmente no estimar el área externa (Converse, 1993).
área superficial externa está estrechamente relacionada con la forma y tamaño de
las partículas, y puede ser estimado por observación microscópica (Gilkes et al., 1992;
Henrissat et al, 1988;.. Reinikainen et al, 1995b; Weimer et al, 1990;. Blanca y Brown,
1981). Por ejemplo, el área de la superficie externa de BMCC es F 115 m 2 / g (Gilkes et
al., 1992) mientras que la de Avicel es F 0,3 m 2 / g (Weimer et al., 1990). El aumento de
la adsorción de celulasa y reactividad de celulosa con la disminución del tamaño de
partícula se ha informado (Kim et al, 1992;. Mandels et al., 1971). Sin embargo, esto
puede ser debido a causas distintas de aumento de la superficie externa, tal vez la
disminución de la resistencia de transferencia de masa, ya que la superficie externa se
piensa que es una pequeña fracción del área superficial total para la mayoría de
sustratos.
La accesibilidad de celulosa bruta se mide generalmente por absorción de
nitrógeno, argón o vapor de agua, el cambio dimensional o la ganancia de peso
por hinchamiento en agua u orgánicos líquidos, y el intercambio de H a los átomos
de D con D 2 H. El procedimiento más ampliamente utilizado para la superficie
específica (SSA) es el método de Brunauer-Emmett-Teller (BET) usando
adsorción de nitrógeno. Debido a variaciones en las condiciones experimentales
tales como el tiempo de adsorción, tiempo de vacío y presión de vacío (Marshall y
Sixsmith, 1974), preparación de la muestra (Grethlein, 1985;. Lee et al, 1983), y el
origen de la muestra y las características (Marshall y Sixsmith, 1974; Weimer et
al,.
1990), se ha informado de una amplia gama de valores de área brutos en la
literatura incluso para el mismo sustrato. El área específica de Avicel PH 102
aumenta desde 5,4 m 2 / g de área superficial a 18 m 2 / g después de un largo
tiempo de hinchamiento en agua, debido a que la estructura capilar de celulosa
secada al aire de los colapsos estatales waterswollen, resultando en cambios
drásticos en los parámetros físicos (Grethlein, 1985;. Lee et al, 1983). Para
mantener la estructura capilar sustrato tal como existe en el estado hidratado, se
recomienda que la SSA puede medir usando muestras de disolventes se secaron
(Grethlein, 1985; Lee et al., 1983). La SSA típico de BMCC, Avicel, y la pulpa
húmeda son
F 200 m 2 / g BMCC (Bothwell et al., 1997), desde 1,8 hasta 22 m 2 / g Avicel
(Fan et al, 1980;. Lee et al, 1983;. Marshall y Sixsmith, 1974), y 55-61 m 2 / g
pulpa (Fan et al, 1980;.. Kyriacou et al, 1988). El área de superficie
específica de PASC de los aumentos de Solka Floc 19,5 a 239 m 2 / g cuando
el ácido fosfórico de concentración se incrementa de 75% a 85% (Lee et al.,
1982). Debido a que una molécula de nitrógeno es mucho
802 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004
más pequeña que la celulasa, que tiene acceso a los poros y cavidades en la
superficie de la fibra que celulasa no puede entrar. Por lo tanto, no hay base
limitada para inferir que la SSA midió usando el método BET es un determinante
clave de la tasa de hidrólisis enzimática (Mansfield et al., 1999).
Preparación y Propiedades de modelos Sustratos
La pulpa de madera es de madera usando varios pasos, incluyendo trituración,
la deslignificación, el blanqueado, y lavado (Klemm et al., 1998). Por ejemplo,
Solka Floc está hecho de SO 2- de pulpa blanqueada de abeto mediante molienda
con bolas (Ghose,
1969). Avicel, también llamado hidrocelulosa y celulosa microcristalina, se
prepara a partir de fibras celulósicas (pasta de madera) por hidrólisis ácida
parcial y, a continuación secado por pulverización de la suspensión de pulpa
lavada, pero celulosa microcristalina (Avicel) todavía contiene una cantidad
sustancial ( F 30-50%) de la celulosa amorfa (Krassig, 1993). celulosa
bacteriana (BC) se prepara a partir de la película producida por xylinum
Acetobacter ( ATCC 23769) (Hestrin, 1963) o de nata de coco (Daiwa Fine
Produce, Singapur; Boisset et al,.
2000). celulosa microcristalina bacteriana (BMCC) se prepara a partir BC por
hidrólisis ácida parcial para eliminar celulosa amorfa (Valjamae et al., 1999).
celulosa de algodón está hecha de algodón natural después de la eliminación
de impurezas tales como cera, pectina, y la materia de color (Corbett, 1963).
Papel de filtro Whatman No. 1 está hecho de pulpa de algodón (Dong et al.,
1998). celulosa amorfa homogénea se puede hacer de diversos polvos de
celulosa pura, por ejemplo, Avicel, borra de algodón, por la hinchazón
tratamientos tales como ácido fosfórico, álcali, DMSO, DMAc / LiCl. El ácido
fosfórico de celulosa hinchada (PASC) se hace más comúnmente por la
hinchazón polvo de celulosa usando ácido fosfórico concentrado, lo que resulta
en la cristalinidad disminuida (Wood, 1988). Los valores típicos para la IRC, DP,
los valores brutos área de superficie (SSA por BET), y la fracción de extremos
reductores (F NR, recíproco de DP) para sustratos celulósicos modelo se
presentan en la Tabla I.
Características de lignocelulosa pretratado
moléculas de celulosa naturales se producen en fibrillas elementales
estrechamente asociados con hemicelulosa y otros polisacáridos estructurales,
así como la lignina (Fig. 1c). Tal lignocelulosa contiene típicamente de celulosa
(35-50% en peso.), Hemicelulosa (20-35% en peso.), Y lignina (5-30% en
peso.) (Chang et al, 1981;. Klein y Snodgrass, 1993; Lynd et al, 2002;..
Mansfield et al, 1999). Un examen detallado de la hidrólisis enzimática de la
lignocelulosa nativo puede encontrarse en otro lugar (Hatfield et al., 1999). Ya
que la hidrólisis enzimática de la lignocelulosa nativo lo general resulta en la
solubilización de V 20% de la originalmente presente glucano, alguna forma de
tratamiento previo para incrementar la susceptibilidad a la hidrólisis enzimática
se incluye en la mayoría de los conceptos de proceso para la conversión
biológica de lignocelulosa. El tratamiento previo, en condiciones apropiadas,
conserva casi toda la celulosa presente en el material original y permite cerca
de rendimientos teóricos en la hidrólisis enzimática. pretratamiento propuesto
procesos incluyen ácido, explosión de vapor diluir a alta concentración de
sólidos, 'proceso' hidrotermal '', '' organosolv '' procesos que implican
disolventes de ácido orgánico en una fase acuosa, explosión fibra amoniaco
(AFEX), fuerte proceso alcalino (Lynd et al., 2002), así como tratamientos
mecánicos tales como martillo y molienda con bolas (Millett et al, 1976;. Sun
y Cheng, 2002). características comparativo de estos procesos, así como la
consideración de factores de sustrato que afectan a la velocidad de hidrólisis
se revisan en otra parte (Chang et al, 1981;. Converse, 1993; Cowling y Kirk,
1976; Dale, 1985; Hsu, 1996;. Ladisch et al, 1983; Mansfield et al., 1999;
McMillan 1994; Lynd, 1996; Sun y Cheng, 2002;. Weil et al, 1994; madera y
Saddler, 1988).
La hidrólisis de biomasa lignocelulósica es más complicado que el de
celulosa pura debido a la presencia de componentes nonglucan tales como
lignina y hemicelulosa. eliminación y / o redistribución La lignina se cree que
tienen un efecto significativo sobre las tasas observadas de la hidrólisis
enzimática (Chernoglazov et al, 1988;. Converse, 1993; Lynd et al,.
2002). La lignina se ha implicado como un adsorbente celulasa competitivo
que reduce la cantidad de celulasa disponibles para catalizar la hidrólisis
de celulosa (Bernárdez et al, 1993;.. Ooshima et al, 1990; Sutcliffe y
Saddler, 1986). Además, se ha sugerido que bloquea lignina residual el
progreso de la celulasa de la cadena de celulosa (Eriksson et al, 2002;..
Mansfield et al, 1999).
El índice de cristalinidad medido de lignocelulosa se ve afectada por la
presencia de lignina y hemicelulosa. Por lo tanto, se debe tener cuidado en
la comparación de los valores de CRI para sustratos lignocelulósicos a
valores para sustratos celulósicos, y también en la comparación de la CRI
de sustratos lignocelulósicos antes y después del tratamiento previo.
valores CRI reportados para materiales pretratados son generalmente en
el intervalo de 0,4-0,7 (Chang y Holtzapple, 2000;. Gharpuray et al, 1983;.
Koullas et al, 1992;. Sinitsyn et al, 1989, 1991). El pretratamiento por
cualquiera con ácido diluido o una explosión de vapor en condiciones que
son muy eficaces en la mejora de la hidrólisis se ha encontrado para
aumentar la CrI compuesto de lignocelulosa (Deschamps et al, 1996;. Kim
et al., 2003; Knappert et al., 1980; Meunier-Goddik et al., 1999).
Consistente con esto, una correlación negativa entre la velocidad de
hidrólisis y la IRC se ha demostrado en experimentos que implicaban
pretratamientos químicos seguido por molienda con bolas (Chang y
Holtzapple, 2000; Gharpuray et al, 1983;. Knappert et al, 1980;. Koullas et
al, 1992;. Sinitsyn et al., 1989, 1991), y también los experimentos que
examinaron diversas condiciones de tratamiento previo (Chang y
Holtzapple, 2000). En contraste con la tendencia observada para otros
procesos de pretratamiento, AFEX pretratamiento se ha informado a
resultar en una disminución de CRI (Gollapalli et al., 2002). Varios
investigadores han implicado superficie accesible como un factor
importante en la determinación de la eficacia de tratamiento previo
(Gharpuray et al, 1983;. Grethlein, 1985; Grethlein y Converse, 1991;
Sinitsyn et al., 1991).
Zhang y LYND: SISTEMAS celulasa no complejados
cambios en otros tales determinantes potenciales. Por ejemplo, Sinitsyn et al.
(1991) encontraron una fuerte correlación negativa entre la IRC y el área de
superficie accesible que acompaña a varios procesos de pretratamiento.
Sospechamos que el impacto del aumento de pretratamiento que acompaña
superficie en muchos casos puede ser más importante que los cambios en ICr,
aunque será necesario trabajar más para establecer este punto y la
importancia relativa de estos y otros factores bien puede ser diferente para
diferentes procesos.
valores del GP de sustratos lignocelulósicos como el bagazo, paja de
trigo, y Eucalyptus regnans pretratado usando explosión de vapor,
supercrítico CO 2, alcalino, y el ozono caer en su mayoría en el intervalo de
600-1,100, aunque los valores tan alto como 3000 se han registrado para Pinus
radiata chips (Puri, 1984;. Sinitsyn et al, 1991). Durante diluida
acidcatalyzed hidrólisis de la celulosa, el DP de materiales celulósicos
disminuye rápidamente inicialmente y alcanza un valor casi constante a
partir de entonces llamado el DP nivel-off (LODP) (Klemm et al, 1998;.
Krassig, 1993; Wood, 1988). valores LODP en el rango de 100-300 se han
medido, dependiendo del sustrato y de las condiciones tales como
temperatura y concentración de ácido (Krassig, 1993; Wood, 1988). Este
valor LODP puede limitar las velocidades de hidrólisis que puede ocurrir
con ácido diluido lignocelulosa pretratada, aunque esto no se ha
investigado experimentalmente. Diferentes conclusiones acerca de la
importancia de la DP en la determinación de las tasas de hidrólisis de
biomasa celulósica tratada previamente se han elaborado, con Sinitsyn et
al. (1991) llegando a la conclusión de que DP es relativamente poco
importante,
ADSORCION cELULASA
Adsorción
adsorción Celulasa es rápida en comparación con el tiempo requerido para la
hidrólisis, con muchos estudios para encontrar que la adsorción alcanza el
estado de equilibrio en menos de media hora (Lynd et al., 2002). La descripción
más común de adsorción celulasa es la isoterma de Langmuir (Ec. [7]), derivado
suponiendo que la adsorción puede ser descrito por la constante de un único
equilibrio de adsorción y una capacidad de adsorción especificado. La isoterma
de Langmuir se puede representar como:
mi una ¼ W máx K PAG mi F re 7 Þ
1 þ K PAG mi F
en la que E una es celulasa adsorbida (mg o UNA mol celulasa / L), W máx es la
celulasa de adsorción máxima = A max * S (mg o
UNA mol celulasa / L), A máx es la adsorción celulasa máximo por g de celulosa (mg
o UNA mol celulasa / g de celulosa), S es la concentración de celulosa (g de
celulosa / L), E F es celulasa libre (mg o UNA mol celulasa / L), y K PAG es la
constante de disociación ( K PAG ¼ mi una
mi F S) en términos de L / g de celulosa. El coeficiente de distribución o
partición coeficiente, R, se define como:
R ¼ K PAG W máx re 8 Þ
803
R tiene unas dimensiones de L / g de celulosa y corresponde a la relación de E una/
mi F cuando el sustrato es exceso, y por lo tanto E f = 0 (. Beldman et al, 1987;
Klyosov, 1988, 1990; Kyriacou y otros, 1988;.. Medve et al, 1997). Además de
los modelos de adsorción de equilibrio, un modelo de adsorción dinámica ha
sido utilizado por algunos investigadores (Converse et al, 1988;. Converse y
Optekar, 1993; Nidetzky y Steiner, 1993; Nidetzky et al, 1994c.).
La ecuación de Langmuir es ampliamente utilizado debido a que proporciona
una buena (y a menudo muy bien) ajuste a los datos en la mayoría de los casos,
y representa un modelo mecánico simple que puede ser usado para comparar
propiedades cinéticas de diversos sistemas de celulasa-celulosa. Pero es
evidente que la unión de celulasa no cumple con suposiciones implícitas en el
modelo de Langmuir debido a uno o más de los siguientes:. Adsorción celulasa
parcialmente irreversible 1) (Palonen et al,
1999); 2) la interacción entre los componentes de celulasa de adsorción,
especialmente a altas concentraciones (Jeoh et al, 2002).;
3) múltiples tipos de sitios de adsorción, incluso para una molécula de
celulasa (Linder y Teeri, 1997; Carrard y Linder,
1999); 4) celulasa atrapamiento por los poros de la celulosa (Lee et al,
1983).; y 5) adsorciones de múltiples componentes de celulasa en la que
cada componente tiene diferentes constantes (Beldman et al., 1987). A la luz
de estas consideraciones, se han propuesto varios modelos de equilibrio que
representan alternativas a la simple adsorción Langmuir, incluyendo los
modelos de adsorción twosite (Linder et al, 1996;. Medve et al, 1997;..
Stalhberg et al, 1991;. Woodward et al, 1988a), las isotermas de Freundlich
(Medve et al., 1997), y combinados isotermas de Langmuir de Freundlich
(Medve et al., 1997).
parámetros de Langmuir para la adsorción de celulasa se presentan en la Tabla
II, con un énfasis en los sistemas de celulasa no complejados. Aunque las
variaciones de ancho se observan en los valores de parámetros para diferentes
combinaciones de enzima, sustrato, y la temperatura, la reproducibilidad entre las
mediciones de diferentes laboratorios adoptadas para la misma enzima bajo un
conjunto dado de condiciones es bastante buena. Consideremos, por ejemplo, los
valores de las fuentes de fromdifferent T. reesei
celulasas enumerados en la Tabla II, incluyendo CBH1 en BMCC en 4 j C
(Reinikainen et al, 1995b;.. Srisodsuk et al, 1993) y 50 j C (Bothwell et al.,
1997; Tomme et al, 1995b.), CBH1 en Avicel a 20-25 j C (Kim y Hong, 2000;
Stahlberg et al, 1991;. Tomme et al., 1990), y celulasa no fraccionada
adsorber a Avicel en 4 j C (Lee et al, 1982;.. Lu et al, 2002;. Ooshima et al,
1983). Esta reproducibilidad sugiere que los métodos experimentales para la
medición de parámetros de adsorción pueden ser suficientemente
normalizados tal que los valores de diferentes laboratorios pueden
compararse significativamente. Sugerimos que puede ser útil para calibrar
técnicas con las mediciones realizadas en condiciones bien caracterizados
cuando la presentación de datos de adsorción. Además de las variables
experimentales, diferentes métodos de regresión pueden llevar a diferentes
valores para los parámetros (Bothwell y Walker, 1995).
Ghose y Bisaria (1979) encontraron que las endoglucanasas adsorben
preferentemente en relación con celobiohidrolasas. Pero Ryu et al. (1984)
encontraron que la celulasa contenía fuertemente ad-
804 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004
celobiohidrolasas sorbidos, algunos EG1 débilmente unida, y
endoglucanasas no adsorbidos distintos de EG1. Ooshima et al. (1983)
encontraron que la adsorción relativa de T. viride
endoglucanasas y celobiohidrolasas se temperaturedependent, con
endoglucanasas adsorbe preferentemente en 5 j C, y celobiohidrolasas
preferentemente consolidados a 50 j C. Por el contrario, Kyriacou et al. (1989)
encontraron que la adsorción de
T. reesei CBH1 era más fuerte que la adsorción de EG1-3 en Solka Floc a
las 5 j C, pero que la adsorción preferencial de CBH1 fue disminuida a 50 j C,
y tal adsorción preferente también se observó a ser menos pronunciada con
la disminución de la fuerza iónica. Joeh et al. (2002) informaron de que la
adsorción combinado de T. fusca celulasas Cel5A, Cel6B, y Cel9A fue
menor que la suma de adsorción individuo a baja temperatura, pero
superior a 50 j C en BMCC.
La mayoría de los primeros estudios publicados han ocupado de la
reversibilidad de la adsorción de celulasa mediante la medición de la cantidad de
enzima liberada en la solución como la hidrólisis de celulosa progresó (Huang,
1975; Lee y Fan, 1982; Mandels et al, 1971;. Moloney y Coughlan, 1983). Pero
Beltrame et al. (1982) determinaron que la adsorción de la proteína consistió en
medidas irreversibles, que se cree que surgen de los cambios conformacionales
de la proteína sobre la adsorción. Wald et al. (1984) contradice la constatación
del Beltrame informando que celulasa adsorbido se puede eliminar por lavado
con tampón. El uso de celulasa fraccionado, Kyriacou et al. (1989) de adsorción
celulasa encontrado era irreversible, mientras que Beldman et al. (1987) de
adsorción celulasa encontrado para ser parcialmente reversible. El uso de
celulasas radiomarcados desde T. reesei,
Palonen et al. (1999) encontraron que la desorción de CBH2 en respuesta a
dilución de la muestra mostró histéresis (60-70% reversible), mientras que la
desorción de CBH1 fue de más de 90% reversible. Nidetezky et al. (1994b)
sugirió que T. reesei
adsorción CBH1 es parcialmente reversible debido a su estructura
bifuncional. La adsorción de T. reesei CBH1 CBM en celulosa
microcristalina se informó a ser reversible (Linder y Teeri, 1996), mientras T.
reesei CBH2 CBM no podía disociarse de celulosa (Carrard y Linder,
1999). La adsorción de las MCM desde T. fusca Cel5A, Cel6B, Cel48A en
BMCC era reversible a baja concentración pero no se observó irreversibilidad
a altas concentraciones de celulasa, aparentemente debido al atrapamiento
intersticial (Jung et al., 2002).
En un reactor discontinuo agitado, la intensidad de la agitación tiene poco efecto
sobre la hidrólisis de celulosa, siempre y cuando las partículas de celulosa se
suspenden completamente (Huang, 1975). Jervis et al. (1997) estudiaron la difusión
superficial de Cellulomonas fimi celulasas Cex y CenA en la superficie de Valonia
ventricosa
celulosa microcristalina usando recuperación después de fluorescencia
photobleaching (FRAF). Basado en la comparación del valor de coeficiente de
difusión y la actividad celulasa específica, estos investigadores inferirse que la
difusión externa de celulasa no es un factor limitante de la velocidad para toda la
reacción. En general, los experimentos que examinan velocidad de agitación
también sugieren que la difusión externa de celulasa en la superficie no es limitante
de la velocidad (Fan et al, 1981;. Fan y Lee, 1983). Pero cuando el área interna es
mucho más grande que la superficie externa, la cual
Tabla II. Resumen de Langmuir parámetro celulasa adsoprtopm para celulasas no complejas y sus dominios de unión a celulosa únicos.

UNA máx Kp L / g (L / UNA RL / g

Tensión celulasa sustrato una Temperatura. ( j DO) mg / g ( UNA mol / g) mol) Celulosa Referencia

T. reesei CBH1 BMCC 50 (4,6) (0,28) 1.29 Bothwell et al., 1997

T. reesei CBH1 BMCC 4 (6,0) (8,33) 50 Reinikainen et al., 1995b
T. reesei CBH1 BMCC 4 (4,2) (7,14) 30 Srisodsuk et al., 1993
T. reesei CBH1 BMCC 50 (2,63) (4,03) 10.6 Tomme et al., 1995b
T. reesei CBH1 Avicel 50 (0,48) (0,09) 0,043 Bothwell et al., 1997
T. reesei CBH1 Avicel 20 69 (1.1) (0.278) 0.30 Stahlberg et al., 1991
T. reesei CBH1 Avicel 25 70 (1.07) (0,01) 0,011 Tomme et al., 1990
T. reesei CBH1 Avicel 4 48 (0.74) (0,93) 0.69 Medve et al., 1997
T. reesei CBH1 Avicel 20 51.8 0,0192 0.99 Kim y Hong, 2000
T. reesei CBH1 Avicel 40 40 0,0123 0.53 Kim y Hong, 2000
T. viride CBH3 (CBH1) Avicel 30 63 6.92 0,436 Beldman et al., 1987
T. reesei CBH1 Papel de filtro 50 (0,17) (1,41) 0.24 Nidetzky et al., 1994c
T. reesei CBH2 Avicel 25 64 (1.10) (0,01) 0,011 Tomme et al., 1990
T. reesei CBH2 Avicel 4 28 (0.52) (1,92) 1.0 Medve et al., 1997
T. reesei CBH2 Avicel 20 54.3 0,0071 0,039 Kim y Hong, 2000
T. reesei CBH2 Avicel 20 48.9 0,0066 0,033 Kim y Hong, 2000
T. viride CBH2 Avicel 30 6.6 4.96 0,037 Beldman et al., 1987
T. reesei CBH2 Papel de filtro 50 (0.258) (0,95) 0,246 Nidetzky et al., 1994
T. reesei EG1 Papel de filtro 50 (0.166) (0,56) 0,093 Nidetzky et al., 1994
T. viride EG1 Avicel 30 126 0.88 0,111 Beldman et al., 1987
T. viride EG2 Avicel 30 90 0.28 0,025 Beldman et al., 1987
T. viride EG3 Avicel 30 26 11.67 0,303 Beldman et al., 1987
T. viride EG4 Avicel 30 2.8 2.5 0,007 Beldman et al., 1987
T. viride EG5 Avicel 30 105 0.89 0,094 Beldman et al., 1987
T. viride EG6 Avicel 30 4.1 3.44 0,014 Beldman et al., 1987
T. reesei EG3 Papel de filtro 50 (0.308) (0,91) 0.28 Nidetzky et al., 1994
T. reesei total Avicel 5 55.6 3.21 0,178 Ooshima et al., 1983
T. reesei total Avicel 4 64 1.23 0,079 Lee et al., 1982
T. reesei total Avicel 4 95.2 0.3 0,029 Lu et al., 2002
T. reesei total CAPP 4 1224 0.06 0,073 Lee et al., 1982
T. viride total Algodón 2-8 78-89 1,3-1,48 0.2 Beltrame et al., 1982
C. thermocellum CBM CIPA Avicel 25 10 (0.54) (2,5) 1.35 Morag et al., 1995
C. thermocellum CBM CIPA CAPP 25 200 (1.08) - - Morag et al., 1995
C. cellulovorans CBM CbpA Avicel 37 (2,1) (1) 2.1 Goldstein et al., 1993
C. cellulovorans CBM CbpA Ab. Connecticut. 37 (6,4) (1,25) 8 Goldstein et al., 1993
C. cellulovorans CBM CIPA Pensión completa. Celulosa 37 (0,2) (1,4) 0.28 Goldstein et al., 1993
C. thermocellum CBM Ce1K PASC (17.1) - (2,33) Ketaeva et al., 2001
C. thermocellum CBM Ce1K BMCC (3,95) - (9,87) Ketaeva et al., 2001
C. fimi CBM Cex PASC 22 40 - Ong et al., 1993
C. fimi CBM Cex Avicel 22 3 Ong et al., 1993
C. fimi CBM Cex BMCC 22 13.3 Ong et al., 1993
T. fusca CBM E3 BMCC 50 (1,65) (0.124) 2.05 Bothwell et al., 1997
T. fusca CBM E3 Avicel 50 (1.77) (0.182) 0,322 Bothwell et al., 1997
T. reesei CBM CBH1 BMCC 22 1.5 Palonen et al., 1999
T. reesei CBM CBH2 BMCC 22 1.0 Palonen et al., 1999

una Ab. Ct, algodón absorbente.; celulosa Fb, algodón fibroso.

es el caso para la mayoría de sustratos celulósicos, es probable que algunos de celulasa está
atrapado en los poros, dando como resultado velocidades de hidrólisis más bajas.
Análisis espacial de adsorción y inferido Accesibilidad de
Celulosa
Análisis de adsorción en términos espaciales es un requisito previo para la
comprensión de hidrólisis de la celulosa a un nivel mecanicista, y también proporciona
un enfoque potencialmente poderosa para la evaluación de la accesibilidad de
enzimas de celulasa. El área OC-
cupied por una molécula de celulasa adsorbido es mucho más grande que el
área de la red celobiosa repetición (mostrado en la Fig. 1b) para todas las
celulasas para el que se dispone de información. Como resultado, el número de
moléculas de celulasa que se puede unir a una superficie de celulosa es, en
general, sustancialmente menor que el número de celosías celobiosa accesibles
sobre esa superficie. Adsorción de celulasa exhibe una preferencia por el 110
cara (Fig. 1b) en tanto T. reesei CBH1 (Chanzy et al, 1984;. Lehtio et al., 2003) y C.
fimi celulasas (Gilkes et al.,
1992). Parece razonable plantear la hipótesis de que esto es cierto en general ya
que esta es la cara en la que h- enlaces glucosídicos son accesibles por celulasa.

Zhang y LYND: SISTEMAS celulasa no complejados 805

Tabla III. Las actividades específicas de Trichoderma componentes de celulasa sobre sustratos de celulosa insolubles.

Tensión Enzima Temperatura. ( j DO) La actividad específica (sustrato) ( UNA mol GE / mg / min) Referencia

T. viride CBH 40 0,42 (Av) Berghem y Pettersson, 1973

T. viride CBH 40 0,53-1,0 (AC) Gum y Brown, 1977; Gritzali y Brown, 1978
T. reesei CBH 50 0,08 (FP) Ryu et al., 1984
T. reesei CBH1 50 0,014 (Av), 0,039 (AC) Tomme et al., 1988
T. reesei CBH1 50 0,22 (FP) Nidetzky et al., 1994c
T. reesei CBH1 40 0.0175 (Av) van Tilbeurgh et al., 1984
T. reesei CBH1 50 0,065 (Av) * Baker et al., 1998
T. reesei CBH1 45 0,04 (Av), 0,6 (AC) Shoemaker, 1983
T. reesei CBH1 40 0,012 (Av) *, 0.0046 (FP) * Henrissat et al., 1985
T. viride CBH III (CBH1) 30 0,019 (Av), 0,03 (AC) Beldman et al., 1985
T. reesei CBH2 50 0,36 (FP) Nidetzky et al., 1994c
T. reesei CBH2 40 0.0391 (Av) van Tilbeurgh et al., 1984
T. reesei CBH2 50 0,027 (Av), 0,052 (AC) Tomme et al., 1988
T. reesei CBH2 50 0,065 (Av) * Baker et al., 1998
T. reesei P.EJ 50 0,18 (FP) Ryu et al., 1984
T. reesei P.EJ 50 3,6 (AC) Niku-Paavola et al., 1985
T. reesei EG1 45 0,17 (Av), 26 (AC) Shoemaker, 1983
T. reesei EG1 40 0,0046 (Av) *, 0,0023 (FP) * Henrissat et al., 1985
T. viride EG 3 (EG1) 40 0,13 (Av), 9,9 (AC) Gritzali y Brown, 1978; Shoemaker, 1978
T. viride EG 3 (como EG1) 30 0,196 (Av), 0,45 (AC) Beldman et al., 1985
T. reesei EG1 50 0,045 (Av) * Baker et al., 1998
T. reesei EG1 50 1,20 (FP) Nidetzky et al., 1994c

* Mucho tiempo de incubación.

Gilkes et al. (1992) parámetros definidos compatible con una interpretación BMCC se ha usado en la mayoría de los estudios dirigidos a la determinación de
espacial de adsorción y incorporado estos parámetros en una ecuación de valores de los parámetros para el análisis espacial de adsorción. Esto es
Langmuir modificada: probablemente debido a la geometría de BMCC está bien establecida, en contraste
con la mayoría de otros substratos celulósicos. En particular, BMCC existe como una

mi una ¼ norte 0 K PAG 0 mi F re 9 Þ

1 þ una K PAG 0 mi F
donde N 0 = UNA mol celobiosa accesible celosías / g de celulosa,
a = celosías celobiosa ocupado molécula de celulasa / unido, K PAG V = K PAG/ a.
cinta de microfibra con una sección transversal de 15 40 nm, en el que el más estrecho
de las dos caras es la superficie reactiva. Sobre la base de una densidad de celulosa
de 1,5 a 1,63 g / cm 3, Gilkes et al. (1992) y Reinikainen et al. (1995b) estimado N 0 para
BMCC al 93-100 UNA mol celobiosa celosía / g.

Puede observarse molécula de celulasa que las celosías celobiosa ocupados
/ atado, una, puede calcularse a partir de:
una ¼ norte 0 = UNA máx
Para una celulasa con un valor dado de una, el área de superficie accesible a
que celulasa (AS, m 2 / g) puede calcularse a partir de la capacidad máxima de
adsorción como sigue:
En este momento, la mayor cantidad de información relevante para estimar el valor
de una está disponible para su C. fimi y T. reesei.
por C. fimi, Gilkes et al. valores (1992) de estimación de 32,9,
re 10 Þ
39.2 y 27.9 para Cena, el dominio de unión a celulosa de Cena, y Cex,
respectivamente. El dominio catalítico de CBH1 se cree que ocupar
aproximadamente 48 retículas de celobiosa en una superficie totalmente
anisotrópico (Sild et al., 1996), basado en información estructural inferirse de
cristalografía de rayos X (Divne et al., 1994). El CBM de CBH1 de T. reesei se

COMO ¼ UNA máx norte UNA una UNA sol 2 re 11 Þ

cree que ocupar aproximadamente 10 retículas celobiosa basado en datos
de resonancia magnética nuclear (Kraulis et al, 1989;.. Reinikainen et al,

donde N A = constante de Avogadro (6,023 10 23 moléculas / mol), A G2 = área 1995b). Reinikainen et al. (1995b) informaron de un rango de valores para UNA
máx para CBH1 unión a BMCC, a partir de qué valores de una 15 a 40 puede
de la red celobiosa (0,53 1,04 nm =
5.512 10 19, metro 2; Gardner y Blackwell, 1974a). ser calculado usando la Ec. [10]. Estos autores estiman un valor de

El valor de COMO es dependiente del valor de una, que variará alrededor de 40 para una, que es muy cercano al valor de 38,7 estimado por

dependiendo de la enzima está bajo consideración. Para sustratos de Tomme et al. (1995b) y es intermedio entre el tamaño del dominio catalítico y

celulosa pura, la fracción de el CBM. Desde la unión de CBHI se produce principalmente a la cara

h- enlaces glucosídicos accesibles a celulasa con respecto al número total de reactiva de BMCC (Chanzy et al, 1984;. Gilkes et al, 1992;.. Lehtio et al,

enlaces glucosídicos (F una) Se define como: 2003), el valor de una también puede estimarse a partir de la relación del
área de superficie reactiva a la superficie total de
F una ¼ 2 una UNA máx MW anhidroglucosa re 12 Þ

donde MW anhidroglucosa = 162 g / mol de anhidroglucosa.

806 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004

área, 15 / (15 + 40) = 0,27. Basado en este valor, una para BMCC se puede
calcular como sigue:
una ¼ norte 0 = UNA máx ¼ doce y veintisiete S = re UNA máx UNA G2 norte UNA Þ re 13 Þ
donde S es el área de la superficie externa total de BMCC de su forma
geométrica = 1 kg BMCC / (1,5 a 1,63 10 3 kg / m 3) /
(15 10 9 m * 40 10 9 m) * 2 * (15 + 40) 10 9 m =
122-112 m 2 por g BMCC. Si A max = 6 UNA mol CBH1 / g BMCC (Reinikainen
et al., 1995b), a = 15,3-16,7 celosía celobiosa por adsorbido CBH1. Es
importante tener en cuenta que el valor inferido de una está influenciado por
las condiciones experimentales tales como la temperatura y la fuerza iónica
(Reinikainen et al., 1995b).
Sobre la base de un representante UNA máx valor de 4,6 UNA mol / g para
CBH1 adsorción a BMCC en 50 j C (Tabla II) y una en el rango de 15-40,
como valores para BMCC de 23-61 m 2 / g puede calcularse utilizando la
ecuación. [11]. Este valor corresponde al 18-50% del total de la superficie
externa de la cinta MBCC (15 m 2 / sol). A pesar de una valor, parece que la
celulasa no se adsorbe a una fracción significativa de la superficie externa de
BMCC.
Para Avicel (FMC PH105), 0,48 UNA mol / g es un representante A máx valor
para la adsorción CBH1 en 50 j C (Tabla II), de la que el AS CBH1 de Avicel se
encuentra que es 6,4 m 2 / g usando la Ec. [10] con un valor de 40 asumido para a.
el AS CBH1 valor de Avicel PH 105 es mucho más grande que el área de la
superficie externa (0,3 m 2 / sol; Weimer et al., 1990), indicando que
> F 95% de área accesible es interna. Sin embargo, como CBH1 es mucho menor
que la superficie total accesible al nitrógeno, F 20 m 2 para Avicel (Marshall y
Sixsmith, 1975), indicativo de la presencia de una amplia área de superficie
interna en poros demasiado pequeños para ser visitada por moléculas de
celulasa. Consideración de Avicel y BMCC muestra claramente que la magnitud
del área de la superficie externa, interna, y bruto, así como la importancia
relativa de estos, es bastante diferente para diferentes sustratos. Usando la
ecuación. [12] con a = 40, F una se encuentra que es 6,0% para BMCC y 0,62%
para Avicel.
Los datos disponibles sugieren que el área accesible a las enzimas
celulasa, como se indica, por ejemplo, por AS CBH1,
varía ampliamente dependiendo del sustrato. Además de la diferencia de 10 veces para
AS CBH1 se ha indicado anteriormente para BMCC en comparación con Avicel, los
estudios usando no fraccionada T. reesei
celulasa han informado de una 3 veces mayor capacidad de adsorción de
celulasa para Solka Floc SW40 en comparación con Avicel, y una 20-carpeta
mayor capacidad para PASC comparación con Avicel (Lee et al, 1982 (Steiner
et al., 1988);. Morag et al ., 1995). zona accesible en el orden Avicel <BMCC
<PASC también es apoyado por los datos de los CBM aislados a partir de C.
fimi ( Ong et al., 1993) y de Celk de C. thermocellum
(Kataeva et al., 2001).
Para materiales lignocelulósicos pretratados, la adsorción a la lignina
típicamente se produce al mismo tiempo que la adsorción a la celulosa. Ooshima
et al. (1990) estimaron que la capacidad máxima de adsorción para no
fraccionada T. reesei celulasa con respecto tanto a la celulosa y la lignina
presente en la madera dura diluida-acidpretreated. Encontraron la capacidad de
adsorción
Zhang y LYND: SISTEMAS celulasa no complejados
para la celulosa (a diferencia de lignina) aumento de 14,1 a 80,6 mg de celulasa por
gramo de celulosa como la temperatura de tratamiento previo aumentó de 180-220 j C,
mientras que la capacidad de lignina disminuyó desde 100 hasta 12,3 mg de
celulasa / g de lignina en el mismo rango de temperatura. Lu et al. (2002),
trabajando también con no fraccionada T. reesei celulasa, informaron capacidades
de adsorción de celulasa de 180 mg / g de celulosa con relación a la fracción de
celulosa de abeto Douglas elaborado por SO 2- explosión de vapor catalizada
seguido de tratamiento con peróxido, y 95,2 mg de celulasa / g Avicel. Estos
resultados sugieren que la accesibilidad de la celulosa presente en la biomasa
pretratada puede variar significativamente en función de las condiciones, pero a
menudo es de una magnitud comparable a Avicel.
hidrólisis de la celulosa
Sobre el mecanismo de hidrólisis de la celulosa (no
complejados Systems)
A partir de la hipótesis original de Reese para la acción de C1 (Reese et al,
1950, 1968;. Reese, 1976), ha habido sugerencias de que el mecanismo
de hidrólisis de la celulosa implica la ruptura física de la celulosa insoluble
además de endo- y exo-actuación enzimas. La importancia de tales
trastornos, así como los componentes de celulasa responsables de la
misma, aún no está del todo claro. Coughlan (1985) utilizó el término ''
amorphogenesis '' para describir los cambios físicos (es decir, hinchazón,
segmentación, o desestratificación de celulosa) que potencian la hidrólisis
enzimática y rinden celulosa cristalina más accesible a celulasa. El
aumento de la accesibilidad de celulosa durante la hidrólisis enzimática se
ha atribuido a muchos factores. Estos incluyen H 2 O 2 producción en
presencia de iones Fe (Koenigs, 1975), o el factor de formación de
shortfiber-en filtrados de T. koningii ( Halliwell y Riaz, 1970), o T. reesei CBH1
(Chanzy et al, 1983;.. Lee et al, 2000) (. Lee et al, 1996) o su dominio
catalítico o el dominio catalítico CBH2, (Woodward et al., 1992)
T. reesei complejo endoglucanasa-exoglucanasa (Sprey y Bochem, 1993), Humicola
insolens CBH2 (Boisset et al.,
2000), Thermomonospora fusca celulasas E3 y E5 (Walker et al., 1990,
1992), algunos dominios no catalíticos de celulasa tales como el CBM de C.
fimi endoglucanasa A (Din et al., 1991, 1994), un polipéptido corto
generación de fibra de T. pseudokoningii ( Wang et al., 2003), una T. reesei
proteína formador de fibrillas (MW = 11,4 kD) (Banka et al., 1998), y una
novela T. reesei proteína llamada swollenin (MW = 49 kD) (Saloheimo et al.,
2002).
Se observa ampliamente que la estructura heterogénea de celulosa da lugar
a una rápida disminución de la frecuencia a medida que avanza la hidrólisis,
incluso cuando se toman los efectos de la desactivación celulasa y la inhibición
del producto en cuenta (Zhang et al., 1999; Valjamae et al, 1999. ). Al explicar
esta observación en un nivel mecanicista es una cuestión pendiente, con
importantes implicaciones fundamentales y aplicadas. Aunque muy poco se ha
hecho que implica una caracterización detallada, parecería lógico esperar que la
disminución de la reactividad
807
de celulosa residual durante la hidrólisis enzimática es el resultado de factores tales
como menos área de superficie y un menor número de extremos de cadena
accesible y / o adsorción de celulasa inactivo en la superficie de partículas de
celulosa (o lignocelulosa) que bloquean la hidrólisis adicional. A un nivel
macroscópico, tanto en el área accesible de la celulosa (basado en el ensayo de
BET;. Fan et al, 1980) y la capacidad de la celulasa de adsorción (. Ooshima et al,
1983) se ha informado por gramo de celulosa para disminuir con el aumento de la
hidrólisis. Los autores especulan que la disponibilidad de los extremos de la cadena
de glucano y por gramo también puede disminuir con la conversión. A nivel
microscópico, la
T. reesei CBH1 interrumpe fibras, lo que resulta en una mayor área de superficie (Lee
et al., 1996), mientras que EG II parece suavizar superficie de la fibra, lo que resulta
en menos área de superficie (Lee et al., 2000). Además fresca de sustratos puede
estimular la liberación de azúcar más soluble (Carrard et al., 2000), indicando también
la pérdida de la reactividad de celulosa al final de la hidrólisis y / o aumento de la
reactividad de '' nuevos '' encuentros celulasa / celulosa en comparación con ' 'viejos''
encuentros.
Cuando los sistemas de enzima celulasa actúan in vitro sobre sustratos celulósicos
insolubles, tres procesos ocurren simultáneamente:
1) cambios físicos en el residual (todavía no solubilizado) celulosa en fase
sólida química y; 2) hidrólisis primaria, que implicaba la liberación de
intermedios solubles a partir de la superficie de reacción de moléculas de
celulosa; y 3) la hidrólisis secundaria, que implica la hidrólisis de los
intermedios solubles para bajar intermedios peso molecular, y en última
instancia a la glucosa, como se muestra en la Figura 3. Los cambios
químicos en celulosa residual se manifiestan como cambios en la DP y la
concentración final de la cadena. Endoglucanasa aumenta la
concentración de extremos de cadena y disminuye significativamente DP
atacando porciones interiores de las moléculas de celulosa.
Exoglucanasas acortan DP de forma incremental y sólo ocasionalmente
disminuir la concentración de extremos de cadena. Así,
Figura 3. hipótesis mecanicista de la hidrólisis enzimática de la celulosa por T. reesei celulasa.
808 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004
desempeña un papel menor en el cambio de las propiedades químicas de celulosa
residual. Los cambios físicos en celulosa residual se manifiestan como cambios en el
área superficial accesible debido a los cambios geométricos que resultan del
consumo o la ampliación de la superficie accesible de la celulosa debido a la
solubilización progresiva. Más especulativamente en la actualidad, los componentes
de sistemas de enzimas celulasa puede hacer un área superficial adicional disponible
por mecanismos distintos de la hidrólisis per se.
Dado que la tasa de hidrólisis secundaria es mucho más rápido que la
velocidad de hidrólisis primaria, es posible, aunque en este
punto-especulativa que celodextrinas solubles podría ser responsable de
una fracción significativa de los productos inmediatos de hidrólisis primaria,
pero no ser detectado. Durante la hidrólisis enzimática, celodextrinas con
DP> 4 están presentes en la fase sólida asociado con celulosa cristalina
(Kleman-Leyer et al, 1994, 1996;. Srisodsuk et al, 1998;.. Stalbrand et al,
1998), y ha sido sugiere que esta asociación impide la liberación de esos
celodextrinas a solución. Sin embargo, celodextrinas con DP> 4 no se
encuentra asociado con la celulosa amorfa (Stalbrand y col.,
1998). Por lo tanto, la hidrólisis enzimática de celodextrinas de longitud 4-6
asociada con la fase sólida puede ser una parte importante del proceso
general de solubilización para sustratos cristalinos, pero no para sustratos
amorfos.
La mayoría de los datos disponibles sobre la hidrólisis de celulosa se refiere a la
velocidad de solubilización (proceso 2) anterior, a menudo basado en la liberación de
azúcares reductores o equivalentes de glucosa soluble. En nuestra opinión, una
mejor caracterización de los cambios químicos y físicos asociados con la celulosa
residual, así como la hidrólisis secundaria son prometedoras áreas de investigación
con el fin de mejorar la comprensión fundamental de la hidrólisis de la celulosa.
Trichoderma reesei Sistema de celulasa
Las celulasas del género Trichoderma han recibido una atención intensiva debido en
parte significativa de los altos niveles de celulasa secretada. Trichoderma viride es
un agregado de especies válidas, que se utiliza para todos desconocida Trichoderma
especies; mientras que todos T. reesei se desarrolló a partir de un único aislado
(QM6a), llamado así en reconocimiento de las contribuciones pioneras de Elwin
Reese. La mayoría de las celulasas comerciales se producen a partir Trichoderma spp.,
con unos pocos también producido por Aspergillus niger ( Esterbauer et al., 1991;
Nieves et al.,
1998). Se remite al lector a los últimos exámenes exhaustivos que abordan
características de los sistemas no complejados celulasa / hemicelulasa
producidas por organismos que no sean
T. reesei ( Bhat y Bhat, 1997; Broda et al., 1996; Ito, 1997; Shallom y
Shoham, 2003; Singh et al., 2003; Subramaniyan y Prema, 2000; Tomme
et al., 1995a; Warren, 1996; Wilson, 2004).
los T. reesei mezcla de celulasa se compone de muchas proteínas
catalíticamente activas. Al menos dos celobiohidrolasas (CBH1-2), cinco
endoglucanasas (EG1-5), h- glucosidasas, y hemicelulasas se han
identificado por electroforesis 2D (Vinzant et al., 2001). CBH1, CBH2 y
EG2 son los tres componentes principales de la T. reesei cellu-
sistema lase, lo que representa 60 F 5%, 20 F 6%, y 12 F 3% de proteína de
celulasa total, respectivamente (Goyal et al, 1991;. Gritzali y Brown, 1978;.
Knowles et al, 1987;. Kyriacou y otros, 1987; Nidetzky y Claeyssens, 1994).
preparaciones de celulasa reconstituidas a base de componentes purificados
en estas proporciones exhiben actividad específica equivalente a las
preparaciones no fraccionadas (Baker et al., 1998). La estructura de CBH1,
CBH2, y EG1 dispone de un dominio catalítico y un dominio de unión a
celulosa conectadas por un enlazador peptídico glycolysated (Gilkes et al,
1991;. Lee y Brown, 1997; Linder y Teeri, 1997).
Las estructuras de dominio catalítico de CBH1 y CBH2 son completamente
diferentes pero ambos cuentan con estructuras en forma de túnel formado por
puentes disulfuro. En CBH2, dos bucles bien ordenados forman una 20 un largo
túnel adyacente a una una/ h- estructura de cañón (Rouvinen et al., 1990). En
CBH1, cuatro bucles de superficie forman un túnel de 50 A adyacente a una h- estructura
temporales de bucles en la estructura del túnel que exponen sus sitios
sandwich (Divne et al., 1993, 1994). La topología en forma de túnel de CBH1 y
CBH2 permite una interpretación estructural de la acción processive de
exoglucanasa. Los sitios catalíticos de ambos celobiohidrolasas están dentro del
túnel cerca de la salida, de modo que h- enlaces glucosídicos se escinden
mediante la retención (CBH1) o invirtiendo mecanismos (CBH2). Los análisis
estructurales, a diferencia de la medición de productos de hidrólisis, proporciona
evidencia directa de que la celobiosa es el producto primario de la hidrólisis
mediada por CBH1 y CBH2 (Divne et al, 1993, 1994;. Davies et al., 1997). los
T. reesei CBH1 y CBH2 pueden escindir varios enlaces después de un solo
evento de adsorción antes de la disociación del complejo enzima sustrato
(Imai et al, 1998;.. Teeri et al, 1998a, b;. Valjamae et al, 1998). Por lo tanto,
la acción de CBH1 y CBH2 resultar en una disminución gradual en el grado
de polimerización (DP) de la celulosa (Kleman-Leyer et al.,
1992, 1996; Srisodsuk et al., 1998). actividad de celobiohidrolasa se mide a menudo
mediante la reducción de la liberación de azúcar de Avicel, a menudo llamado
'actividad' Avicelasa ''. Avicel es un buen sustrato para medir la actividad de
exoglucanasa, aunque no exclusivamente, debido a que tiene la proporción más alta
de la cadena termina a interno accesible h- enlaces glucosídicos entre sustratos
celulósicos modelo (véase la Tabla I y la adsorción, más arriba).
EG1 y CBH1 tienen una homología significativa (45% de identidad, Penttila et
al., 1986), pertenecen a la misma familia (Cel7), y tanto el uso de un mecanismo
de retención. El sitio activo de EG1 es una ranura en lugar de un túnel
(Henriksson et al., 1996), lo que permite cadenas de glucano a ser escindidos
aleatoriamente a dos cadenas más cortas que resulta en una rápida disminución
de DP (KlemanLeyer et al, 1992, 1994;. Srisodsuk et al, 1998;. Whitaker, 1957;
Selby, 1961; madera y McCrae, 1978). actividad de endoglucanasa se mide con
mayor frecuencia en base a la tasa de cambio de la viscosidad de un derivado
de celulosa soluble, tal como carboximetilcelulosa (CMC) (Miller et al, 1960;.
Madera y McCrae, 1972). Se puede observar que la actividad CMCasa se ha
demostrado que se correlaciona pobremente con la capacidad para hidrolizar
celulosa insoluble incluso para endoglucanasas purificadas (Himmel et al, 1993;.
Klyosov, 1988; Klyosov,
1990). De tres purificado T. viride endoglucanasas obtenido por zapatero y
Brown (1978), el uno exhibiendo la
Zhang y LYND: SISTEMAS celulasa no complejados
mayores tasas de hidrólisis Avicel tenían la actividad CMCasa más bajo.
Klyosov (1990) señaló claramente que las actividades de endoglucanasa
específicos de muchos microorganismos medidos en CMC no se correlacionan
con las actividades contra la celulosa insoluble.
Es evidente que la división en endo- y exoglucanasas es en muchos
casos no absoluta (Barr et al, 1996;. Irwin et al, 1993;. Henrissat y Davies,
1997; Teeri, 1997; Teeri et al, 1998a, b. ). Irwin et al. (1993) documentaron
una endoglucanasa processive en T. fusca E4. Algo de actividad
endoglucanasa es exhibida por la T. reesei CBH2 (Enari y NikuPaavolar,
1987;. Kyriacou y otros, 1987) y CBH1 (Schmid y Wandrey, 1990), así como
la H. insolens CBH2 (Boisset et al., 2000). Stahlberg et al. (1993)
concluyeron que todos T. reesei celulasas tenían alguna actividad
endo-actuar. Se ha sugerido que exoglucanasa podría exhibir alguna
actividad endoglucanasa debido a los cambios conformacionales
activos (Warren, 1996; Zhang y Wilson, 1997). Esta hipótesis está apoyada
por la observación de que la interrupción de los bucles que comprenden el
túnel de resultados exoglucanasa en aumento de la actividad
endoglucanasa, así como mayor k gato
(Kleywegt et al, 1997;.. Meinke et al, 1995). Además, se puede observar que
CBH2 contiene menos bucles a lo largo del túnel catalítico y presenta una
mayor actividad de endoglucanasa en relación con CBH1.
La eliminación del CBM de Trichoderma resultados celulasas en una
reducción de varias veces en la tasa de hidrólisis de la celulosa insoluble
pero tiene poco efecto en la hidrólisis de sustratos solubles (Glikes et al,
1988;. Irwin et al, 1994;. Reinikainen et al., 1992; Srisodsuk et al ., 1997;
Stahlbeg et al, 1993;.. Tomme et al, 1988). los T. reesei CBMs pertenecen a
la familia 1 (CBM1), caracterizado por un pequeño cuneiforme doblar que
ofrece una superficie de unión a celulosa con tres residuos aromáticos
expuestas (Hoffren et al, 1995;.. Lehtio et al., 2003; Kraulis et al, 1989). Se
cree que estos residuos aromáticos ser crítica para la unión de un CBM1
en celulosa cristalina. La separación de los tres residuos aromáticos
coincide con el espaciado de cada segundo anillo de glucosa en una
cadena de glucano, y se ha postulado que los aminoácidos aromáticos de
las MFC forman interacciones de van der Waals e interacciones de
polarización anillo aromático con los anillos de piranosa de la superficie de
celulosa (Lehtio et al., 2003).
Las actividades específicas de T. reesei EG1, CBH1, y CBH2 en varios
sustratos celulósicos insolubles se presentan en la Tabla III. Los datos muestran
una variabilidad sustancial incluso para las preparaciones de enzimas
aparentemente similares y sustratos. A pesar de esta variación, los datos apoyan
las siguientes observaciones: 1) algunos valores temprana para la actividad
exoglucanasa y endoglucanasa eran más altos que los valores reportados más
recientemente, posiblemente debido al uso de preparaciones de enzimas pureza
inferiores en estudios anteriores; 2) velocidades medidas en tiempos de reacción
más largos son mucho más lentos que los de tiempos más cortos, que aparece
debido al menos en parte a la heterogeneidad de celulosa (Klyosov, 1990;
Valjamae et al, 1998;.. Zhang et al, 1999); y 3) la velocidad de generación de
soluble
809
azúcares reductores por EG1 relación a CBH1 es J 1 para la celulosa amorfa, V 1
para Avicel, y V 1 para BMCC y algodón. La tasa relativamente baja de la
reducción de la liberación de azúcar exhibida por EG1 en celulosa cristalina es
consistente con la mayor parte de los extremos reductores generados por
actividad endoglucanasa que queda en la fase sólida, y no implica
necesariamente una menor tasa de h- la escisión del enlace glucosídico. La
actividad específica de CBH2 se ha encontrado para ser casi el doble de la de
CBH1 en la mayoría (Henrissat et al, 1985;. Medve et al, 1994;. Nidetzky et al,
1994c;.. Tomme et al, 1988) pero no todos ( baker et al., 1998) estudios.
La tabla IV presenta las actividades específicas de la T. reesei
EG1, CBH1, CBH2, y h- glucosidasa en glucanos solubles. Mientras que la
variabilidad es de nuevo evidente, pueden observarse las siguientes tendencias: 1)
la tasa de reacción catalizada por la exoglucanasa y endoglucanasa aumenta al
aumentar la longitud de la cadena sustrato soluble, mientras que la disminución de
la actividad de
h- glucosidasa con el aumento se observa longitud de la cadena en el único
estudio para el que se dispone de datos comparativos;
2) tasas significativamente más altas se observan para EG1 en comparación con CBH1 y
CBH2. La comparación de los datos en las Tablas III y
IV, puede verse que las actividades específicas de exoglucanasas y
endoglucanasas actúan sobre sustratos solubles son más altos por al menos un
orden de magnitud que las actividades sobre sustratos insolubles. Por lo tanto, la
velocidad de hidrólisis primaria (a partir de celulosa a glucanos solubles) es
mucho más lenta que la hidrólisis secundaria (de glucanos solubles para
celobiosa y glucosa).
sinergismo
El sinergismo se dice que se produce cuando la actividad exhibida por
mezclas de componentes es mayor que la suma de la actividad de estos
componentes evaluados por separado (Walker y Wilson, 1991; Madera y
McCrae, 1979; de madera y García-Campayo, 1990; Woodward, 1991 ).
representación cuantitativa del grado de sinergia es por lo general ex
presionado en términos de un '' grado de sinergismo '' (DS) -igualdad a la
relación de la actividad exhibida por mezclas de componentes dividido por
la suma de las actividades de los componentes separados. Tipos de
sinergismo propuestos en la literatura hidrólisis de la celulosa incluyen: 1)
endoglucanasa y exoglucanasa; 2) exoglucanasa y exoglucanasa
(Fagerstam y Pettersson, 1980; Tomme et al, 1988, 1990;. Madera y
McCrae, 1986; de madera y García-Campayo, 1990); 3) endoglucanasa y
endoglucanasa (Mansfield et al, 1998;. Tuka et al, 1992;.. Walker et al,
1992); 4) exoglucanasa o endoglucanasa y h- glucosidasa, lo que reduce la
inhibición por celobiosa (Lamed et al, 1991;. Woodward, 1991); 5) sinergia
intramolecular entre el dominio catalítico y CBM (Din et al, 1994) o dos
dominios catalíticos (Riedel y Bronnenmeier, 1998;. Te'o et al, 1995;..
Warren et al, 1987;. Zverlov et al, 1998 ); 6) celulosa-enzima-microbio
(CEM) sinergismo (Lynd et al, 2002).; y 7) un sinergismo proximidad
debido a la formación de complejos de celulasa (Fierobe et al.,
2001, 2002; Mandels, 1985; Schwarz, 2001). No todas las sinergias son
necesariamente operativo en cualquier situación dada. Por ejemplo, se
informó de sinergismo entre el dominio catalítico y el CBM para CenA de C.
fimi en fibras de algodón, pero no en BMCC (Din et al., 1994). sinergismo
Cell-enzima-microbio ha postulado para sistemas en los que una célula
metabólicamente activo junto con celulasa por adherencia se une a la
celulosa (Lynd et al., 2002), pero no ha sido evaluada cuantitativamente.
Sinergismo entre endoglucanasas y exoglucanasas es el tipo más
ampliamente estudiada de la sinergia y está entre los más cuantitativamente
importante para la hidrólisis de la celulosa cristalina. Como se muestra en la
Tabla V, los valores de DS más alto reportados son de BC (5-10) y algodón
(03/09 a 07/06). Menos pronunciada pero todavía sinergismo significativo se
exhibe para Avicel (DS 01/04 a 04/09), mientras que los efectos sinérgicos más
pequeños (DS 0,7-1,8) se han reportado para hinchada con ácido fosfórico y
otras celulosas amorfos tratadas con ácido. DP parece desempeñar un
importante y muy posiblemente dom-

Tabla IV. La actividad específica de Trichoderma componentes de celulasa sobre sustratos solubles.

Actividad específica ( UNA mol ruptura del enlace / mg / min) Substrato DP

Tensión Enzima Temperatura. ( j DO) G2 G3 G4 G5 G6 G7 Referencia

T. viride CBH 39 0,013 Li et al., 1965

T. reesei CBH 50 0.1 2.7 Hsu et al., 1980
T. reesei CBH1 25 0.23 van Tilbeurgh et al., 1982
T. reesei CBH1 25 0,013 Claeyssens et al., 1989
T. reesei CBH1 50 0.41 0.49 0.98 0,81 Nidetzky et al., 1994a
T. reesei CBH2 27 0,056 3.78 1.01 12.9 Koivula et al., 1998 y 2002
T. reesei CBH2 27 0,074 2.86 0.74 11.0 Harjunpää et al., 1996
T. reesei P.EJ 50 17.5 Niku-Paavola et al., 1985
T. reesei EG1 25 11 Claeyssens et al., 1989
T. viride EG III (EG1) 40 24.4 66.7 Zapatero y Brown, 1978
T. viride BG 40 33 19 Berghem y Pettersson, 1974
T. viride BG 50 58 Gong et al., 1977
T. reesie BG1 45 31.4 Shoemaker y col., 1983
T. reesie BG1 50 43.5 Chen et al., 1992
BG2 50 9.8

810 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004

Tabla V. Grado máximo informado de sinergismo exo / endo de diversos sustratos modelo. *

máximo grado de sinergia

Tensión combinación de enzimas <2 2a5 >5 Referencia

C. stercorarium Exo / endo 0.7 (a) 1.4 a 2.1 (Av) Riedel et al., 1997
C. thermocellum Exo / endo 2,5 (Av) 2,9 (FP) Tuka et al., 1992
Humicola insolens (CBH1 + CBH2) / EG1 6.8 (BC) Boisset et al., 2001
S. rolfsii CBH / EG 1,8 (AC) 4,9 (Av) 3.9 (ct) Sadana, 1985
S. pulverulentum Exo / endo 1 (AC) Streamer et al., 1975
T. koningii CBH / EG 7,6 (ct) Madera y McCrae, 1978
T. reesei CBH1 / EG1 1.3 a 1.4 (Av) Medve et al., 1998
T. reesei (CBH1 + CBH2) / EG1 1.5-2 2 ( AV) Woodward et al., 1988a
T. reesei CBH1, CBH2 / EG1 F 2 (Av) Baker et al., 1998
T. reesei CBH1 / EG1 F 1,5-2 (b) Srisodsuk et al., 1998
T. reesei CBH1 / EG1 1.7 (c) 4.1 (c) 7.8 (BC) Valjamae et al., 1999
T. reesei CBH1 / EG2 1,5 (AC) 2,1 (Av) 3,2 (ct) Hoshino et al., 1997
T. reesei CBH1 / EG2 F 6 (BC) Valjamae et al., 1999
T. reesei CBH1 / EG1 2,2 (Av), 2,5 (d) 3 (FP) 5 (BC) Henrissat et al., 1985
T. viride CBH1 / EG2 1.2 (e) 5 (f) 10 (BC) Samejima et al., 1998
T. viride Exo / endo 1,8 (AC) 1.7 a 3.5 (Av) Beldman et al., 1988
T. viride Exo / endo 2,1 (Av) Kim et al., 1992

* Av, Avicel; FP, papel de filtro; ct, algodón; BC, celulosa bacteriana; AC, celulosa amorfa; a, tratadas con ácido Avicel; b, algodón tratado con ácido; c, tratada con ácido BC; d, se homogeneizó Avicel; e,
tratada con ácido BC; f, SO 2- BC tratada.

inante papel en la determinación de si el DS es grande o pequeño. En apoyo de
esta interpretación, observamos que el orden anteriormente enumerados de
sustratos celulósicos con respecto a DS es el mismo que el orden con respecto
al grado de polimerización (ver Celulosa, arriba) y también es consistente con
los resultados de modelado (Okazaki y Moo-joven , 1978). Superior sinergia
endo-exo se ha informado de sustratos que han sido tratadas para reducir CrI,
por ejemplo, se homogeneizó Avicel vs. Avicel (Henrissat et al., 1985) y la
bola-blanqueado Solka Floc vs. Solka Floc (Fan et al., 1981). Sin embargo,
Hoshino et al. (1997) observaron DS superiores como CrI aumentó. Como se ha
señalado anteriormente en nuestra discusión de la IRC, es difícil atribuir los
cambios observados con la IRC en base a los trabajos que impliquen
tratamientos que también cambian de área de superficie accesible.
Además al sustrato propiedades, condiciones experimentales también
afectan a la extensión de la sinergia observada. Se ha informado de que la
sinergia endo-exo aumenta con un aumento en la carga de enzima debajo de
la saturación, pero disminuye con la enzima sobresaturado carga (Tuka et al.,
1992; Watson et al, 2002;.. Woodward et al, 1988a, b; Woodward,
1991). Además, se informa de tal sinergia a ser mayor en las condiciones
elegidas para minimizar la inhibición por productos de hidrólisis solubles en
algunos (Fierobe et al, 2001, 2002;. Srisodsuk et al., 1998), pero no todos
(Eriksson et al., 2002; Medve et al., 1998) estudios.
Comparación de la celulosa y almidón Hidrólisis tarifas
sis puede ser de aproximadamente 100 veces más rápido que las tasas de hidrólisis
de la celulosa en las condiciones previstas para procesos industriales y / o usando
sustratos modelo cristalino.
Además de cualquier diferencia en la reactividad intrínseca de
h- glucanos ligados en comparación con una- glucanos con enlaces, tres
propiedades de la celulosa y el almidón de influir en sus velocidades de
hidrólisis: 1) la fracción de bonos accesibles para sustratos insolubles, 2) la
disponibilidad de cadena termina para sustratos insolubles, y 3) las solubilidades
de los productos de hidrólisis. La fracción de enlaces glucosa-glucosa
accesibles, F una, varía de menos de 0,002 a 0,12 para la celulosa (basado en la
Ec. [11] con a = 40). Esto es 8-500 veces menor que para el almidón soluble ( F a = 1),
solubles malto-oligosacáridos, o derivados de celulosa solubles como CMC ( F a = 1),
y es 5-200 veces menor que el almidón insoluble ( F a = F 0,2; Fujii et al., 1981). La
baja fracción de bonos accesibles se cree que limitar las tasas de interior
escisión del enlace. Cadena disponibilidad final (por ejemplo, por unidad de
masa) es más baja para la celulosa de las de fécula debido a la alta DP de la
celulosa, así como la incidencia de ramificación en almidón. Para la celulosa, la
relación de unidades glucosilo por extremo de la cadena es igual a la DP y oscila
entre 300-2.000 (ver grado de polimerización, más arriba). Para el almidón, que
exhibe ramas cada 17 a 26 unidades de glucosa (Bertoldo y Antranikian, 2002;.
Bueleon et al, 1998), cada rama da lugar a un nuevo extremo de la cadena y la
proporción de unidades de glucosilo a extremos de la cadena está de este modo F
velocidades de hidrólisis 22. celulosa se cree que limitado por la disponibilidad
de cadena extremos para celobiohidrolasa (Schulein, 2000; Valjamae et al,
2001;. Zhang y Wilson, 1997), y la limitación de final de cadena también se ha
propuesto para la acción de glucoamilasa en maltosaccharides (Mazur y
Nakatani, 1993). Considerando celodextrinas son esencialmente insolubles en
DP> 6-10 (Miller, 1963;. Pereira et al, 1988; Zhang y Lynd, 2003).,
Maltooligosacáridos son solubles a DP hasta 60 (John et al,

Para el propósito de la comprensión de los factores que limitan la hidrólisis de la

celulosa por celulasas, es informativo considerar hidrólisis enzimática de almidón.
Como se ha señalado por varios autores (Mandels, 1985; Klyosov, 1988), las tasas
de hydroly- almidón

Zhang y LYND: SISTEMAS celulasa no complejados 811

mil novecientos ochenta y dos). Esta diferencia puede atribuirse a la estructura lineal
plana de celodextrinas en comparación con la estructura ramificada helicoidal del
almidón. Como resultado de estas diferencias en la solubilidad del producto de
hidrólisis, muchos menos divisiones de bonos necesitan ocurrir antes de productos de
hidrólisis solubles son generados a partir de almidón en comparación con la celulosa, y
una fracción correspondientemente mayor de los enlaces puede ser escindido por
enzimas que actúan en el líquido en lugar de fase sólida para el almidón en
comparación con la celulosa. En resumen, la mayoría de los sustratos celulósicos
cristalino exhiben una z 10 veces fracción más pequeña de bonos accesibles, una z 10
veces menor frecuencia de extremos de cadena, y una fracción mucho menor de
enlaces escindidos en la fase soluble durante la hidrólisis enzimática, en comparación
con el almidón.
En contraste con las propiedades marcadamente diferentes de la celulosa y el
almidón como sustratos para la hidrólisis enzimática, los datos disponibles
sugieren que la tasa específica de solubilización exhibida por enzimas
sacarolíticas exo de acción parece bastante similar en sustratos comparables.
Por lo tanto, la actividad específica de CBH2 en cellohexaose en 27 j C (k cat = 14 s 1;
Harjunpää et al., 1996; Koivula et al., 1998, 2002) es bastante comparable a
la de Aspergillus awamori glucoamilasa en maltohexaosa (G 6) a 45 j C (49 s 1; Fierobe
el diseño de sistemas industriales entran en la categoría de los modelos
et al., 1998), en particular cuando se consideran las diferentes temperaturas
de medición. El 3,5-veces mayor valor de k gato observado para la
glucoamilasa en 45 j C con respecto a CBH en 27 j C está muy cerca de lo que
cabría esperar en base a la tendencia ampliamente observada de la actividad
duplicado por cada 10 j aumento de la temperatura C (Godfrey y West, 1996).
A la luz de estas consideraciones, nos parece que la gran diferencia en las
velocidades de hidrólisis relativas de celulosa y el almidón se debe
principalmente a las diferencias en las características del sustrato en lugar de h- enlaces
enlaces glucosídicos que son intrínsecamente más difícil de hidrolizar de una- vinculado
enlaces glucosídicos. Consistente con esta hipótesis, recientemente hemos
encontrado que la velocidad de hidrólisis inicial de PASC es más de 100 veces
mayor que la de Avicel.
Los modelos cuantitativos
Un esquema de clasificación para los modelos cuantitativos de la hidrólisis
enzimática de la celulosa se propone en la Tabla VI.We utiliza el término ''
modelos nonmechanistic '' para los modelos basados ​en la correlación de datos
sin un cálculo explícito de la concentración de celulasa adsorbido. Mientras que
tales modelos pueden ser útiles para la correlación de datos, que son poco
probable que sea fiable en condiciones diferentes de aquellas para las que se
desarrolló la correlación, y tienen una utilidad para el ensayo y desarrollo de la
comprensión limitada. Modelos que ofrecen un modelo de adsorción defendible,
pero que se basan en la concentración como la única variable que describe el
estado del sustrato y / o se basan en una única actividad de hidrólisis de celulosa
se denominan '' semimechanistic ''. En particular, modelos con concentración
como la única variable de estado sustrato se denominan '' semimechanistic con
respecto al sustrato '', mientras que los modelos con una sola actividad
hidrolizante de celulosa se denominan '' semimechanistic con respecto a la
enzima ''. La mayoría de los modelos de hidrólisis propuesto hasta la fecha para
semimechanistic. Semimechanistic modelos pueden ser útiles en el contexto de
ejercicios motivados mediante la inclusión de la información mínima necesaria
para fines descriptivos. Sin embargo, los modelos semimechanistic con respecto
al sustrato no pueden describir o prestar penetración en comportamientos
determinados por las características de sustrato distintos de concentración. Del
mismo modo, los modelos semimechanistic con respecto a la enzima no puede
describir o prestar penetración en comportamientos determinados por múltiples
actividades hidrolizantes.

Tabla VI. Esquema de clasificación de modelos de hidrólisis de la celulosa enzimática.

categoría modelo Característica y base que define Utilidad limitaciones

Nonmechanistic No se basa en un defendible . correlación de datos . La fiabilidad en condiciones diferentes

modelo de adsorción de los utilizados para desarrollar la

correlación
. No mejorar la comprensión

Semimechanistic Basado en un modelo de adsorción defendible . correlación de datos . La comprensión a nivel de características de

a. con respecto al Concentración el único . diseño del reactor sustrato y actividades enzimáticas múltiples
sustrato varible estado sustrato . Identificación de las características esenciales

segundo. con respecto a actividad Un solubilizante

la enzima

basado funcionalmente Incluye un modelo de adsorción, . Pruebas y desarrollo de la . diseño molecular

variables de estado sustrato, además de la comprensión a nivel de . Estado de desarrollo de modelos y disponibilidad

concentración, múltiples actividades características de sustrato y de los datos actualmente limitan la aplicación

solubilizantes actividades enzimáticas múltiples para diseñar

. La identificación de factores limitantes de la velocidad
. diseño de reactor (potencialmente)

basado estructuralmente Basado en información estructural . diseño molecular . Un reto para desarrollar modelos cinéticos

perteneciente a componentes de celulasa . Pruebas y desarrollo de la comprensión de la significativas sobre la base de la información

estructura de relaciones de función / estructural

812 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004

modelo, variables de estado de sustrato, además de la concentración, y de enzimas múltiples
actividades se denotan '' modelos basados ​funcionalmente. '' modelos basados ​Funcionalmente son
particularmente útiles para desarrollar y probar comprensión a nivel de características de sustrato y
actividades enzimáticas múltiples, incluyendo la identificación de la tasa de -Limitar factores y
estrategias para limitar dichos factores. Mientras que los modelos basados ​funcionalmente
posiblemente podrían ser utilizados para el diseño del biorreactor, la aplicación en este contexto
hasta la fecha es bastante limitada. Una limitación adicional de los modelos basados
​funcionalmente es que proporcionan poco a modo de orientación con relación al diseño de las
celulasas en el nivel molecular. Finalmente, los modelos basados ​en características estructurales de
componentes de celulasa y su interacción con sus sustratos se denominan '' modelos basados
y el contenido de lignina mejorar la hidrólisis, con área de superficie específica el
más influyente de las características estructurales, seguido por el contenido de
lignina. Chang y Holtzapple (2000) informan de un modelo para correlacionar la
conversión máxima en relación con la lignina residual, el índice de cristalinidad, y el
contenido de acetilo. Esos autores encontraron que el contenido de lignina y la IRC
tener el mayor impacto en la conversión final, mientras que el contenido de acetil
tuvo un efecto menor. Koullas et al. (1992) también intentado relacionar conversión
máxima con la IRC y el grado de dilignification, y obtenido una conclusión similar
sobre la IRC y efectos de lignina.

​estructuralmente. '' En un grado mucho mayor que los modelos en otras categorías, modelos

basados ​estructuralmente son útiles para el diseño molecular, así como pruebas y desarrollo de la Sattler et al. (1989) desarrollaron la siguiente ecuación para describir la
comprensión de la relación entre estructura y función celulasa. Derivación de modelos cinéticos conversión fraccional final después de la hidrólisis enzimática de pretratada
significativas basadas en modelos estructurales no se puede hacer en este momento, y espera álamo en relación a la carga de celulasa:
grandes avances en el campo general de inferir la función de proteínas de estructura. Observamos

que la gran mayoría de los modelos cinéticos disponibles no tienen en cuenta los cambios en la Y ½ EK þ
¼ Y máx re 15 Þ
velocidad de hidrólisis en el transcurso de la hidrólisis, y los que representan estos cambios do 0 do 0 ½ mi

utilizando parámetros empíricamente armarios en lugar de parámetros basados ​mecánicamente.

modelos basados ​estructuralmente son útiles para el diseño molecular, así como pruebas y donde Y / C 0 da la fracción de sustrato hidrolizado; [E] se da en la FPU / g de
desarrollo de la comprensión de la relación entre estructura y función celulasa. Derivación de sustrato añadido inicialmente (sustrato / g FPU); e y max / do 0 es la fracción de
modelos cinéticos significativas basadas en modelos estructurales no se puede hacer en este sustrato que máximamente podría ser hidrolizado a una carga enzimática
momento, y espera grandes avances en el campo general de inferir la función de proteínas de infinita, es decir, la digestibilidad máxima. Más tarde, Adney et al. (1994)
estructura. Observamos que la gran mayoría de los modelos cinéticos disponibles no tienen en aplicaron este modelo para describir la hidrólisis de celulosa tal como
cuenta los cambios en la velocidad de hidrólisis en el transcurso de la hidrólisis, y los que Sigmacell 50 y varias de madera-polvos pretratados.
representan estos cambios utilizando parámetros empíricamente armarios en lugar de parámetros
Un ejemplo
basados ​mecánicamente. modelos basados ​estructuralmente son útiles para el diseño molecular, así como pruebas de un
y desarrollo modelo
de la con lade
comprensión velocidad
la relaciónde reacción
entre (V) ycomo
estructura una
función salidaDerivación
celulasa. es el de modelos ciné
propuesto por Holtzapple et al. (1984c):

Modelos Nonmechanistic
V ¼ Ð X máx X Þ 2 re dieciséis Þ
t 1 = 2 X máx
modelos Nonmechanistic en la literatura proporcionan correlaciones, ya sea
para la conversión fraccional o la velocidad de reacción como una función de
donde X máx es la conversión máxima, X es la conversión, y t 1/2 está
varios factores. Factores incorporados en modelos con la conversión como la
alcanzando el tiempo 0,5 * X máx. Impulsada por la observación de que
salida incluyen carga enzimática y la concentración de sustrato (Sattler et al.,
disminuye la tasa con el aumento de la conversión, Ooshima et al. (1982)
propusieron la relación:
1989), así como propiedades biomasa pretratada (Chang y Holtzapple,
2000; Gharpuray et al, 1983;.. Koullas et al, dV
re 17 Þ
1992). Factores incorporados en modelos con la tasa como la salida dX ¼? kV
incluyen el tiempo de hidrólisis; (. Ooshima et al, 1982) (Karrer et al, 1925.
Miyamoto y Nisozawa, 1945), la enzima de cargar (Miyamoto y Nisozawa, en la que V es la velocidad de hidrólisis y X es la conversión.
1945), y la conversión de celulosa. Unos modelos nonmechanistic se
consideran aquí a modo de ejemplo. Nonmechanistic modelos desarrollados
antes de la década de 1980 se consideran en detalle en los comentarios de Modelos Semimechanistic
Lee et al. (1980) y Ladisch et al. (1981).
Siguiendo el esquema de clasificación presentado en la Tabla VI, los modelos
semimechanistic con respecto al sustrato y la enzima se basan en un modelo de
Un ejemplo de un modelo con grado de conversión como una salida es la
adsorción pero el uso de una única variable para describir el estado del substrato
propuesta por Gharpuray et al. (1983). Esos autores utilizaron regresión para
y describir la acción de la celulasa en términos de una sola actividad
desarrollar un modelo exponencial para describir la influencia de las
solubilizante.
características de la paja de trigo pretratada en la conversión de celulosa (X = 1
Un modelo representativo de esta categoría es el modelo HCH-1
- [concentración de celulosa definitiva] / [concentración inicial de celulosa]),
desarrollado por Holtzapple et al. (1984a, b), que describe la velocidad
medido después de 8 h:
inicial de la hidrólisis por:

k½S½Ei
X ¼ 2: 044 re SSA Þ 0: 998 re 100 ICr Þ 0: 257 re L Þ 0: 388 re 14 Þ
V¼ re 18 Þ
re una þ ½ S þ q ½ mi Þ

en el que la SSA es el área de superficie medida por BET, y L es el contenido de

lignina residual. Sus resultados indican que un aumento en el área superficial y en la que k es una constante de velocidad; una, una constante de afinidad agrupado; q,

una disminución de la cristalinidad el número de sitios de celulosa cubierta por una adsorbido

Zhang y LYND: SISTEMAS celulasa no complejados 813

molécula de enzima, y ​i la fracción de enzima total, que no es inhibida por
el producto. La cantidad yo representa la inhibición por glucosa (G) y
celobiosa (G 2) de acuerdo a:
yo ¼ 1 = re 1 þ ½ G = K yo 1 þ ½ sol 2 = K yo 2 Þ re 19 Þ
en la que K I1 y K I2 son constantes de inhibición. Este modelo fue utilizado para
simular un total de 50 condiciones de hidrólisis diferentes con un intervalo de 10
veces en la concentración de enzima y un rango de 30 veces en la concentración
de celulosa. De acuerdo con los datos experimentales era bastante bueno, y
parecía mejor que algunos modelos más antiguos (Howell y Atrapado, 1975;
Huang, 1975).
modelos Semimechanistic con respecto a la enzima sólo implican las
variables además de la concentración para describir el estado del sustrato. La
tendencia ampliamente observada de la tasa decreciente a medida que
aumenta la conversión parece ser una motivación central para muchos modelos
en esta categoría. Modelos que describen un cambio asumido en forma y área
de superficie en el transcurso de la hidrólisis se han propuesto (Converse y
Grethlein, 1987;. Converse et al, 1988;. Luo et al, 1997;. Movagarnjad et al,
2000; Oh et al. , 2001;. Philippidis et al,
1992, 1993). Sin embargo, ninguno de estos modelos han sido probados
con datos experimentales (por ejemplo, para el área de superficie) a
nuestro conocimiento. Varios '' de dos sustrato '' modelos se han propuesto
que la celulosa partición en una fracción altamente cristalina menos
reactivo, y una fracción amorfa más reactivo (Fan y Lee, 1983;. González
et al, 1989;. Gusakov et al, 1985a, b; Nidetzky y Steiner, 1993; Peitersen y
Ross, 1979; Ryu y Lee, 1982;. Scheiding et al, 1984). Aunque estos
modelos han tenido cierto éxito en términos de datos que correlacionan, la
tendencia al aumento ICr al aumentar la conversión de la que cabría
esperar si celulosa amorfa, de hecho, reacciona primero, no han sido
confirmados por los datos experimentales de manera concluyente. Un
ejemplo de un modelo twosubstrate es el de Wald et al. (1984),
h- glucosidasa con la inhibición por glucosa. Sur et al. (1995) utilizaron una constante de
velocidad de conversión dependiente para tener en cuenta la disminución de la actividad
específica de los complejos de celulasa de celulosa en el transcurso de la hidrólisis:
k re X Þ ¼ k FD 1 X Þ norte þ do sol re 20 Þ
Estos autores encontraron un valor determinado empíricamente de n igual a 5,3,
indicativo de la muy fuerte disminución de la tasa con el aumento de la conversión
y en general de acuerdo con las mediciones de actividad específica directos (Nutor
y Converse, 1991; Ooshima et al., 1991).
modelos Semimechanistic con respecto al sustrato (solamente), implica la
concentración como la única variable de estado de sustrato y dos o más
actividades de solubilización. Ejemplos de modelos de esta categoría en la
literatura hasta la fecha se basan en endoglucanasa y exoglucanasa. Nidetzky
et al. (1994b) describió la saturación de la velocidad de hidrólisis en términos de
814 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004
la concentración de un componente de celulasa en particular, mi yo,
como sigue:
mi yo
V re mi yo Þ ¼ V máx re 21 Þ
K Ei þ mi yo
en el que i es 1 (por exoglucanasa) o 2 (por endoglucanasa), y K Ei es una
constante media-saturación. Con base en esta relación, se propuso la
siguiente ecuación para la velocidad de hidrólisis en presencia de tanto
exoglucanasa y endoglucanasa:
V re mi 1; mi 2 Þ ¼ V re mi 1 th th V re mi 2 Þ
mi 1 mi 2
þ V syn; max
K 1 K 2 þ K 1 mi 2 þ K 2 mi 2 þ mi 1 mi 2
re 22 Þ
en la que V syn, máx es la tasa hidrolítica sinérgico máximo, y K 1, K 2 eran las
constantes de medio-de saturación correspondiente a la enzima 1 y 2 en
combinación binaria. Los resultados y modelo experimental predicción mostró
claramente que la relación óptima de exoglucanasa a endoglucanasa es una
función de la concentración total de celulasa, con concentraciones de enzima
mayores que necesitan menos endoglucanasa para lograr el máximo efecto
sinérgico. El modelo de Beltrame et al. (1984) representa el exoglucanasa,
endoglucanasa, y h- glucosidasa sobre el algodón textil y de la pasta de
celulosa a varias temperaturas. Los valores de las variables pueden ajustarse
dependiendo de las condiciones experimentales para encajar bien los datos
experimentales.
La mitad de los modelos semimechanistic listados en la Tabla VII se basan en
el modelo de Michaelis-Menten. El modelo MichaelisMenten sólo es válido para el
caso límite de sustrato estar en exceso con respecto a la enzima (Lynd et al.,
2002). A la luz de la pequeña fracción de h- enlaces glucosídicos accesibles al
ataque enzimático, esta condición es particularmente limitantes para sustratos
celulósicos. El exceso de sustrato se puede conseguir de trabajo orientado
fundamentalmente, por ejemplo, para caracterizar la actividad específica en
condiciones de laboratorio, pero rara vez se logra en aplicaciones que implican la
hidrólisis de celulosa. Los modelos basados ​en un modelo de adsorción de
Langmuir no suponen implícitamente exceso en cualquiera de enzima o sustrato,
y por lo tanto tienen una gama considerablemente más amplia de aplicación
potencial. El modelo de Langmuir es objeto de críticas por razones mecanicistas
como se indica en celulasa de adsorción (arriba). Aunque se han propuesto
modelos de adsorción otros que el modelo de Langmuir, pocos han sido
incorporados en modelos cinéticos que conducen a una predicción de velocidad
de hidrólisis.
La inhibición de la velocidad de hidrólisis por productos solubles ha sido
incorporado en un número sustancial de modelos. La inhibición competitiva
es el mecanismo más común en la literatura, pero también se han
propuesto otros mecanismos no competitivos y no competitivos (Tabla VII).
Tanto la información estructural (Davies et al, 1997;.. Teeri et al, 1998a, b)
y un cuerpo considerable de datos experimentales indican que las enzimas
de celulasa individuales son inhibidas
Tabla VII. Los modelos matemáticos de hidrólisis de la celulosa enzimática.

Variables dependientes

> Variable de 1 sustrato

A. modelos Nonmechanistic Variable independiente Hora Enzima sustrato

Miyamoto y Nisozawa de 1942 Conversión Variable Variable Fijo No

Holtzapple et al., 1984c- modelo 1 Conversión Variable Fijo Fijo No
Gharphuray et al., 1983 Conversión (8 hrs) Fijo Fijo Fijo Sí
Sattler et al., 1989 Conversión (max) Fijo Fijo Variable No
Adney et al., 1994 Conversión (max) Fijo Fijo Variable No
Koullas et al., 1992 Conversión (max) Fijo Fijo Fijo Sí
Chang y Holtzapple, 2000 Conversión (max) Fijo Fijo Fijo Sí
Karrer et al., 1925 velocidad de hidrólisis Variable Fijo Fijo No
Ooshima et al., 1982 velocidad de hidrólisis Fijo Fijo Fijo No
Holtzapple et al., 1984c- modelo 2 velocidad de hidrólisis Fijo Fijo Fijo No

interacción ES

B. Modelos Semimechanistic Características del sustrato * características de la enzima Adsorción / MM Inhibición

yo. modelos Semimechanistic con respecto al sustrato y la enzima (variable de estado 1 de sustrato, 1 actividad solubilizante) Huang, 1975
MM competitivo
Howell y Mangat, 1978 Langmuir competitivo
Beltrame et al., 1982 Langmuir
Holtzapple et al., 1984a y b, 1990 Langmuir no competitivo
Nagasaki et al., 1988 MM
Steiner et al., 1988 Langmuir
Howell y Stuck, 1975 además BG MM
Dwivedi y Ghose, 1979 además BG MM competitivo
Ghosh et al., 1982 además BG MM competitivo
Asenjo, 1984 además BG MM competitivo
Caminal et al., 1985 además BG MM competitivo
Borchert y Buchholz, 1987 además BG Langmuir competitivo
Guaskov y Sinitsyn, 1992 además BG MM no competitivo
Moldes et al., 1999 además BG MM competitivo
Belkacemi y Hamoudi, 2003 además BG MM
ii. modelos Semimechanistic con respecto a la enzima sólo (> variables de 2 de sustrato de estado, 1 de actividad solubilizante) Converse y Grethlein,
1987 AS + [S] MM
Converse et al., 1988 AS + [S] Langmuir competitivo
Movagarnejad et al., 2000 AS + [S] Langmuir
Sur et al., 1995 [S] + X Langmuir
Ryu y Lee, 1982 A+C Langmuir
Philippidis et al., 1992 y 1993 AS + [S] además BG Langmuir no competitivo
Luo et al., 1997 AS + [S] además BG Langmuir no competitivo
Oh et al., 2001 AS + [S] además BG Langmuir no competitivo
Peitersen y Ross, 1979 A+C además BG MM
Ventilador y Lee, 1983 A+C además BG Langmuir no competitivo
Scheiding et al., 1984 A+C además BG Langmuir no competitivo
Guaskov et al., 1985a y b A+C además BG Langmuir competitivo
González et al., 1989 A+C además BG MM competitivo
Nidetzky et al., 1993 A+C además BG Langmuir
Wald et al., 1984 AS + (A + C) además BG Langmuir competitivo
Gan et al., 2003 AS + (A + C) además BG Langmuir competitivo
iii. modelos mecanicistas Semi con respecto al sustrato (actividades de variable de estado 1 de sustrato y 2 solubilizantes) sólo Beltrame et al., 1984
solamente [S] Endo + Exo + BG MM no competitivo
Nidetzky et al., 1994b solamente [S] Endo + Exo Langmuir

modelos basados ​C. funcionalmente (es z 2 variables de estado sustrato, z 2 actividades solubilizantes)

Suga et al., 1975 [S], DP Endo + Exo MM

Okazaki y Moo-Young, 1978 [S], DP Endo + Exo MM no competitivo
Converse y Optekar, 1993 [S], AS Endo + Exo adsorción dinámica
Fenske et al., 1999 [S], AS, DP Endo + Exo Langmuir

* AS = área de la superficie; [S], la concentración de sustrato; X = conversión de celulosa; A, celulosa amorfa; C, celulosa cristalina.

Zhang y LYND: SISTEMAS celulasa no complejados 815

competitivamente por celobiosa y glucosa. Sin embargo, parece que las componentes con actividades complementarias se unen a una distancia unos de
mezclas de componentes de celulasa pueden exhibir un comportamiento otros.
coherente con mecanismos distintos de la inhibición competitiva en
algunas condiciones (Gusakov et al, 1985a, c;. Gusakov y Sinitsyn, 1992;.
CONCLUSIÓN PERSPECTIVAS Y RETOS
Holtzapple et al, 1984b, 1990). La base mecánica de este fenómeno no se
conoce bien y ha recibido poco o ningún examen a la luz de la información Hay mucho acerca de hidrólisis enzimática que no se entiende todavía
estructural obtenida durante la década de 1990. completamente. cuestiones pendientes importantes son las que se presentan en
la Tabla VIII. Consistente con la noción de que los avances en la comprensión
fundamental y la capacidad aplicados son potencialmente convergentes en lugar
de actividades divergentes (Stokes, 1998), preguntas de la Tabla VIII se clasifican
en términos de preguntas definidas fundamentalmente con implicaciones
Modelos basados ​funcionalmente aplicadas y preguntas definidas por la aplicación con implicaciones
fundamentales.
Unos modelos basados ​funcionalmente, implicando las variables de
sustrato y actividades de solubilización múltiple, se han propuesto en la
Todas estas preguntas requieren comprensión de la acción de los sistemas
literatura. Moo-Young y colaboradores (Okazaki y Moo-Young, 1978;. Suga
enzimáticos de celulasa y sus sustratos-que se agrega, la comprensión de la
et al, 1975) desarrollaron modelos basados ​en el modelo de
participación de múltiples actividades de celulosa hidrolizante y características de
Michaelis-Menten y suponiendo que todo h- enlaces glucosídicos son
sustrato además de la concentración. modelos cuantitativos representa una
accesibles que incorporaba dos actividades solubilizantes (endoglucanasa
poderosa herramienta para avanzar en la comprensión y comprobar hipótesis que
y exoglucanasa), así como h- glucosidasa. Además, estos investigadores
involucran la comprensión agregada a nivel implícito en la Tabla VIII. De hecho, tal
utilizaron concentración y DP como variables de sustrato. El modelo
avance y las pruebas pueden llevarse a cabo sólo de manera muy limitada y sin
predice (Suga et al., 1975) que el sustrato DP cambia como una función
modelos cuantitativos. Como se representa en la Figura 4, el progreso en este
del tiempo en presencia de endoglucanasa, y que exoglucanasa y
dominio se puede buscar a través de dos niveles de consulta: modelado
endoglucanasa sinergismo se produce por la degradación de las moléculas
estructural y modelado funcional.
de celulosa de cadena más larga. Más tarde, el modelo de Okazaki y
MooYoung (1978) predijo que el grado de sinergia endo-exo está
fuertemente afectada por DP. Converse y Optekar (1993) consideraron la
Aunque ha habido una explosión en la documentación de las características
adsorción competitiva de exoglucanasa y endoglucanasa para un número
estructurales de los componentes de la enzima celulasa, como se indica en la
limitado de sitios, y predijo un DS inferior bajo oversaturating condiciones-
introducción, la actividad en el área de modelado estructural de los sistemas
es decir, cuando la celulasa está en considerable exceso con respecto al
enzimáticos de celulasas ha sido muy limitada hasta la fecha. El progreso en tales
sustrato. Fenske et al. (1999) modelan y se observó una disminución en la
modelado estructural está limitada por la velocidad de avance en el campo general
velocidad de hidrólisis con el aumento de concentración de celulosa
de la predicción de la función de proteínas de estructura. No parece ser
(Huang y Penner, 1991;

2001) en términos de sinergismo disminuido cuando com- celulasa

Tabla VIII. cuestiones pendientes importantes en el ámbito de la enzimática

hidrólisis de biomasa celulósica.

A. Fundamentalmente define preguntas con implicaciones aplicadas

1) ¿Cuál es el papel de las propiedades del sustrato en la determinación de la eficacia de
componentes de celulasa?
2) ¿Cuál es el papel de las interacciones entre los componentes de enzimas en la determinación

de la eficacia de la hidrólisis de la celulosa?

3) ¿Cuál es la base mecánica de las diferencias en la acción de los sistemas de

celulasa de diferentes arquitecturas (por ejemplo, no complejado, complejado)? y cómo
estas diferencias responden al sustrato propiedades?

preguntas con implicaciones fundamentales definidos por la aplicación B.

1) ¿Qué características sustrato son de particular importancia para cambiar a fin de tratar

previamente con eficacia la biomasa celulósica? ¿Cómo deben evaluarse estas características?

2) ¿Qué principios y estrategias de guiar la combinación de componentes de celulasa,

posiblemente de diferentes organismos, para lograr la hidrólisis eficaz?

3) ¿Qué principios y estrategias de orientar el diseño de enzimas celulasas

mejoradas para lograr más eficazmente la hidrólisis?
Figura 4. Los niveles de consulta relativos a la hidrólisis de celulosa enzimática.

816 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 88, NO. 7 30 de diciembre de 2004

barreras fundamentales similares a desarrollo de modelos funcionales. Además, los
modelos funcionales, informado como sea posible por información sobre las
características estructurales de las enzimas de celulasa, aparecerían en este
momento para ser la ruta más productiva por el cual para desarrollar y probar
comprensión agregada de la hidrólisis enzimática de la celulosa. Sin embargo, la
actividad hasta la fecha en el área de modelado funcional también ha sido muy
limitada. Nos resulta sorprendente, por ejemplo, que de los cuatro modelos de
funciones enumeradas en la Tabla VII, sólo uno se informó en los últimos 5 años y
sólo dos en los últimos 10 años.
Sugerimos que ha llegado el momento de revisar y revitalizar el modelado
funcional de la hidrólisis enzimática de la celulosa. Además de centrar la atención
de los investigadores y los patrocinadores de la investigación en este objetivo, los
avances en el área de modelado funcional se beneficiarán del desarrollo y
aplicación de nuevas metodologías. Entre tales metodologías son procedimientos
mejorados para la determinación de las propiedades del sustrato incluyendo DP,
cristalinidad (sin artefactos potenciales debido al secado), y la accesibilidad
celulasa. Los modelos basados ​en la aplicación de estas y otras metodologías
para relacionar los cambios en las propiedades del sustrato a velocidades de
hidrólisis primaria y secundaria (ver en el mecanismo de la celulosa. . ., Supra)
mediada por diversas celulasas y sistemas de celulasa en el transcurso de la
reacción parece ser una dirección prometedora para la investigación futura.
Agradecemos a los Dres. Charles Wyman y Bernard Henrissat valiosa para los debates.
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