APLICACIÓN DE LA ESCALA DE McFARLAND y

RECUENTO DE LEVADURAS EN CÁMARA DE NEUBAUER

Fecha de entrega
08/03/2019

Paola Andrea Mina Amu1 Daniel Felipe Ordoñez2

Laboratorio de microbiología industrial, programa de Microbiología, Facultad de

Ciencias Básicas, Universidad Santiago de Cali

Email: pao.minaaa@hotmail.com
Palabras clave: suspensión, dilución, densidad óptica y turbidez,recuento, microscopio

RESUMEN
En la presente practica se hace uso de la escala de McFarland para la
determinación de la densidad de una muestra de Escherichia coli, a partir de la
formación de un precipitado de sulfato de bario en distintas concentraciones,
pero factores aleatorios que ocurrieron. Utilizando los estándares de 0,5 y 1, se
preparó diluciones, se siembra en superficie para luego incubarlo por 48 horas
para realizar su conteo en placa de microorganismo.
Por medio de la cámara neubauer se realizó un conteo de la levadura
sacaromyces cerevice usando dicha técnica anteriormente mencionada. Se
realizó un recuento de células de levadura sacaromyces cerevicea usando la
técnica más más común cámara de neubauer, con el objetivo de desarrollar la
capacidad de enfocar la cámara con el uso del microscopio, dejándolo en el
ocular 4x enfocado en la zona central que contiene 25 cuadrados pequeños, se
inoculo de la levadura y se procedió seguir las instrucciones del profesor. Se
realizaron dos diluciones a partir del inoculo, se realizó el mismo procedimiento
con una muestra ya inoculada pero que contenía suficiente biomasa, lo cual la
hacía ver muy turbia. Se hizo el recuento de las dos muestras siguiendo
instrucciones y se obtuvo como resultado una viabilidad del 100% en los dos
casos y el recuento de células por mililitro (cel/ml). Se conocieron todas las
partes de la cámara de neubauer, es un método con un bajo índice de error.
OBJETIVOS
Generales:
* Comprender los fundamentos que
rigen los diversos métodos
instrumentales de recuento
microbiano.
* Establecer la cantidad de
microorganismos de una muestra
mediante el método turbidimétrico o
Escala mcfarland.
* Conocer e interpretar la técnica de
conteo de células por medio de la
cámara Neubauer.
Específicos:
* Establecer una relación entre una
precipitación química (H2SO4y una
suspensión bacteriana.
* Aprender a enfocar la cámara de
Neubauer con el uso de un
microscopio óptico.
* Determinar la densidad y viabilidad
celular de un cultivo de levaduras.
entendido como un aumento en el
número total de partículas
bacterianas. Existen varias formas
de determinar el número total de
microorganismos en una muestra:
Determinación del número de
microorganismos, Determinación de
la masa celular, y Determinación de
la actividad celular.
Independientemente de los métodos
empleados para el conteo
bacteriano estos se pueden agrupar
en dos modalidades claramente
definidas, así pues tendríamos los
métodos de recuento directo o
cuantitativos (como su nombre lo
indica nos permite contar
directamente el número de células)
y aquellos indirectos o cualitativos,
que a través de la determinación de
diversos factores nos permite
correlacionar la medida de los
mismos con un número de
bacterias. En la práctica habitual del
Laboratorio, los ensayos se realizan
con poblaciones bacterianas y
poblaciones de hongos, a menudo
tomando muestras en diversos
momentos de su crecimiento en un
medio de cultivo.

Comenzaremos con describir

algunos métodos habituales de
INTRODUCCION medir ese crecimiento poblaciona
El crecimiento de una población
bacteriana puede ser entendido
desde perspectivas diferentes y de MATERIALES Y METODO
acuerdo a éstas se puede llegar a ESCALA DE McFARLAND
determinar la medida del
crecimiento mediante diversas Preparación de estándares y
metodologías. Para algunos, el control de calidad de la escala
crecimiento es la capacidad que
tienen las células individuales para Esta práctica se inició preparando
multiplicarse, esto es iniciar y 10ml de una solución de BaCl2 al
completar una división celular. De 1% o 0,048M Y 100ml de una
esta forma, se considera a los solución de H2SO4 al 1% o 0,36N.
microorganismos como partículas Luego para preparar los estándares
discretas y el crecimiento es de la escala Mcfarland se dispuso
de 11 tubos tapa rosca, a los cuales
se les añadió distintos volúmenes Método de conteo en placa para
de estos dos reactivos BaCl2 al 1%y probar la turbidez estándar de 0,5
H2SO4 al 1%. en la escala de McFarland
Después de terminadas las Utilizando como referente el patrón
respectivas diluciones de la escala de 0,5 de la escala de McFarland,
de McFarland se debió proceder a se preparó una suspensión
determinar la absorbancia, bacteriana de (E.coli K12) utilizando
previamente homogenizando cada un asa previamente esterilizada con
uno ayuda del mechero, se tomó una
de los tubos para garantizar la asada del microorganismo en
uniformidad de la muestra. cuestión y se lo disolvió

Luego se tomó 1ml para determinar Se debe comparar visualmente la

la absorbancia, utilizando un turbidez de la suspensión
espectrofotómetro donde se usó la bacteriana con el patrón de 0,5 de la
medida de la longitud de onda en escala de McFarland y
625 nm, en la cual se debe posteriormente llevar al
comenzar midiendo la absorbancia espectrofotómetro para comprobar
del patrón 0,5 de la escala, que si la absorbancia de la suspensión
debe estar dentro del rango de 0,08 es igual o cercana a la del patrón de
a 0.10, y seguir sucesivamente en 0,5. Si la absorbancia de la
este orden de menor a mayor suspensión es menor o más alta, se
concentración, dando como
debe agregar más diluyente (agua
resultado una absorbancia cada vez estéril) o más biomasa
mayor con referencia a las respectivamente.
anteriores mediciones.
TABLA 1. Preparación de estándares de la
escala de McFarland
Posteriormente se utilizó la
suspensión bacteriana que debe
Escala BaC H2S UFC/m contener un aproximado de 1x108
McFarland
l2 al O1% (x108)
4 al l1% UFC/mL Para realizar 5 diluciones
(ml) (ml) seriadas en tubos de ensayo que
0,5 0,05 9,95 1,5 contienen 4,5 ml de agua estéril.
1 0,1 9,9 3 Para esto se tomó 0,5 ml de la
2 0.2 9,8 6 suspensión bacteriana o (dilución
3 0,3 9,7 9 madre) y se pasó al tubo de ensayo
4 0,4 9,6 12 # 5, se realizó el mismo
5 0,5 9,5 15 procedimiento con los demás tubos
6 0,6 9,4 18 de ensayo # 4,#3,#2 y #1 sin olvidar
homogenizar cada dilución antes de
7 0,7 9,3 21
realizar el paso del volumen.
8 0,8 9,2 24
9 0,9 9,1 27 Después de obtener las 5 diluciones
de la suspensión microbiana, se
procedió con la siembra en
superficie donde se inoculo 100 μl
de las diluciones 10-4 y 10-5 las
cuales se realizaron por duplicado,
para llevar esto acabo se dispuso
de 4 cajas de petri con agar Plate
Count, posteriormente con la ayuda
de un asa de vidrio se dispersó de
manera uniforme la cantidad sobre
toda la superficie del medio y
finalmente se llevó a incubar a 37°C
Pasado el periodo de incubación se
realizó la lectura y recuento de las
UFC.
FIGURA 1: ESQUEMA DILUCION SERIADA
levadura y se diluyo en un epperdof
10-1 y 10-2, se colocó 20µLde azul
de metileno en cada tubo y se
procedió a observar y a realizar el
conteo respectivo de las células,
para esto se contaron las 4
esquinas y el cuadrado del centro,
seguidamente se realizaron los
cálculos respectivos para saber
cuántas células por mililitro se
tienen en la suspensión madre.
Después se observó una
muestra suministrada por el
docente que también contenía
saccharomyces cerevisiae
pero esta se notó UN poco
más turbia y se realizó el
mismo procedimiento para
realizar el conteo

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
MATERIALES y MÉTODO ESCALA DE McFARLAND
CÁMARA DE NEUBAUER
En esta práctica de laboratorio se
utilizó una cámara de Neubauer en
el microscopio, se extrajo una Imagen 1 Resultado de la preparion de la
escala Mc Farland
colonia de una caja Petri que
contenía Saccharomyces cerevisiae
y se diluyó en 10mL de agua estéril,
se sometió a agitación hasta que la
solución se tornó turbia. Por otra
parte se tomaron 4 tubos eppendorf
y se adiciono 900 µL de agua estéril
encada uno. Seguidamente se
dispuso a colocar la cámara de
Neubauer en el microscopio donde
se observó la cuadricula que esta
trae, se observó primero en el
objetivo 4x, luego se pasó a 10x y
seguidamente a 40X donde se
observa el cuadrante de 25. Se
tomó 100µL de la suspensión de la
 Martinko. Bender. Buckley. Stahl ,
2015), es necesaria realizar la
escala a partir de sulfato de bario y
acido sulfúrico para la producción
TABLA 2. Absorbancia de escala de
de sulfato de bario como se puede
McFarland
observar en la Tabla 1 Y Figura 2 ya
Patrón de Absorbancia que son denominados estándares
Mcfarland para poder comparar con la dilución
0,5 0.132 que tiene cepa de E.coli , la
1 0.150 absorbancia obtenida a partir de la
2 0.310 escala de McFarland realizada por
3 0.463 la profesora tiene una R= 0,984
demostrando los datos obtenidos en
4 0.557
la obsorbancia son confiables para
5 0.662
tenerlos como patrón
6 0.840
TABLA 3 ABSORBANCIA PATRON Y
7 0.996 ABSORBANCIA CON MICROORGANISMO
8 1.014
Absorbancia Absorbancia
9 1.121
estándar 0,5 con cepas de
10 1.169 e.coli
0,072 0,078

FIGURA2. GRAFICA LINEAL DE

ABRSORBANCIA EN LA ESCALA DE
McFARLAND TABLA 4. RECUENTO EN PLACAS

Dilución 10-3 10-3 10-4 10-4

Absorbancia registrada de la UFC >300 >300 >300 >300
escala McFarland
2
Los métodos de densidad óptica no
Absorbancia

1.5
1 medida de la masa microbiana total,
0.5
0 y = 0.1165x + 0.0862
R² = 0.9844
0 5 10 15
Escala McFarland
Por medio de la turbidez obtenida
en la escala de McFarland es
posible la estimación de la masa
celular debido a que las células
dispersan la luz la cual entre más
células existentes en el medio su
turbidez es mayor (Madigan.
son muy precisos al momento de la
debido a que muchas de las
bacterias forman biopelículas o
grumos y si no son agitadas
debidamente puede ocurrir una
lectura errónea como pudo ocurrir
en la
Tabla 3.
En la suspensión presente en la
caja Petri con Agar Plate Count de
dilución 10-3 aproximadamente
deberían haber 100000-900000 y en
10-4 aproximadamente 1000-9000
pero los datos obtenidos fueron
acertados ya que se logró tener un
conteo muy elevado, la dilución 10-4
dio un numero incontable, incluso
dividiendo la caja de Petri en 4
secores. La dilución 10-3 dio
incontable también ya que al dividir
la caja de Petri en cuatro
cuadrantes y al contar uno de ellos
dio un total mayor a >300 UFC que
se considera como incontable.
Imagen1. Dilución 10-3
Imagen4. Dilución 10-4 duplicado

Como se muestran en las imágenes

Imagen2. Dilución 10-3 duplicado
Imagen3. Dilución 10-4
al marcar con un rotulo en medio de
las cajas y al retirarlo, dejaba
muestras de pegamento, lo que
hacía muy difícil observar y por lo
tanto contar las colonias, pero
claramente se ve en las diluciones
10-3 (imagen 1 y 2) que el numero
de colonias a simple vista es
incontable. En las imágenes 3 y 4
se puede observar un numero de
colonas que pueden contarse, pero,
dividiendo la caja en 4 cuadrantes.
En la imagen 3 se obtuvo un
numero de colonias por cuadrante
de 147 UFC que al multiplicarlo por
4 nos da 588, siendo este >300
considerándose como incontable,
en la imagen 4 (dilución por
duplicado) se contó un numero de
colonias por cuadrante de 118 UFC
que al multiplicarlo por 4 nos da un
aproximado de 472 UFC siendo
este >300 UFC considerandose
igual como incontable.
Dado a las investigaciones de las
escalas McFarland en las diluciones
10-3 se deberían presentar un total
de colonias entre 1000 y 9000. Un
factor que pudo afectar esto, sería
la temperatura a la cual estaban
sometidas las bacterias o el largo
tiempo que transcurrió para hacer el
conteo (alrededor de 4 días) dando
un crecimiento mucho mayor.
CÁMARA DE NEUBAUER
Para el conteo realizado
inicialmente de la dilución de 10-1
con la muestra nueva de
Saccharomyces cerevisiae que se
colocó en la cámara de Neubauer
se realizó el conteo de 5 cuadros
con 15 cuadros internos, obteniendo
un total de 27 células.
1. Cuadrante A 2+1+0+1=9
2. Cuadrante B 0+2+1+1=4
3. Cuadrante C 1+0+1+1=12
4. Cuadrante D 1+1+2+1=0
5. Cuadrante E 1+1+0+1=2
Determinando con la siguiente
formula la cantidad de células total
en la muestra 101:
Células/ml
total de celulas contadas x 5
𝑥100
0,0001Ml
27 cel∗ 5
Células/ml = 0,0001ml 𝑥100
Células/ml = 135x106 cel/ml
DETERMINACIÓN DE LA
VIABILIDAD CELULAR
Viabilidad % = (células totales-
células muertas)/ células totales x
100
135−0
Viabilidad % = 𝑥 100
135
Viabilidad % = 100%
Con un 100% de viabilidad ya que
no se encontraron células muertas.
De acuerdo al valor obtenido en los
cálculos se puede deducir que estos
resultados van acorde a lo esperado
pues la placa de la cual se extrajo la
muestra realizando el conteo, se
encontraba en óptimas condiciones.
Para la dilución 10-1 Para el conteo
realizado inicialmente de la dilución
de 10-1 con la muestra vieja de
Saccharomyces cerevisiae.
Células/ml
total de celulas contadas x 5
𝑥100
0,0001Ml
1. Cuadrante A 2+1+0+1=2
2. Cuadrante B 0+2+1+1=2
3. Cuadrante C 1+0+1+1=4
4. Cuadrante D 1+1+2+1=3
5. Cuadrante E 1+1+0+1=4
15cel∗ 5
Células/ml = 0,0001ml 𝑥100
Células/ml = 75x106 cel/ml
DETERMINACIÓN DE LA Determinación de la viabilidad
VIABILIDAD CELULAR celular
Viabilidad % = (células totales- Viabilidad % = (células totales-
células muertas)/ células totales x células muertas)/ células totales x
100 100
75−0 75−2
Viabilidad % = 𝑥 100 Viabilidad % = 𝑥 100
75 75

Viabilidad % = 100% Viabilidad % = 97.3%

Para la dilución 10-2 no se realizó
conteo
Cuál es el volumen necesario para
que la concentración inicial sea
1x106 células por mil
C1 * V1 = C2* V2
V1= 1x106 Cel/mL * 1mL / 75x106
Cel/mL
V1= 0,013mL
Para el conteo de la muestra
problema, se obtuvieron los
siguientes resultados:
Células/ml
total de celulas contadas x 5
𝑥100
0,0001Ml
1. Cuadrante A 2+1+0+1=4
2. Cuadrante B 0+2+1+1=2
3. Cuadrante C 1+0+1+1=4
4. Cuadrante D 1+1+2+1=3
5. Cuadrante E 1+1+0+1=4
Total células vivas: 15
Total células muertas: 2
15cel∗ 5
Células/ml = 0,0001ml 𝑥100
Células/ml = 75x106 cel/ml
En la muestra problema no
obtuvimos un 100% de viabilidad
por varios factores tales
como,muestra no reciente, factores
externos como el ambiente, el
estrés nutritivo al cual se enfrentaba
el microorganismo facilitó para que
hubiera muerte celular.
Con la cámara de neubauer se
utiliza un cubreobjetos, no debe
quedar levantado, ni con burbujas
ya que se puede confundir con las
células, en algunas referencias
bibliográficas dice que el rango de
concentraciones que permite contar
la cámara de neubauer está entre
250.000 células y 2,5 millones de
células por ml.
El conteo realizado es
correspondiente a la cuadricula que
consta de 25 cuadros, el número de
células contadas es la suma de
todas la células en 5 cuadros, 4
esquinas y el centro, normalmente
se realiza de esa manera pues es
un método rápido, utilizando
diferentes fórmulas. Se presentaron
errores debido a la cantidad de
inoculo obtenido de la caja donde
fue sembrado, la dilución se hizo
correctamente, uso adecuado de la
micropipeta, error en la adición de
azul de metileno lo que me llevo a
realizar de nuevo la dilución.
Dicho anteriormente, la cámara de
neubauer sigue siendo uno de los
métodos más utilizados en la
industria, sobre todo en recuento de
levaduras, con este se lleva el
control de calidad requerido a nivel
de producción y es así como se
toma un dato especifico de la
cantidad de producto, la cantidad de
levadura producida y la cantidad
requerida para continuar el proceso.
También se obtuvo una viabilidad
del 100% en las muestras nueva y
vieja, en la muestra problema se
obtuvo un 97.3% de viabilidad.
En la muestra problema no
obtuvimos un 100% de viabilidad
por varios factores tales como:
muestra no reciente, factores
externos como el ambiente, el
estrés nutritivo al cual se enfrentaba
el microorganismo facilito para que
hubiera muerte celular.
CONCLUSIÓN
 La mala manipulación de una
cepa altera las diluciones de
éesta aun así el método de la
escala de McFarland
determinóo la densidad
óptica de la suspensión
microbiana
 La utilidad de la escala es
poder realizar suspensiones
bacterianas ajustadas a un
patrón.
 La finalidad, es establecer
una relación entre una
precipitación química y una
REFERENCIAS
suspensión bacteriana.
 La escala se basa en la
capacidad de precipitación
del cloruro de bario en
presencia de ácido sulfúrico
 Se conoció y se familiarizo
con el fundamento y uso de
los estándares de la escala
de Mc-Farland como
referencia para determinar la
concentración de una
suspensión microbiológica.
 Cada microorganismo tiene
una cinética de crecimiento y
de reproducción por lo que se
obtienen resultados distintos
en el conteo.
 Se aprendió el manejo de la
cámara de Neubauer y la
manera correcta de contar
células utilizando este
instrumento. Se notan errores
de hasta 20% y 30%, son
comunes con este método de
recuento debido al pipeteo, a
los errores estadísticos,
errores del volumen de
muestra realmente
introducido en la cámara, etc.
Es un método utilizado
frecuentemente, de gran
importancia que aunque
antiguo sigue vigente por su
bajo índice de error pues los
errores presentados se
deben a mano de obra de
parte del microbiólogo
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker,
J. (2001). Crecimiento microbiano,
Capítulo 5. En: BrockBiología de los
Microorganismos. 8ª edición revisada.
Editorial Prentice Hall Iberia,
Madrid,España. ISBN: 84-89660-36-0.
4ª reimpresión. Págs. 155-157

Willett, H.P. (1997). Fisiología del

Crecimiento Bacteriano, Capítulo 5. En:
Zinsser, Microbiología. 20ªedición.
Editores: Joklik, W.K., Willett, H.P.,
Amos, D.B., Wilfert, C.M. Editorial
MédicaPanamericana, S.A. Buenos
Aires. Argentina. Págs. 78-109

Abalde, J., P. Hidalgo y E. Torres,

1995. Microalgas: Cultivos y
Aplicaciones. Universidad de Coruña,
España. 210 p