Sunteți pe pagina 1din 35

CULTURA DE

MERISTEME IN
VITRO

NUME: NICĂ(BUCĂTARU) IULIA

Student: Protectia mediului in agricultura anul I.


CUPRINS

Cuprins
INTRODUCERE ÎN CULTURILE DE CELULE ŞI ŢESUTURI VEGETALE .....................................................................3
1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞI APLICABILITATE .........................................................4
2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI CULTURI IN VITRO .........................................14
INTRODUCERE ÎN CULTURILE DE CELULE ŞI ŢESUTURI VEGETALE

Sfârşitul mileniului doi se caracterizează printr-o puternică implicare a biotehnologiei în viaţa


omului, în toate domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor biotehnologice s-au făcut progrese uriaşe în
crearea de noi genotipuri de plante şi rase de animale cu însuşiri favorabile şi cu randamente sporite faţă
de materialul de la care s-a plecat.

Dezvoltarea biologiei moleculare din ultima jumătate de secol s-a făcut, în principal, pe organisme
simple ca mod de organizare (bacterii, drojdii, alge, etc.), organisme unicelulare. Odată cu abordarea
organismelor pluricelulare trebuia verificat dacă noţiunile acumulate anterior erau valabile şi dacă existau şi
alte procese specifice modului complex de organizare. Cunoscându-se comportamentul organismelor
simple, cercetătorii au început să se gândească la cultura pe medii artificiale a unor porţiuni de plante sau
chiar celule. Problema care a apărut a fost aceea a menţinerii viabilităţii acestor celule, de la prelevarea de
pe planta mamă până la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe până la regenerarea
(refacerea) unei noi plante.

Ajungerea la cultura in vitro nu a fost aşa de simplă cum s-a presupus fiind necesar mult timp şi
multe cercetări, la început fără succes, dar apoi totul s-a clarificat.

În 1882, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform căreia plantele îşi sintetizează substanţele
ce determină formarea organelor, substanţe ce au o dispunere polară, iar primele încercări de culturi de
ţesuturi au fost făcute în 1902, de către Haberland, din nefericire, fără rezultatele dorite. Primele rezultate
privind cultura de celule şi ţesuturi încep să apară din anul 1922, când Knudson reuşeşte germinarea
seminţelor de orhidee in vitro iar Robbins obţine prima cultură de ţesut de rădăcină în condiţii artificiale.

Pe baza conceptului de totipotenţă celulară, conform căruia fiecare celulă conţine informaţia
genetică necesară obţinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, în anul 1952 Morel şi
Martin au stabilit şi au perfecţionat o metodologie de cultivare pe medii aseptice a explantelor
meristematice caulinare, obţinând prin creşterea in vitro a acestora plante sănătoase, libere de
viroze, pornind de la plante mamă contaminate cu diferite viroze. În acest mod se produce material
de plantat devirozat, cu o rată de multiplicare într-un ritm imposibil de imaginat prin utilizarea
tehnicilor tradiţionale de înmulţire vegetativă, evitându-se şi degenerarea soiurilor din cauza
infecţiilor virale, transmisibile prin înmulţire vegetativă.
În anul 1962, după mulţi ani de studii şi încercări, Murashige şi Skoog, au reuşit să elaboreze
un mediu de cultură considerat ca fiind de bază , care – cu mici modificări – poate fi utilizat pentru
aproape toate tipurile de culturi de ţesuturi.
Reuşita experienţelor lui Coking în 1960 privind izolarea enzimatică a protoplaştilor din
mezofil foliar, a făcut posibilă obţinerea unor populaţii mari de protoplaşti iar apoi producerea de
hibrizi somatici.
Anul 1966 este considerat drept începutul etapei moderne a cercetărilor privind cultura de explante
vegetale in vitro. Această etapă s-a caracterizat, în primul rând prin elaborarea de tehnici eficiente în
generarea, cultivarea şi fuzionarea protoplaştilor vegetali. Cu ajutorul protoplaştilor, odată cu descoperirea
noilor tehnici (electrofuziune, vectori virali transmiţători de gene izolate) s-au obţinut plante rezistente la
acţiunea unor agenţi stresanţi cum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.

Atât pe continentul american cât şi pe cel european sau asiatic, culturile in vitro sunt folosite în
special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicarea speciilor arboricole
ornamentale şi fructifere, dar şi pentru realizarea de noi genotipuri sau mai ales pentru regenerarea celor
create prin inginerie genetică.

CAPITOLUL I

1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞI APLICABILITATE

1.1.1 Definiţie

În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale, în condiţii de asepsie
deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe, părţi de organe, ţesuturi sau celule vegetale.
Reuşita culturii depinde de o multitudine de factori şi este vizibilă în momentul în care explantul creşte.

Explantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă) care se desprinde de pe
planta donor (planta mamă), şi se inoculează în condiţii sterile pe un mediu artificial de cultură. Evoluţia
explantului este dirijată de operator în funcţie de scopul urmărit. Acesta poate evolua formând o nouă
plantă (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltării organelor aeriene (tulpina şi
frunzele) şi a rădăcinii, sau poate forma calus, prin stimularea înmulţirii nediferenţiate a celulelor.

Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule întreaga informaţie genetică a plantei mamă şi
pe baza totipotenţei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta donor.

Totipotenţa, este însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de a forma o


plantă identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în practică s-a observat că
nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest caracter, datorită pe de o parte diferenţierii celulare
şi îmbătrânirii, iar pe de altă parte gradului mare de specializare al acelor celule.

Astfel, s-a demonstrat practic că, într-o plantă matură, celulele specializate care constituie
ţesuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipseşte citoplasma şi
nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul că întreaga informaţie genetică a
celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu.

La plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi pierd capacitatea de
totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân, însă, anumite zone în care activitatea celulelor este
intensă, având loc diviziunea şi formarea aproape continuă de noi celule. Aceste celule sunt mici în
dimensiuni, poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolă mică şi nucleu mare dispus central şi prezintă o
membrană celulozică, formând ţesutul cu denumirea de meristem.

Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi grosime a plantelor,
fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini.
1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro

Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau porţiuni mari de
plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul milimetrilor sau
chiar microscopice (celule, protoplaşti), explante care în condiţii normale de cultură nu ar reuşi să crească
opunând rezistenţă agenţilor patogeni şi sintetizându-şi singure substanţele nutritive necesare.

Din acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer respectate următoarele condiţii:

-prepararea unui mediu de creştere care să asigure o bună nutriţie heterotrofă a explantului, prin
asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil explantelor;

-asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură, lumină, umiditate) în limitele optime pentru
fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele acestora şi scopul urmărit;

-stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii organelor prin utilizarea corespunzătoare a


substanţelor stimulatoare de creştere;

-asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecţia materialului
vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură, precum şi efectuarea tuturor operaţiilor în hota cu flux
de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare.

1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro

Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au răspuns afirmativ, sunt utilizate în
prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară, industria uşoară, etc. În agricultură, în
general şi în horticultură în special, culturile de ţesuturi şi celule sunt folosite pentru multiplicarea unor
specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei
horticole, pentru obţinerea de metaboliţi secundari.

Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim:

-asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la cantităţi
mici de material vegetal. Teoretic, se asigură o multiplicare exponenţială, prin care în circa 6 luni se pot
obţine 1 milion de plante;

-se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme, material mai viguros, precoce şi
productiv;

-necesită spaţii mici de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura pe verticală pe
3-5 nivele suprapuse;

-obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de ţesuturi
generative (cu n cromozomi);

-dă posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care în condiţii
normale sunt imposibil de obţinut;

-selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători;


-se evită efectul sezonier de pepinieră;

-se pot obţine seminţe artificiale;

-se pot obţine plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire;

-asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normale de cultură;

-asigură păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenzi ferme de
multiplicare.

Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura in vitro şi care, deocamdată
rămân să fie înmulţite tradiţional.

Există însă şi câteva impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea în masă a
plantelor, cum ar fi:

-necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate indispensabile activităţilor de


micropropagare, care sunt costisitoare;

-necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro;

-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de producţie;

-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu răspund la metodele
cunoscute de multiplicare;

-există riscul apariţiei şi multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea autenticităţii soiurilor;

-riscul apariţiei germenilor genetici prin multiplicarea solitară numai a unor tipuri care se comportă
bine la acest tip de cultură, cu riscul sărăcirii bazei de germoplasmă pentru unele specii.

1.2 PROCESE MORFOFIZIOLOGICE LA NIVELUL EXPLANTELOR CULTIVATE IN


VITRO

Explantele inoculate pe medii aseptice îşi vor relua activitatea metabolică, se vor integra noilor
condiţii de viaţă, îşi vor reamorsa procesele fiziologice vitale şi vor începe un nou ciclu de viaţă. În
dependenţă de mediul de cultură, de natura inoculilor, de seria de operaţiuni prin care au trecut prealabil
ultimei inoculări, de condiţiile de cultură şi de scopul urmărit, după dediferenţierea celulelor şi regenerarea
de noi celule, evoluţia acestora poate fi dirijată. Inoculii pot fi menţinuţi într-o stare primară de organizare
cum ar fi: culturi de celule în suspensie (fără a intervenii formarea de agregate celulare) sau de calus, ori
pot fi induse procese de citodiferenţiere, de morfogeneză sau organogeneză.

1.2.1 Diferenţierea

Celulele meristematice, divizându-se continuu, dau naştere la noi şi noi celule care, treptat, cresc şi
suferă o specializare morfofiziologică ce poartă numele de diferenţiere.
În procesul de diferenţiere se pierd caracterele citologice şi fiziologice de tip embrionar specifice
celulelor meristematice, evoluându-se spre calităţi proprii specializării funcţionale a diferitelor tipuri de
ţesuturi sau organe în alcătuirea cărora celulele mature vor intra. În primele faze de diferenţiere se remarcă
o modificare ultrastructurală şi funcţională a celulelor, fenomen denumit citodiferenţiere.

Pe măsura diferenţierii, volumul celulei creşte, scade raportul nucleoplasmatic, citoplasma devine
peliculară şi parietală, se extinde vacuomul care împinge citoplasma şi nucleul la periferia celulei.

Plastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, în funcţie de rolul
îndeplinit de celule.

Odată cu avansarea proceselor de diferenţiere peretele celular poate suferi modificări secundare
de genul depunerilor de celuloză, lignină, mineralizare, gelificare sau chiar lichefiere, care conduc treptat la
o îngreunare a comunicării intercelulare, intervenind cu timpul un declin fiziologic sau chiar moartea
celulelor (de exemplu la sclerenchim).

Celulele odată diferenţiate nu se mai divid. Celulele care compun un ţesut sau organ nu posedă
acelaşi ritm de creştere şi se află sub un permanent endocontrol fitohormonal.

Substanţele elaborate de celule pot difuza înspre celulele învecinate exercitând un anumit rol în
dezvoltarea acestora fenomen denumit inducţie, şi care stă la baza interrelaţiilor dintre ţesuturi, ce servesc
la organizarea acestora în formaţiuni funcţionale, respectiv la organogeneză.

După diferenţiere şi generarea de noi celule se ajunge la situaţia în care celulele neoformate tind să
se reorganizeze structural şi funcţional suferind o citodifereţiere, histodiferenţiere, cu organizarea de
ţesuturi (histogeneză), de organe (organogeneză) şi în final regenerarea unei noi plante. Diferenţierea
celulară in vitro nu este foarte variată, unele funcţii sunt reduse sau simplificate în timp ce altele sunt
amplificate.

1.2.2 Dediferenţierea celulară

Dediferenţierea constă în transformarea progresivă a celulelor din starea de celulă specializată în


celulă meristematică, recâştigând aptitudinea de a se divide.

Dediferenţierea naturală a celulelor poate fi observată în organele care se ramifică sau în cazul
traumatizării organelor şi al generării, la locul rănirii, de calus. Procesul de dediferenţiere este complex şi se
instalează în momentul în care celulele primesc un impuls inductiv, de obicei fitohormonal, impuls ce
declanşează transformări la nivel molecular.

În cadrul unui ţesut nu toate celulele dediferenţiază, puţine celule devin centrii generatori de noi şi
noi celule suficiente pentru a asigura îndeplinirea fenomenelor de restituţie. În caz de traumatism organele
din ţesuturile lezate beneficiază de acumularea unor substanţe cu rol esenţial în inducerea şi stimularea
proceselor de dediferenţiere.

Deci, fitohormonii, condiţiile de cultură, natura ţesuturilor implicate, starea lor fiziologică şi vârsta
plantelor donatoare constituie factori ce intervin în procesele de regenerare.

Aptitudinea celulelor de a se dediferenţia este foarte inegal răspândită în corpul plantelor şi chiar şi
în cadrul subunităţilor structurale, morfofuncţionale, care alcătuiesc un organism, existând diferenţe mari
în ceea ce priveşte capacitatea de a se dediferenţia, la celule aparţinând aceluiaşi organ sau chiar ţesut.
Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea să-şi reorganizeze un mod de viaţă,
trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural şi funcţional în celule
meristematice, apte de multiplicare.

Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenţia este foarte inegal


răspândită la specii, organe şi ţesuturi variate.

Fazele de dediferenţiere celulară pot fi caracterizate astfel:

1.prima faza de dediferenţiere:

-amorsarea proceselor de dediferenţiere;

-producerea dediferenţierii celulelor până la dobândirea caracteristicilor citologice specifice unui


ţesut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemănătoare ca aspect şi structură cu cambiul.

2.a doua fază de dediferenţiere:

- dediferenţierea în continuare a celulelor până la stadiul de celule cu caracter de meristem primar;

-generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi (centre organogene),


ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante;

-generarea, prin proliferarea celulelor dediferenţiate, a unui calus neorganizat, structurat omogen.
La nivelul acestui ţesut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri embriogeni.

1.2.3 Regenerarea

Regenerarea este capacitatea organismelor vii de a-şi reface oricare parte le-a fost distrusă. Prin
intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor, ţesuturilor sau celulelor vegetale se exploatează la
maxim capacitatea regenerativă a celulelor explantelor, respectiv se pune în valoare manifestarea integrală
a totipotenţialităţii celulare. Teoretic, toate celulele vii ale plantelor sunt totipotente. Din celule somatice
sau obţinut plante diploide, iar din celule generative, prin androgeneză şi ginogeneză, sau regenerat plante
haploide.

Ca şi în cazul dediferenţierii celulare, se poate spune că şi în regenerare există o mare variabilitate


în ceea ce priveşte reactivitatea celulară, capacitatea regenerativă este manifestată sau nu de către o celulă
vegetală sau de un grup de celule în funcţie de numeroşi factori endogeni şi exogeni. Factorii endogeni ce
joacă un rol esenţial în regenerare sunt: vârsta celulelor, gradul de diferenţiere, capacitatea de a se
dediferenţia, conţinutul în hormoni, natura balanţei hormonale şi echipamentul enzimatic. Factorii exogeni
implicaţi în regenerare sunt:traumele şi natura acestora (stresul datorat introducerii unui explant în cultura
in vitro), precum şi condiţiile de mediu.

Totipotenţa este deţinută de către fiecare celulă a plantelor dar exprimarea sa aparţine numai
anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. Acestea sunt celule competente morfogenetic în a răspunde
la variaţi stimuli şi care, în condiţii specifice, pot da naştere la tulpini, rădăcini sau embrioni.

Numărul celulelor dintr-o populaţie cultivată in vitro care-şi exprimă potenţialul organogen sau
embriogen se află sub controlul mai multor factori.
Specia. Există specii la care regenerarea are loc în special prin organogeneză şi specii care
regenerează prin embriogeneză, dar şi specii care pot regenera atât lăstari cât şi embrioni in vitro.

Genotipul. S-a constatat că nu toate soiurile aparţinând unei specii cultivate au potenţial
regenerativ. Astfel, s-au evidenţiat genotipuri „culturabile”, ce au permis o regenerare uşoară din orice tip
de ţesut, dar şi genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui protocol de regenerare s-a făcut cu mare
dificultate şi cu rezultate slabe.

Natura explantului. La unele specii (lucerna) toate tipurile de explante generează calus regenerativ.
La altele însă obţinerea plantelor in vitro este condiţionată de utilizarea anumitor explante, de exemplu la
graminee numai embrionii imaturi, inflorescenţele foarte tinere şi microsporii generează calusuri
regenerative.

Vârsta explantelor. Calusurile iniţiate din ţesuturi tinere regenerează mult mai bine decât cele
provenite din explante mature. În embriogeneza somatică directă, exprimarea totipotenţei depinde de
stadiul de dezvoltare al explantelor. Sunt capabile sa parcurgă embriogeneza directă celulele embrionare,
celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei şi sinergidele.

Alţi factori care influenţează regenerarea sunt: starea fiziologică a plantei donor, compoziţia
mediului de cultură, vârsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea şi calitatea luminii, stresul
(biotic sau abiotic).

1.2.4 Morfogeneza in vitro

Întrucât la culturile in vitro morfogeneza prezintă aspecte particulare, specifice acestui tip de
cultură, vom adopta termenul de morfogeneză în sens larg iar în acest context, vom descrie procesele de
morfogeneză sesizabile la nivelul explantelor cultivate in vitro, respectiv organogeneza şi embriogeneza.

Bibliografia existentă până în prezent subliniază dependenţa capacităţii morfogenetice de natura


explantelor; pe de altă parte sunt numeroase referiri bibliografice care evidenţiază relaţia care există între
genotip şi competenţa morfogenetică a explantelor cultivate in vitro. Vasil (1984) a considerat ca factor
decisiv în menţinerea capacităţii morfogenetice, starea fiziologică şi de dezvoltare a explantului. Deci,
adeseori, stadiul de dezvoltare al plantei donatoare condiţionează regenerarea şi reacţia explantului , altfel
spus un răspuns morfogenetic corespunzător a fost obţinut numai atunci când explantul a prezentat un
anumit stadiu de dezvoltare. Folosirea unor explante mai tinere sau mai avansate în dezvoltare, faţă de cel
optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen.

Morfogeneza la culturile in vitro este influenţată, în mare măsură de anumiţi factori:

-conţinutul endogen în fitohormoni şi aportul exogen de regulatori de creştere;

-sărurile minerale prezente în mediul de cultură (mai ales natura sursei de azot);

-natura şi concentraţia glucidului din mediul de cultură;

-prezenţa în substrat a unor compuşi organici, în special al unor aminoacizi;

-prezenţa, natura şi concentraţia gazelor (O2, CO2, C2H4) dizolvate în mediu sau existente în
atmosfera din recipientele de cultură;
-prezenţa în substrat a unor extracte complexe, de origine biologică, sau a cărbunelui activ;

-factorii fizici (lumina, temperatura).

Deci lumina, temperatura, potenţialul osmotic al mediului, starea fizică a acestuia, tipul vaselor de
cultură sunt factori care pot influenţa în sens negativ morfogeneza.

Nu se cunoaşte încă dacă morfogeneza este influenţată şi în ce măsură, de substanţele introduse


iniţial în mediul de cultură sau de către complexul ionic, format în substrat, ca o consecinţă a autoclavării,
sau în ce măsură schimbările intervenite în compoziţia mediului, sub acţiunea inoculilor, afectează
morfogeneza.

1.2.4.1 Organogeneza in vitro

Organogeneza in vitro este un proces foarte complex care depinde care depinde de o serie întreagă
de fenomene biologice, aflate în antecedenţa momentului explantării ţesuturilor. Până în momentul
explantării ţesuturilor, celulele viitorului explant au parcurs, împreună cu sistemul cărora le aparţineau,
anumite trepte ale ciclului vital, trepte în care diferitele cerinţe fiziologice au fost satisfăcute, mai mult sau
mai puţin. Dintre aceste cerinţe amintim raportul endogen în fitohormoni şi conţinutul endocelular în
nutrienţi, ambele fiind dependente de iluminarea plantelor, de temperatura mediului ambiant, de
aprovizionarea cu săruri minerale. De modul în care au fost asigurate aceste cerinţe, prealabile explantării,
vor depinde, în mare măsură, reacţia explantelor, capacitatea regenerativă şi mai ales organogeneza la
nivelul inoculilor, derivaţi din acestea. Aspectele menţionate au fost foarte clar relevate, mai ales în cazul
studiilor de embriogeneză somatică şi de înrădăcinare a tulpinilor recalcitrante în a genera rădăcini
adventive. De exemplu, pentru inducerea înrădăcinării tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante
lemnoase, se impune un pretratament, de scurtă durată, a lor cu soluţie nutritivă, conţinând 100 mg/l AIB.
Cu toate acestea, nici o tulpină nu a înrădăcinat dacă tulpinile au fost păstrate, pe o durată lungă de timp,
în acest mediu; rădăciniţe s-au diferenţiat şi au crescut numai după ce explantele caulinare au fost scoase şi
reinoculate pe un alt mediu, lipsit de auxină (Teixeira, 1981).

Din cele prezentate, s-a putut reţine faptul că factorul endogen este dominant în obţinerea unei
anumite reacţii şi că pe lângă operarea unei modificări în condiţiile de incubare ale inoculilor, alegerea
explantului constituie factorul determinant în evoluţia acestora in vitro, în procesele de morfogeneză.

A.Rizogeneza in vitro

Un anumit fragment explantat se comportă, în linii mari, ca un minibutaş. El diferă de un butaş


normal, întrucât cel clasic deţine bogate rezerve endogene, are muguri şi eventual frunze. Mugurii şi
frunzele pot şi după desprinderea fragmentului de planta mamă să sintetizeze anumiţi compuşi hormonali.

Explantul însă, din cauza dimensiunilor sale reduse şi a detaşării sale, nu mai beneficiază de
susţineri pe care să le primească de la muguri sau de la frunze şi rămâne în totalitate dependent de mediul
de cultură. În acest caz factorul genetic, mărimea explantului vârsta plantei mamă, starea fiziologică a
celulelor pe care le deţine, sunt tot atâţia factori care concură la evoluţia ulterioară a inoculului.
Uneori, însă, in vitro, se produce o pierdere a capacităţii rizogene, mai ales ca urmare a practicării
unor repicări (subculturi) succesive. Se pune problema păstrării sau a redobândirii capacităţii rizogene.
Factorii care condiţionează menţinerea acesteia şi mai ales, cei care cauzează pierderea aptitudinii rizogene
sunt în mică măsură cunoscuţi.

Lumina poate exercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slabă sau în
urma unei perioade scurte de acţiune (600 lucşi mai puţin de o oră/zi). Temperatura optimă pentru
rizogeneză este aceea de 26 oC. Uneori, însă, se recomandă practicarea unei alternanţe între o temperatură
scăzută (5-15 oC) şi ridicată, în prezenţa luminii, a auxinei şi a unui mediu bogat în glucide.

În cele mai multe cazuri, formarea rădăcinilor este localizată polar. Rădăcinile se formează la polul
radicular al explantului, în timp ce generarea mugurilor este localizată la polul foliar. Aportul de auxină, în
concentraţie ridicată, poate perturba polaritatea. În concentraţii optime auxina stimulează rizogeneza.

B.Caulogeneza in vitro

Formarea de muguraşi in vitro, denumită şi caulogeneză, respectiv formarea de centri vegetativi,


este esenţială atunci când se urmăreşte, de exemplu, multiplicarea sau „reconstituirea” unei noi plante ori
a unui genotip, generat prin hibridare somatică. Inducerea caulogenezei, a formării de muguraşi şi tulpiniţe,
la nivelul inoculilor cultivaţi in vitro, este stimulată de prezenţa în mediul de cultură a citochininelor,
adeseori, în condiţiile asocierii acestora cu auxinele. De asemenea trebuie menţionat şi faptul ca formarea
de muguraşi la nivelul calusului se află sub controlul interacţiunii celor două categorii de fitohormoni.
Reuşita formării muguraşilor presupune nu doar prezenţa celor două tipuri de fitohormoni, ci şi a realizării
unui anumit raport al cărui eficienţă este variabilă în funcţie de specie, de provenienţa şi natura inoculului.
Se poate spune deci, că nu este important doar raportul fitohormonal, ci şi natura şi concentraţia
compuşilor utilizaţi ca regulatori de creştere. Uneori, se poate declanşa caulogeneza reducând concentraţia
de auxină. Alteori, cel mai mare număr de muguraşi este atins atunci când se folosesc concentraţii relativ
ridicate de citochinină. Dar nu există reguli general valabile. Adeseori fiecare experienţă reprezintă un caz
aparte, iar reacţia explantelor, la balanţa hormonală din substrat, variază mult, în dependenţă de tipul
materialului vegetal.

La calus, în inducerea caulogenezei, se obţin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea succesivă a
acestuia, într-o primă etapă, pe un mediu fie cu o concentraţie foarte ridicată de 2,4D, fie în prezenţa unei
auxine mai slabe ca eficienţă, dar administrată în concentraţie mare, asociată eventual cu o citochinină, în
concentraţie moderată. Acest calus subcultivat pe un mediu cu aport scăzut în auxină şi cu un conţinut
ridicat în citochinină, ar putea conduce cu succes la declanşarea procesului de înmugurire.

Factorii externi (lumina, temperatura, calităţile fizice ale mediului) sunt controversaţi în ceea ce
priveşte efectele lor asupra caulogenezei. Acţiunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor şi de
etapele parcurse anterior.

Cu toate că numeroase specii necesită o anumită fotoperioadă pentru inducţie florală, în general se
apreciază că formarea de muguraşi este independentă de fotoperioadă.

Temperatura recomandabilă pentru desfăşurarea optimă a proceselor de caulogeneză este aceea


o
de 25 C.

Folosirea alternativă a mediilor lichide şi a celor solide poate exercita un efect benefic asupra
producerii proceselor de morfogeneză. Astfel, la orhidee, se cunoaşte că menţinerea protocormilor în stare
submersă favorizează multiplicarea acestora, dar este inhibată organogeneza. Trecerea protocormilor din
mediu lichid pe mediu agarizat declanşează organogeneza. Dacă după o perioadă de menţinere a
protocormilor pe mediu agarizat (câteva săptămâni) se submersează protocormii, prin acoperirea lor cu
soluţie nutritivă diluată, sau cu apă distilată sterilă, se reuşeşte o stimulare a proceselor de organogeneză
(Cachiţă, 1983).

La monocotiledonate capacitatea caulogenă este mai moderată. Aptitudinea cerealelor de a forma


muguri in vitro este foarte variabilă. Adeseori această capacitate, la nivelul calusului, se pierde în timp, pe
măsura practicării unor subcultivări succesive (mai ales la grâu).

1.2.4.2 Embriogeneza somatică

Procesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celulară şi de


histogeneză finalizate cu formarea unui embrion se numeşte embriogeneză. Indiferent de tipul
embriogenezei, punctul de plecare în formarea viitoarei plante este o unică celulă.

Embriogeneza somatică este fenomenul prin care din celule somatice iau naştere embrioni. Aşadar
dintr-o celulă a sporofitului, pe cale sexuată se pot genera embrioni care se aseamănă foarte mult cu
embrionii zigotici. Embrionii somatici sunt, deci, un rezultat al multiplicării repetate a unei celule somatice
şi nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative.

Embriogeneza somatică in vitro a fost semnalată la morcov de către Steward şi colab. (1958) şi de
către Reinert (1958, 1959). În inducerea embriogenezei somatice un rol important l-a avut adăugarea în
mediul de cultură a laptelui din nucă de cocos datorită citochininelor naturale, aflate din abundenţă în acest
produs natural.

Prin dezvoltarea tehnicilor de embriogeneză somatică s-a reuşit o cotitură în cercetările de


embriologie experimentală. Astfel, s-a putut stabili:

-capacitatea embriogenă este conţinută în fiecare celulă, aparent banală şi că această aptitudine nu
este numai un apanaj al zigotului rezultat din fecundare;

-embrionul în formare are un anumit grad de autonomie şi nu este strict dependent de prezenţa
unui anumit mediu constituit din albumen, aşa cum este cazul la embrionul zigotic;

-atât embrionul zigotic, cât şi cel somatic trec prin faze morfologice identice, tipice cunoscute în
embriogeneza clasică şi anume: celula generatoare dă naştere la un masiv celular care, treptat suferă o
succesiune de transformări denumite arbitrar stadiul globular, stadiul cordiform, stadiul de torpilă sau
torpedo.

În embriogeneza somatică prin izolarea şi detaşarea explantelor se realizează eliberarea celulelor


din intercorelaţiile fiziologice în care se aflau integrate, prealabil desprinderii lor din corpul plantei, moment
în care se rup nu numai legăturile trofice şi fitohormonale avute, ci se sistează şi eventuala prezenţă a
factorilor inhibitori endogeni care prin represie biochimică controlau şi blocau dezvoltarea haotică a
celulelor unui organism.
1.2.5 Habituaţia sau anergismul

Habituaţia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se referă la totalitatea schimbărilor
ereditare survenite spontan, la un moment dat, în raport cu cerinţele de aprovizionare a celulelor cultivate
pe medii aseptice; acestea privesc lipsa de reacţie, de răspuns, a materialului biologic, la anumiţi
fitoefectori, regulatori de creştere sau vitamine, prezenţi în mediul de cultură.

Habituaţia nu se referă numai la reacţia inoculilor în raport cu fitohormonii exogeni, ci priveşte o


gamă mai largă de probleme, unele dintre ele neîncadrate încă în această categorie de manifestări
fiziologice. Astfel, explantul detaşat, lipsit de punctul vegetativ (dominanţa apicală), trece prin transformări
particulare, specifice noii stări fiziologice. Celulele sale, devenind autonome, pot prezenta un
comportament deosebit (Gautheret, 1980).

Mecanismul habituaţiei este încă necunoscut. Se ştie doar că, există anumiţi factori de mediu care
favorizează instalarea acestor fenomene. Dintre ei amintim: auxinele (mai ales 2,4D) şi temperaturile
ridicate.

1.2.6 Vitrificarea sau sticlozitatea

Fenomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor şi tulpinilor


şi a fost semnalat la culturile de salată în seră (Gautheret, 1980). Se apreciază că, în cazul acestui fenomen,
în anumite condiţii (cum ar fi exces de umiditate), organele aeriene ale plantelor devin translucide ca o
consecinţă a infiltrării apei în spaţiile intercelulare, înlocuindu-se aerul din ele.

În condiţii aseptice, plante vitroase pot să apară brusc. Ele suferă transformări morfofiziologice,
frunzele lor recurbându-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori ondulate şi casante,
prezentând o creştere malformată, hipertrofiată. Aspectul general este degenerat.

Studiile amănunţite asupra structurii frunzei au arătat că frunza nu are celulele diferenţiate în cele
două ţesuturi, palisadic şi lacunar. Meristemele lăstarilor vitrificaţi sunt mai mici decât la cei normali.
Celulele sunt mult hidratate şi conţin clorofilă mai puţină.

S-a constatat că prin adăugarea cărbunelui vegetal în mediul de cultură se elimină sau se reduce foarte
mult procesul de vitrificare. De asemenea ridicarea concentraţiei de agar la 1-1,1% reduce vitrificarea
(Orlikowska, 1985). Concentraţii mai mari de 0,8% de agar duc însă la scăderea ratei de multiplicare şi de
aceea este foarte dificil de îmbinat cele două aspecte.
CAPITOLUL II

2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI CULTURI IN


VITRO

Tehnicile de cultură in vitro folosite în cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la
aceeaşi premiză: posibilitatea de a controla într-un mod optim factorii de mediu (temperatură, lumină,
compoziţia mediului de cultură, pH, umiditate) necesari fragmentului de plantă inoculat în condiţii
artificiale de mediu, în încercarea de a analiza funcţiile sale fiziologice sau de a-l conduce într-o anumită
direcţie, cum ar fi formarea de noi lăstari (micropropagarea).

Tehnicile de cultură in vitro, pe lângă aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui număr de
probleme:

-menţinerea unui explant viabil şi activ din punct de vedere vegetativ;

-permiterea creşterii normale a unui explant reprezentat de o structură organizată (meristem, vârf
de creştere sau mugure);

-inducerea proceselor de diferenţiere în cazul unor fragmente de calus pentru formarea de organe
sau embrioni somatici;

-inducerea proceselor de dediferenţiere, în cazul unor explante formate din celule diferenţiate
(fragmente de tulpină, frunză, peţiol, rădăcină, etc.) rezultând o nouă organizare tisulară;

-inducerea proceselor de diviziune celulară, valabilă tuturor cazurilor amintite mai sus.

Aceste probleme au fost parţial rezolvate odată cu identificarea regulatorilor de creştere endogeni
de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut), giberelinelor, citochininelor, pentru a numi
doar cele trei clase principale de regulatori de creştere. Aceste substanţe par a determina orientarea
dezvoltării celulelor în cultura artificială, fapt pentru care li se acordă prima atenţie atunci când se încearcă
explicarea unor fenomene fiziologice.

2.1.1 Regulatorii de creştere

Existenţa hormonilor vegetali a fost bănuită încă de la începutul secolului trecut. Numeroase lucrări
ştiinţifice privitoare la aceste subiect au evidenţiat prezenţa lor, dar nu le-au putut identifica decât mult mai
târziu. Primii fitohormoni descoperiţi au făcut parte din clasa auxinelor, în jurul anului 1934, giberelinele şi
citochininele fiind descoperite mai târziu, în anii ’50. Aceste trei tipuri de regulatori de creştere exercită o
acţiune stimulativă asupra metabolismului celular. Există şi substanţe cu efecte inhibitoare asupra creşterii
şi dezvoltării celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic, identificat în anul 1965 şi substanţele fenolice
identificate câţiva ani mai târziu. De asemenea, etilena, un compus gazos, a fost recunoscută ca regulator
de creştere atunci când metodele de măsurare a acesteia au permis detectarea sa în organele plantelor.
Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect inhibitor asupra plantelor.

Aceste substanţe sunt endogene, ceea ce înseamnă că sunt sintetizate de plante. Există şi
fitoregulatori de creştere artificiali cu formule chimice asemănătoare celor naturali, prezentând o acţiune
fiziologică similară. Toate aceste substanţe, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de creştere şi au
anumite caracteristice comune:

-acţionează într-o concentraţie foarte mică, în concentraţie mare sunt toxice, de aceea unele dintre
ele sunt folosite ca erbicide;

-acţionează numai în interacţiune cu alţi fitoregulatori, funcţia lor fiind determinată de balanţa
hormonală stabilită între ei;

-intervin într-un număr de fenomene fiziologice ce implică mai multe moduri de acţiune astfel încât
noţiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost abandonată.

O diferenţă substanţială între fitoregulatorii de creştere artificiali şi cei naturali constă în faptul că
cei endogeni pot fi controlaţi de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminaţi suficient de repede,
pe când cei artificiali persistă mult mai mult fiind deseori preferaţi aplicaţiilor practice.

2.1.1.1 Auxinele

Auxinele au fost descoperite în urma unor experimente asupra coleoptilului la Gramineae. Numele
de auxine provine din grecescul auxein – a creşte, determinând elongarea celulelor (auxesis – creştere ce se
referă în special la mărimea celulei decât la numărul de celule).

Este un compus ce are la bază nucleul indolic cu formula de bază C10H9O2N cunoscut sub numele de
acid β- indolil acetic (Fig.1).

Fig.1 Acidul β- indolil acetic


A. Proprietăţile fiziologice ale auxinelor

Auxinele intervin în multe fenomene fiziologice, iar acţiunile lor depind de concentraţiilor şi de
interacţiunile cu alţi regulatori de creştere. Studiind câteva din efectele lor s-a putut concluziona că:

-exercită o acţiune clară asupra elongării celulare, aceste efect urmează creşterii plasticităţii peretelui
celular şi penetrării apei în celulă. Apoi rezistenţa peretelui scade şi celula creşte în lungime;

-modifică permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descărcare de ioni de H+,


determinând o creştere a acidităţii responsabilă de diminuarea rezistenţei peretelui celular şi o absorbţie
de ioni de K+;

-influenţează în general metabolismul celular şi în particular sinteza ARN-ului ribozomal (ribozomii


participă la sinteza proteinelor);

-stimulează diviziunea celulelor cu origine cambială (acest tip de acţiune a determinat insuccesele din
primele încercări de iniţierea a culturilor in vitro); Acest efect este descris ca histogenic deoarece conduce
la formarea unui număr de celule asemănătoare, numite calus;

-acţionează asupra sintezei etilenei într-o anumită concentraţie, etilena intervine în schimb în reglarea
nivelului de auxină cel puţin la nivelul vaselor conducătoare;

-acţionează asupra tropismului plantelor şi asupra corelaţiei dintre organe, în particular asupra
fenomenelor de dominanţă apicală;

-determină întârzierea căderii frunzelor şi a fructelor;

-au acţiune rizogenică fiind folosite în special în micropropagarea speciilor ornamentale destinate
comerţului de flori tăiate;

Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din acţiunea singulară a auxinei deoarece concentraţia
optimă este diferită pentru fiecare tip de acţiune în parte şi se schimbă în funcţie de concentraţia celorlalţi
fitoregulatori.

Modul de acţiune al auxinelor. Nu se poate da un răspuns precis, dar cercetările în domeniu au


evidenţiat existenţa unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei
ipoteze au rezultat următoarele concluzii:

-în funcţie de prezenţa sau absenţa unuia sau a celuilalt receptor apar diferenţe de reacţie în
concordanţă cu originea celulei ce reacţionează la acest fitohormon;

-în funcţie de afinitatea receptorului pentru auxină unii sunt angrenaţi mai repede decât alţii.

Au fost descoperiţi receptori şi pentru alte tipuri de fitoregulatori de creştere, de aici se poate extinde
ideea existenţei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni.
B. Auxinele în plante

Toate plantele sintetizează auxine, sinteză modulată de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza
auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor şi în florile şi fructele tinere.

Auxinele circulă de la vârful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunţată în organele tinere,
dar în cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze, ceea ce înseamnă că auxinele sunt în
concentraţie mai mare în apropierea situsurilor de sinteză. Astfel, auxinele sunt prezente într-o
concentraţie suficientă în vârful plantelor în creştere, în mugurii florali sau foliari, pentru a asigura
multiplicarea şi elongarea celulelor.

C. Auxinele sintetice

De când au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compuşi chimici similari acestora, care au generat
în celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene, ceea ce confirmă existenţa receptorilor pentru
auxine. Mai mult, fiind influenţaţi mai puţin de activitatea auxin-enzimelor , vor putea avea un efect
prelungit în plante.

Printre numeroasele substanţe folosite, cele mai importante sunt:

-acidul.indolil butiric (AIB);

-acidul naftalen acetic (ANA – Fig.2) şi derivaţii săi: acidul naftooxiacetic (ANOA) şi naftilacetilamida
(NAD);

-acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).

Fig.2 Acidul naftalen α-acetic


În practică, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puţin toxice dar şi mai puţin eficiente
deoarece activitatea acestora este rapid inhibată de acţiunea auxin-oxidazelor. De aceea produsele
sintetice le-au luat locul chiar dacă implică un risc mai mare de toxicitate.

În aplicaţiile agricole, compuşii auxinici sunt folosiţi pentru cicatrizarea rănilor rezultate în urma
tăierilor anuale din pomicultură, în evidenţierea fructelor partenocarpice sau pentru întârzierea căderii
frunzelor sau a fructelor până la recoltare, ca urmare a efectului invers exercitat de acidul abscisic.

Şi în domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleaşi substanţe urmărindu-se în principal efectele


rizogenice şi de multiplicare a celulelor pe care acestea le generează.

2.1.1.2 Giberelinele

Asemeni auxinelor, efectul giberelinelor a fost evidenţiat înainte ca acestea să fie identificate.
Primele observaţii (1926) au fost făcute pe plante de orez atacate de o ciupercă (Giberella fujikuroi) care
prezentau internoduri mult elongate şi frunze clorotice. Extractul apos din ciupercă a provocat simptome
similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea existenţei unei substanţe responsabile de aceste
efecte.

Prima giberelină identificată a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex izolat în 1939 şi numit
„giberelina A”). Această primă descoperire a fost urmată de descoperirea altor gibereline până când în
plante şi în ciuperci au fost identificate în total aproximativ cincizeci de gibereline. Aceştia sunt toţi compuşi
endogeni. În practică, giberelinele folosite sunt extracte purificate.

Cea mai folosită giberelină este GA3 (Fig.3) şi mai puţin folosite sunt amestecul GA4+GA7 sau GA7.
Este posibil ca în următorii ani să fie folosite gibereline sintetice, având în vedere că primele gibereline
sintetice au fost obţinute prin anii ’80.

Fig.3 Acidul giberelic

Toţi aceşti compuşi au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar prin calitate şi poziţia
substituenţilor în nucleu.
A. Proprietăţile fiziologice ale giberelinelor

Proprietăţile fiziologice ce urmează a fi descrise corespund acidului giberelic (GA3). Nu toate


giberelinele au activitate similară, unele sunt inactive sau doar forme intermediare, ceea ce le face dificil de
studiat, iar mai mult, nu toate plantele posedă aceleaşi gibereline.

Principalele proprietăţi ale acidului giberelic sunt:

-acţionează asupra elongării internodurilor, uneori determinând rezultate spectaculoase (ex: s-au
obţinut plante de varză cu tulpina de 3 m), dar nu asupra tuturor speciilor. Doar unele dintre varietăţile
pitice ale unor specii pot atinge talii normale în urma aplicării de GA3, în general varietăţile pitice nu
reacţionează la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul giberelic acţionează şi asupra pedunculilor
florali, împiedică maturizarea timpurie (cu 15 până la 20 de zile la Cyclamen) sau alungirea inflorescenţelor
prea dezvoltate (ex: la viţele de vie cu ciorchini denşi, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea racemelor laxe);

-în cultura in vitro giberelinele acţionează şi la nivelul meristemelor, care, în absenţa acestora,
prezintă un aspect globular;

-stimulează metabolismul celular deoarece favorizează sinteza enzimelor hidrolitice. S-a dovedit că
la seminţele de orz, acumularea α-amilazei, o enzimă cu rol în transformarea amidonului în zaharuri
solubile, este datorată acidului giberelic, care acţionează direct sau după asocierea cu un receptor.
Giberelinele acţionează, de asemenea, în prezenţa auxinelor, şi sunt deseori stimulate de sinteza sau
inhibarea sintezei auxin-oxidazelor;

-acţionează asupra înfloririi, având ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi cazul pomilor
fructiferi, sau stimulează înflorirea speciilor ce necesită temperaturi scăzute pentru a înflori, astfel încât în
prezenţa giberelinelor aceste specii înfloresc şi fără temperaturi scăzute (morcov). La alte specii, ce necesită
de asemenea temperaturi scăzute pentru înflorire, prezenţa giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fără
formarea florilor (sfeclă). Aceste contradicţii în aparenţă au o explicaţie simplă: în plantele prezentate mai
sus frigul acţionează doar asupra creşterii tulpinii, pe când în celălalt caz asupra procesului de înflorire.
Astfel, giberelinele, îşi exercită doar rolul de stimulatori ai elongaţiei neinfluenţând, în acest caz, procesele
fiziologice normale;

-acţionează asupra formării fructelor partenocarpice la păr, mandarin, prun;

-exercită o acţiune complexă asupra germinării seminţelor sau pornirii în vegetaţie a mugurilor
dorminzi, atunci când condiţiile climaterice (temperaturi scăzute) nu permit acest lucru, inducând şi
ramificarea sau creşterea ramurilor la Hydrangea;

-în organogeneză, acţiunea giberelinelor poate fi antagonică. Par a se opune fenomenului de


dediferenţiere, neputând fi folosite in vitro în acest scop, acţionând însă asupra meristemelor apicale sau
axilare şi asupra butonilor florali, prin stimularea creşterii şi dezvoltării acestora.

B. Giberelinele în plante
Giberelinele au fost descoperite atât în plante cât şi în ciuperci cu o distribuţie inegală. Unele
gibereline se pot întâlni doar în plante, altele doar în ciuperci şi unele în ambele grupe (acizii giberelici
1,3,4,7,9). Unele plante posedă doar un fel de gibereline, în alte specii se află şi acţionează mai multe tipuri
de gibereline.

Locurile de sinteză a giberelinelor se află la nivelul frunzelor foarte tinere, în mugurii foliari şi florali,
în lăstarii activi, în vârful rădăcinilor şi în embrioni.

Giberelinele circulă liber prin plantă fără existenţa unei polarităţi fiind asociate deseori zaharurilor,
eliberându-se în situsurile ţintă.

2.1.1.3 Citochininele

Citochininele au fost descoperite în timpul studiilor efectuate asupra ţesuturilor vegetale cultivate
in vitro. S-a descoperit şi acum este bine cunoscut faptul că adiţia de lapte de nucă de cocos în mediile
artificiale de cultură are un efect favorabil asupra multiplicării celulare şi în lăstărire. Cercetările ce au
încercat să descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui complex chimic activ de
natură purinică, care nu a putut fi iniţial identificat. Aceste rezultate au dat posibilitatea continuării
cercetărilor asupra purinelor şi în 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o substanţă activă numită
„chinetina”.

Citochininele sunt înlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscuţi doi compuşi endogeni:

-zeatina (Fig.4)

-izopenteniladenina, a cărei compuşi sintetici sunt: chinetina (Kin –Fig.4) (6-furfurilaminopurina) şi


benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).

a) b)

Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina

Se mai folosesc şi alţi înlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau în asociere cu zaharuri.

A. Proprietăţile fiziologice ale citochininelor


Citochininele sunt foarte active în plante şi asemeni celorlalte două clase de fitohormoni prezentate
anterior au o serie de proprietăţi dintre care:

-au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. În acest proces citochininele sunt indispensabile,
dar ineficiente fără acţiunea auxinelor, cele două complementându-se reciproc. Auxinele favorizează
duplicarea ADN, iar citochininele permit separarea cromozomilor;

-au un rol la fel de important în organogeneză stimulând formarea lăstarilor, fiind însă antagonice
rizogenezei;

-exercită un efect de stimulare a metabolismului celular, favorizând sinteza proteinelor, prin rolul
ce-l joacă în compoziţia ARN-ului de transfer şi protejând metaboliţii de acţiunea enzimelor hidrolitice.
Acest efect determină întârzierea senescenţei până la punctul în care frunzele mature tratate cu citochinine
se comportă asemănător celor tinere din punct de vedere metabolic;

-exercită un efect antagonic asupra dominanţei apicale stimulând lăstărirea axilară;

Citochininele prezintă o importanţă deosebită în domeniul culturii in vitro deoarece au permis


obţinerea unor progrese importante în micropropagarea plantelor. Proprietăţile citochininelor permit
rezolvarea dificultăţilor enumerate mai sus, cum ar fi menţinerea viabilităţii celulelor vegetale, stimularea
diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dediferenţiere.

B. Citochininele în plante

Prima citochinină endogenă a fost identificată în 1963 în embrioni imaturi de porumb, de unde şi
numele de zeatină, urmată de izopentenil adenina (IPA), descoperită puţin mai târziu în plante atacate de
bacteria Corynebacterium fasciens. Toate plantele conţin citochinine sintetizate în special în rădăcini şi în
embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze determină atragerea substanţelor nutritive spre aceste zone
datorită efectului de stimulare a metabolismului exercitat de citochinine la acest nivel. Creşterea în
dimensiuni a tuberculilor şi fructelor se datorează prezenţei citochininelor endogene localizate în aceste
organe.

Citochininele se pot asocia cu zaharurile şi circula prin plante fără polaritate. Se presupune ca ele
circulă într-o formă inactivă şi că rămân localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior, ca în cazul
aplicaţiilor pe frunze.

2.1.1.4 Etilena

Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp în urmă în încăperile de depozitare a
fructelor sau plantelor, dar funcţia sa de regulator de creştere nu a fost evidenţiată până în momentul
dezvoltării tehnicilor de analiză în plante. Etilena se află în plante în cantităţi infime şi poate fi produsă de
toate părţile acesteia.
Fig.5 Etilena

Principalele proprietăţi ale acestui regulator de creştere sunt:

-determină iniţierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosită la început pentru
coacerea fructelor la lămâi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la măr şi cireş;

-accelerează procesele de cădere a frunzelor şi fructelor, fiind folosită atunci când se urmăreşte
recoltarea mecanizată a fructelor la cireşi şi măslini;

-induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o proprietate folosită în


horticultură;

-modifică ritmul de creştere prin acţiunea pe care o exercită asupra polarităţii transportului
auxinelor;

-are acţiune favorabilă asupra tuberizării.

Aceste proprietăţi au unele puncte comune cu auxinele (înflorirea Bromeliaceaelor, corelaţii de


creştere) iar unele antagonice (căderea frunzelor şi fructelor, tuberizarea). Acţiunea antagonică a etilenei
pare a depinde de interacţiunea dintre cele două substanţe ce pot controla sinteza, concentraţia şi
circulaţia lor.

Aplicaţiile practice ale etilenei, dificil de utilizat în starea sa gazoasă, au făcut progrese doar după
descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest produs, aplicat prin pulverizare penetrează ţesuturile,
unde se eliberează etilena.

Toate părţile plantelor sunt capabile să sintetizeze etilena, însă cantitatea cea mai mare se
sintetizează în fructe, apoi într-o concentraţie mai mică în flori şi organe rănite.

2.1.1.5 Inhibitori ai creşterii

Multe substanţe au efecte inhibitoare asupra creşterii plantelor, printre substanţele endogene
enumerându-se compuşii fenolici şi acidul abscisic.

A. Inhibitorii fenolici

Inhibitorii fenolici, într-un număr mare în plante, inhibă metabolismul şi intervine în multe procese
fie ca antagonici ai regulatorilor de creştere, fie ca inhibitori ai reacţiilor metabolice. Ei intervin în inducerea
stării de latenţă a mugurilor şi seminţelor, la început prin încetinirea creşterii acestora urmată de stoparea
totală a acesteia. Nu se ştie exact rolul şi mecanismul lor în inducerea stării de latenţă.

În culturile in vitro aceşti compuşi sunt deseori sintetizaţi şi eliberaţi în mediul de cultură, unde se
oxidează cauzând brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea explantelor, de aceea în unele
medii de cultură se utilizează substanţe anti-oxidante sau adsorbanţi pentru a detoxifia mediul.

Există câteva exemple referitoare la folosirea substanţelor fenolice în cultura in vitro, cum ar fi
utilizarea florizinei pentru inducerea înrădăcinării la altoii de măr.

B. Acidul abscisic

Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat în 1965 şi de atunci a fost descoperit în toate plantele. Acest
inhibitor pare să fie sintetizat de fiecare dată când o plantă este supusă unor condiţii stresante (lipsa apei,
rănire, căldură excesivă). Existenţa acidului abscisic în celule este una din cauzele cărora plantele supuse
unor factori stresanţi îşi încetinesc activitatea metabolică. Încetinirea activităţii plantelor este reversibilă
atunci când condiţiile de stres sunt trecătoare şi poate induce starea de latenţă sau chiar decesul plantei
atunci când condiţiile nefavorabile sunt prelungite.

Fig.6 Acidul abscisic

Proprietăţile acidului abscisic sunt similare celor ale compuşilor fenolici.

Astfel, cele mai importante proprietăţi ale acidului abscisic sunt:

-acţiune favorabilă asupra căderii frunzelor şi fructelor;

-determină creşterea permeabilităţii celulelor faţă de ionii de potasiu, ceea ce poate influenţa
închiderea stomatelor;

-acţionează asupra înfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi scurtă cultivate în condiţii
perfecte de periodism, poate inhiba complet înflorirea acestora (Volubilis) sau inhiba parţial (Chenopodium
rubrum), sau chiar stimula înflorirea (Plumbago). În cazul în care plantele de zi scurtă sunt supuse unor
condiţii de zi lungă poate induce înflorirea unora dintre specii şi inhibarea altora. Aplicat asupra plantelor
de zi lungă, acidul abscisic poate inhiba înflorirea atunci când plantele sunt supuse unor condiţii normale de
fotoperiodism (spanac, Lolium temulentum). Aceste observaţii pot conduce la supoziţia că nopţile lungi
favorizează sinteza acidului abscisic, dar această supoziţie este prea simplă pentru explicarea modului
diferit de acţiune a acidului abscisic.
Acidul abscisic este foarte puţin folosit în culturile in vitro, şi în funcţie de speciile folosite şi de
condiţiile de cultură utilizate poate induce reacţii foarte diferite şi greu de interpretat.

Concluzii

Regulatorii de creştere endogeni sunt prezenţi în plante pe tot parcursul vieţii acestora, dar
prezenţa acestora nu este constantă. Concentraţiile lor se schimbă în cursul diferitelor stagii fiziologice şi
sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeaşi etapă fiziologică. Variaţia continuă în plante a
conţinutului în regulatori de creştere determină problemele legate de alegerea momentului de recoltare a
explantului.

Tehnicile de cultură in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care cele mai
importante sunt auxinele şi citochininele.

Raportul citochinină–auxină influenţează procesele fiziologice din explante, determinând evoluţia


acestora în diferite sensuri în funcţie de concentraţia celor doi fitohormoni. Astfel, după Skoog,
comportamentul fiziologic al explantelor va fi:

-dacă raportul auxine – citochinine este mare, se induce rizogeneza;

-dacă raportul este subunitar se induce lăstărirea, explantele tind spre o funcţionare caulogenică;

-dacă raportul este apropiat de unitate, explantele au tendinţa să genereze formaţiuni calusare.

Această schemă generală este întotdeauna valabilă, chiar dacă există variaţii în funcţie de tipul de
explant şi mai ales în funcţie de specia luată în cultură. Pe lângă aceşti fitoregulatori principali există şi alţi
regulatori de creştere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar în cele mai multe cazuri aceştia au doar rol
stimulator sau favorizant şi rareori esenţial.

2.2 ALEGEREA EXPLANTULUI

Celulele vegetale vii au capacitatea potenţială de a intra în diviziune şi de a reproduce un individ


întreg similar plantei donor. Această capacitate denumită „totipotenţa celulară”, indică faptul că fiecare
celulă deţine toate informaţiile necesare regenerării unei plante întregi, proprietate ce este tot mai mult
exploatată în culturile in vitro.

Chiar dacă toate celulele au totipotenţă nu este uşor, cel puţin pentru moment, să se folosească în
practică această calitate, însă cu cât cercetările avansează, cu atât numărul acestora va creşte.

Este mai uşor de ales un grup de celule, de exemplu un explant, capabil să reacţioneze în condiţii
artificiale de cultură unde să evolueze spre multiplicare clonală mai mult sau mai puţin semnificativ în
funcţie de răspunsul obţinut. Micropropagarea face posibilă obţinerea de plante identice din punct de
vedere genetic cu planta mamă, însă uneori este şi sursă de variabilitate genetică atunci când explantul este
supus anumitor condiţii.
Înainte de a decide criteriile de selecţie ale unui explant este necesară cunoaşterea evoluţiei
fiziologice ce va ajuta la înţelegerea diferenţelor dintre comportamentul celulelor unui segment de plantă
atunci când este detaşat de planta mamă.

2.2.1 Etapele fiziologice ale unei plante

În contextul reproducerii sexuate se poate preciza, într-o manieră simplistă, că ciclul de viaţă al unei
plante se împarte în patru stadii principale.

A. Embriogeneza

Embriogeneza începe cu fecundarea unei oosfere de către un anterozoid. Oul astfel format este
protejat de ovul unde începe să se dividă. Celulele se organizează la început într-o masă sferică (faza
globulară a embrionului), apoi se dezvoltă forme simetrice reprezentând cotiledoanele rudimentare (faza
cordiformă a embrionului dicotiledonat) după care se dezvoltă structurile cotiledonare, hipocotilul, gemula
şi radicula (stadiul de torpedou al embrionului). De la acest stadiu începe diferenţierea celulară.
Specializarea celulelor este încă foarte puţin datorată unei funcţionări programate şi mai mult datorită
unui program genetic ce se va păstra şi în celulele mature ce în anumite condiţii se vor comporta similar
unor celule gametice, dând naştere unor organe sau embrioni, de această dată somatici.

În momentul de faţă, nu se cunoaşte pe deplin mecanismul diferenţierii celulare. Se presupune că


poziţionarea celulelor în relaţie cu celelalte celule, dar şi cu mediul de cultură, determină un schimb de
semnale biochimice, ce modulează funcţionarea fiecărei celule.

În contextul ipotezei mai sus menţionate, diferenţierea celulară intervine ca urmare a două cauze:
pe de o parte, datorită eredităţii genetice a celulei (fiecare celulă are acelaşi echipament informaţional
genetic), în care acţionează programul embriogenic, iar pe de altă parte, datorită poziţionării specifice a
celulei care va fi recunoscută de structurile membranare. Aceste structuri filtrează informaţiile şi permit sau
împiedică circulaţia unuia sau altui semnal capabil să modifice programul informaţional spre un anumit tip
de celulă.

Sfârşitul acestei prime etape este marcat, în general, după ce substanţele sunt depozitate în
albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminţei, ce induce intrarea embrionului în starea de latenţă.
Seminţele pot fi apoi diseminate, putându-se păstra şi rezista condiţiilor nefavorabile din mediul
înconjurător.

B. Stadiul vegetativ

Când condiţiile externe sunt favorabile şi starea de latenţă este întreruptă seminţele germinează şi
din embrion ia naştere o nouă plantă. De creşterea plantelor sunt responsabile două tipuri de meristeme:
meristemul caulinar ce determină creşterea părţii aeriene a plantei şi meristemul radicular, ce determină
creşterea părţii subterane a plantei.

Meristemul caulinar are o structură bine definită, fiind alcătuit dintr-o parte externă, epiderma de
două sau trei straturi numită tunica, şi o parte internă sau corpus. Într-o secţiune transversală se poate
observa o parte apicală unde celulele au o activitate mitotică redusă, înconjurată de un inel de celule aflate
în diviziune activă, celule responsabile de creşterea tulpinii. Diviziunea începe de la inelul iniţial: zona
epidermală diferenţiază în frunze rudimentare spre exterior, iar spre interior în parenchim cortical şi vase
conducătoare. Centrul este umplut de meristemul medular. Meristemul caulinar are o funcţionare ritmică
programată genetic cu o precizie aflată, în primul rând, în aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuţie
corespunzătoare unei simetrii particulare fiecărei specii) şi, în al doilea rând, în forma frunzelor. Se remarcă
aici că florile ce permit identificarea şi clasificarea plantelor se bazează aproape exclusiv pe caracterele
morfologice. Ipoteza prezentată mai sus privitoare la diferenţierea celulelor în interiorul embrionului poate
fi luată în considerare similar celei privitoare la meristeme.

La început, plantula este hrănită din rezervele nutritive aflate în endospermul seminţei, primele
frunzuliţe, deseori conturate în interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute sub
denumirea de frunze juvenile. Planta creşte şi devine capabilă să se hrănească singură, rădăcinile
transportă spre frunze sărurile minerale şi compuşii organici odată cu regulatorii de creştere. În schimb,
rădăcinile primesc de la frunze substanţe nutritive bogate în glucozide, vitamine şi de asemenea în
regulatori de creştere. Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante, stabilind corelaţii de
creştere între sistemul aerian şi cel subteran al plantei.

Fig.7 Meristem apical

Corelaţiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar, ceea ce va
conduce la dezvoltarea formei specifice fiecărei plante (arbore, tufiş, tulpini întortochiate sau împrăştiate,
etc). Această arhitectură poate fi modificată prin curăţarea de uscături sau ramuri nefolositoare, prin
conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de creştere. În contrast frunzele îşi menţin forma.
Fig.8 Meristem radicular

Această diferenţă indică faptul că principalele corelaţii implică, în general, informaţii despre
întâietatea mugurilor, care e controlată mai degrabă de fenomene de creştere relative decât de moştenirea
genetică.

Stadiul vegetativ durează, în funcţie de specie, de la câteva săptămâni la câteva luni pe an, un an
pentru plantele bienale sau mai mulţi ani pentru cele perene. În ultimul caz, sistemul vegetativ va fi
construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de creştere alternând cu cele de repaus. Această
succesiune, care reflectă adaptarea plantei la climatul mediului înconjurător, este determinată de
stimulările sau inhibările reliefate ca răspuns la variaţiile condiţiilor de mediu (temperatură, lumină, secetă,
umiditate, etc). Plantele ce intră în perioada de latenţă îşi sistează creşterea, substanţele glucizidice
nefolosite sunt păstrate în rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau părţile aeriene ale plantelor
ierboase se usucă. Atunci când revin condiţiile favorabile (latenţa mugurilor este indusă de obicei de
temperaturile scăzute) reîncep creşterile, formarea frunzelor şi a părţilor aeriene.

C. Stadiul reproductiv

Stadiul reproductiv este marcat de modificările de ritm în funcţionarea meristemului caulinar. Inelul
iniţial încetează progresiv să mai funcţioneze şi se observă că celulele centrului latent intră în diviziune
activă iniţiind formarea florii sau a inflorescenţei. Diferenţierile încep la margini unde se formează
staminele şi părţile fertile ale plantei: staminele şi pistilul. Florile angiospermelor sunt considerate lăstari
modificaţi constituite dintr-un ax central şi anexele sale sterile (periantul) sau fertile (staminele şi pistilul).

Aceste nou program este la fel de precis ca şi precedentul şi se presupune că mecanismele de


diferenţiere sunt similare. Instalarea stării generative este progresivă şi la început poate fi reversibilă, în
unele condiţii este posibil să se revină la starea vegetativă.

Modificările modului de acţiune pot fi controlate fie de plantă şi în aceste condiţii variaţiile
climatice nu au nici un efect, fie de variaţiile climatice (temperatură, lumină, umiditate), caz în care planta
percepe aceste variaţii şi drept răspuns emite stimuli ce vor direcţiona meristemul spre stadiul reproductiv.
La unele specii, existenţa un timp îndelungat a condiţiilor nefavorabile de mediu poate duce la împiedicarea
înfloririi. Floarea constituie ultimul stadiu în viaţa unui meristem, asigurând prin fertilizare, continuitatea
speciei. La unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot induce formarea florilor.
Această caracteristică permite plantei să supravieţuiască mai mulţi ani (Saintpaulia, cerenţel-Geum
urbanum, căpşun, etc). Dacă aceste meristeme sunt induse artificial să înflorească, plantele înfloresc şi mor
comportându-se asemeni unei plante anuale.

Cercetările asupra naturii stimulilor ce acţionează asupra meristemelor florale nu sunt concludente,
ştiindu-se doar că intervin unii fitohormoni dar şi alte substanţe. Se pot cita câteva modele de culturi in
vitro, în care, variind componentele mediului de cultură şi proporţia fitoregulatorilor de creştere s-au putut
obţine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive.

D. Stadiul de senescenţă

Stadiul de senescenţă urmează stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele sunt
la sfârşitul vieţii lor, fructificarea epuizând rezervele, rădăcinile nu mai hrănesc planta în mod normal,
schimburile de substanţe nutritive se reduce şi plantele se pregătesc de iernare. La speciile perene, această
etapă începe prin încetinirea funcţiilor rădăcinilor odată cu debilitarea întregii plante, ce devine mult mai
sensibilă la toate tipurile de atac. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor să intervină cel puţin la
începutul acestui stagiu fiziologic (acidul abscisic şi etilena, alături de alţii).

Această scurtă prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieţii unei plante ne permite
înţelegerea importanţei interacţiunilor ce reglează morfogeneza plantelor. Astfel, interacţiunile pe distanţă
scurtă, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor şi al meristemelor vegetative şi regenerative. Alt
tip de interacţiuni sunt interacţiunile dintre organe ce permit plantelor să recunoască mediul înconjurător şi
variaţiile ce intervin la nivelul acestuia. Planta va putea să se adapteze noilor condiţii datorită schimbului de
semnale sub forma fitohormonilor sintetizaţi în anumite locusuri, circulând în direcţia unui punct ţintă ce
răspunde la acel stimul. În cursul deplasării lor fitohormonii sunt controlaţi de sistemele enzimatice
existente în plante. Aceste interacţiuni sunt de aşa natură încât de-a lungul unui ciclu de viaţă al unei
plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de creştere evoluează continuu şi reflectă la un moment dat,
nu doar starea prezentă a mediului înconjurător al celulei, ci şi ultimele evenimente petrecute cu acea
celulă. Datorită acestui fapt, la recoltarea unui explant trebuie să se ţină seama de valoarea acestui
echilibru, ce depinde de stadiul fiziologic şi de vârsta plantei donor, dar şi de organul de pe care se prelevă,
precum şi de mărimea şi natura fragmentului excizat.

2.2.2 Selecţia explantelor în funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei mamă

În funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei donor explantele pot reacţiona diferit la condiţiile
culturii in vitro. În general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivită de explante, potenţialul de
adaptabilitate al explantelor la condiţiile artificiale de viaţă diminuându-se cu vârsta plantei mamă.

În cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizaţi din ovul şi inoculaţi pe mediul de cultură dacă se
află în stadiul globular, putând reproduce un individ normal şi complet. Această tehnică prezintă un interes
scăzut atunci când se are în vedere micropropagarea (potenţialul genetic al embrionilor este rareori
cunoscut cu excepţia cazului strict de autogamie). Pe de altă parte, această tehnică permite studierea
cerinţelor speciale necesare unui embrion izolat. În unele cazuri, de încrucişare interspecifică sau
intergenerică, când embrionii pot fi avortaţi sau mor imediat în ovul, această tehnică permite creşterea şi
dezvoltarea normală a acestor embrioni.
Ţesuturile embrionare sunt uşor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au obţinut
rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinţelor nutritive pentru cultura ţesuturilor speciilor
studiate. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniţiate din explante bătrâne. În unele
cazuri aceasta este singura cale cunoscută.

După germinarea în stadiul juvenil, ţesutul prelevat prezintă un răspuns favorabil in vitro şi este
sursa multor succese în domeniu. Odată cu înaintarea în vârstă a plantei donor, potenţialul de cultură in
vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminuează. Acest fenomen este specific mai ales plantelor
perene, şi în mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnică a lemnului nu este măsurabilă, cu
excepţia arborilor adulţi. În acest stadiu, totuşi, pentru multe specii, iniţierea culturii doar din butaşi nu mai
este posibilă, deoarece în stadiul tânăr aceştia au o capacitate rizogenică ridicată.

Există două tehnici ce permit obţinerea de puieţi la speciile pomicole şi arboricole:

-una ar fi utilizarea lăstarilor tineri de la baza speciilor pomicole şi arboricole. În acest caz lăstarii
par a avea caracteristici juvenile şi înrădăcinează mai repede (de exemplu la nuc şi eucalipt). La aceste
specii ţesuturile de origine ale noilor lăstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil, probabil datorită
faptului că se află în apropierea rădăcinilor;

-a doua tehnică este aplicată pentru multiplicarea speciilor pomicole şi arboricole tropicale şi a
coniferelor. Această tehnică permite rejuvenilizarea şi obţinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un arbore
sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din sămânţă. Altoiul creşte şi este apoi înlăturat fiind ulterior
altoit pe alt portaltoi. După mai multe altoiri altoiul începe să prezinte caracterele juvenile, ceea ce-l face
apoi apt pentru propagare prin butăşire.

La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuliţă ce se formează
are caractere juvenile (prima frunzuliţă a meristemului la viţă de vie are caracteristici similare celei
dezvoltate din sămânţă, de asemenea, şi la orhidee meristemele dezvoltă, în cultura in vitro, protocorm
identic cu cel obţinut din sămânţă). Rejuvenilizarea observată este deseori obţinută din prima subcultură,
însă uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obţine aceste efect, în funcţie de specie.

Întoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorată supresiei de informaţii citoplasmatice sau datorită
diminuării considerabile a acestora determinând astfel posibilitatea regenerării de noi celule. Mecanismele
exacte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplin cunoscute. Se pare că citochininele sunt
implicate, cel puţin parţial, în acest proces, dar ele nu acţionează singure.

Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci când plantele donor
sunt în stadiul reproductiv. Se pare că schimbările ce apar în ritmul de funcţionare al meristemelor este
favorabil şi determină în ţesuturi un echilibru optim culturii in vitro.

Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la plante aflate în stadiul de senescenţă, dar
rezultatele sunt în general slabe sau incomplete.

2.2.3 Selecţia explantelor în funcţie de vârsta explantului

Problemele legate de vârsta explantului apar la speciile perene în care se poate distinge un stadiu
activ şi unul lent, latent, între care reacţiile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele experimente, ce vizau
cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au eşuat atunci când s-a încercat iniţierea unei culturi de
ţesuturi din meristeme prelevate de pe ramuri în vegetaţie, dar au avut succes atunci când s-a pornit de la
meristeme prelevate din muguri dorminzi.

De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimbă. Primăvara organele cresc şi
analizele relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul auxinelor, giberelinelor şi citochininelor. Vara
transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare se diminuează, iar toamna se sintetizează inhibitorii
creşterii. De aceea, nu e surprinzător faptul că explantele, prelevate de la aceeaşi plantă în perioade variate
ale vegetaţiei, vor da răspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe acelaşi tip de mediu.

De aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în vedere micropropagarea
speciilor lemnoase. Unele explante au tendinţa de a înrădăcina uşor atunci când sunt prelevate în anumite
faze de vegetaţie, în special dacă sunt excizate în perioada de vegetaţie, când concentraţia de auxină este
maximă.

La speciile cunoscute deja ca „recalcitrante” la cultura in vitro, pentru realizarea rejuvenilizării se


poate supune planta mamă, pentru o perioadă scurtă, unui tratament cu temperaturi scăzute, unui regim
de lumină particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor intern în vederea
stimulării rizogenezei.

2.2.4 Selecţia explantelor în funcţie de amplasarea plantei donor

După determinarea stadiului şi perioadei optime explantele pot fi prelevate. După tipul de
organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în considerare două cazuri:

1.Explantele ce au o structură rudimentară sau organizată, cum e cazul mugurilor, apexurilor


caulinare, meristemelor şi apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniţierea unei culturi de ţesuturi,
deoarece acestea sunt receptive şi ridică cele mai puţine probleme, generând cu uşurinţă, în condiţiile unui
mediu de cultură adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dacă mediul de cultură nu este
potrivit poate tulbura funcţiile explantului şi conduce la dediferenţierea celulelor, generând calus.

Utilizarea acestui tip de explante este similară unei microbutăşiri şi este tehnica cel mai des folosită
atunci când se urmăreşte micropropagarea pe scară largă a unei specii.

Interesant de amintit este faptul că explantele posedă un fel de memorie a tipului de creştere ce l-
au prezentat in vivo, acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante la care
corelaţiile de creştere sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante cu
rădăcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pământ şi nu erecte. Unele cercetări au
evidenţiat faptul că această „memorie” aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem.

2.Explantele constituite din diferite tipuri de ţesuturi, cum ar fi fragmente de tulpină, frunze, flori şi
fructe, cărora, inoculate pe mediu de cultură, li se induce o reversie completă cu scopul de a restaura
capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din nou capacitatea organogenică.

Pentru aceste explante, în funcţie de specie, s-a dovedit că toate părţile plantei sunt capabile să
urmeze procesul dediferenţierii conducând spre o nouă organizare structurală. Dar, în acest caz, diferenţele
între specii sunt uriaşe. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile să regenereze din toate
părţile plantei (peţiol, limb, rădăcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii sunt mai recalcitrante, cum
ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obţinute doar din fragmente de tulpină. Unele
specii sunt total recalcitrante, nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi din explantele amintite, iar la
unele conifere s-a reuşit obţinerea de propaguli doar din cotiledoane.

În general, cele mai bune rezultate au fost obţinute, la cele mai multe specii, din fragmente de limb
foliar şi tulpini tinere.

2.2.5 Selecţia explantelor în funcţie de mărimea şi natura acestora

Mărimea explantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. Cu cât explantul
este mai mare cu atât echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant şi mediul de cultură va avea o
influenţă limitată. În cazul explantelor de dimensiuni mici direcţionarea acestuia în sensul dorit se face mai
uşor, deoarece explantul este receptiv la substanţele din mediul de cultură, şi anume la regulatorii de
creştere existenţi.

Explantele organizate cuprind în general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt
înlăturaţi), fiind o unitate suficient de completă pentru care mediul va favoriza creşterea, sau în cazul
diferenţierii axilare, va bloca creşterea apicală. Pentru meristemele ce trebuie să aibă dimensiuni foarte
mici, există o mărime minimă ce conţine domul meristematic cu două primordii foliare. Sub această
mărime supravieţuirea explantului este foarte dificilă şi pierderile sunt mari, peste această dimensiune,
răspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , însă în detrimentul eliminării virusurilor.

Dimensiunile explantelor variază între 5 şi 10 mm, ceea ce corespunde unei manipulări uşoare a
materialului vegetal, sub aspectul excizării sau prelevării, fasonării şi inoculării acestora. De exemplu, prin
cultivarea pe acelaşi mediu de cultură, a mai multe fragmente de peţiol de Saintpaulia, de 1,5; 3; 5 şi 7 mm,
s-a observat că doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale. Fragmentele de 1,5 mm au
generat două tipuri de rezultate: unele explante s-au veştejit, iar altele au format doar rădăcini. Fără
îndoială, în ultimul caz, auxinele prezente în mediu au jucat cel mai important rol, pe când în cazul
fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în joc şi fitohormonii endogeni.

Se pot fasona explante din diferite tipuri de ţesuturi: epidermal, cortical, parenchim medular, dar şi
răspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de ţesut este cel epidermal. Ţesuturile corticale şi cambiale
prezintă de asemenea rezultate bune, dar rămân deseori în stadiul de calus. Parenchimul medular este
ţesutul cel mai puţin regenerant, aceste ţesuturi cer o armonizare perfectă între regulatorii de creştere, un
exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit măduvă de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre
auxine şi citochinine.

Din ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă orientarea regenerării spre stadiul
caulogenic (lăstari), rizogenic (rădăcini), calusogenic sau reproductiv. Acest experiment confirmă ipoteza
unei activităţi crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse.

Cel mai mic explant este constituit dintr-o singură celulă, cum e cazul protoplaştilor izolaţi mecanic
sau enzimatic. Protoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce plante, dar nun sunt capabili de
inducerea meristemelor florale.
2.3 RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ

Prima problemă ce trebuie rezolvată, atunci când se iniţiază o cultură in vitro este menţinerea
viabilităţii (pe lângă problema asepsiei) explantului. Deseori se poate observa, după fasonarea explantului,
o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin în contact direct cu mediul de cultură, fenomen datorat
oxidării substanţelor fenolice sintetizate în mediu, oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale. Mai
mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre explant şi mediul de cultură. Nu toate
speciile prezintă fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la aceste specii problema este parţial
rezolvată prin imersia explantelor într-o soluţie antioxidantă (soluţie de acid ascorbic cu acid citric în
proporţie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat după fasonarea acestuia sau prin adiţia în mediul de cultură a
unor substanţe adsorbante sau detoxificante, cum ar fi cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau
polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l).

Odată rezolvată această problemă este necesară orientarea explantului, în funcţie de natura sa, în
direcţia dorită de operator.

2.3.1 Explante cu structură rudimentară

Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode.

Prima metodă constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de cultură a fitohormonilor
din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga şi citochinine, întotdeauna într-o doză
foarte mică.

După iniţierea pe acest tip de mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la baza
explantelor. Este de dorit ca aceste explante să rămână de dimensiuni mici, deoarece dacă acest calus
creşte în dimensiune, ceea ce deseori se întâmplă, indică existenţa unui dezechilibru între substanţele
minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. După formarea calusului, ce are rol protector (asemeni
calusului format la o rană) se formează prima frunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai târziu are loc
elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelaşi tip de mediu la unele
specii ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe două medii succesive, la speciile lemnoase. Primul mediu
va iniţia creşterea, putând fi utilizat ulterior şi pentru propagarea fragmentelor cu un nod (microbutăşire).
Al doilea mediu, îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolil acetic), serveşte ca mediu de
înrădăcinare (Actinidia, măr, numeroase specii lemnoase).

A doua metodă constă în blocarea creşterii apexului caulinar favorizând regenerarea şi dezvoltarea
lăstarilor laterali (axilari), caz în care mediul de cultură este adiţionat cu citochinină (de la 1 la 10mg/l).
Lăstarii regeneraţi pot fi izolaţi şi crescuţi pe mediu pentru creştere, fără hormoni sau cu acid giberelic în
concentraţie mică. În unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultură pentru înrădăcinarea lăstarilor,
mediu adiţionat în general cu auxine.

Utilizarea acestui tip de explante este importantă deoarece asigură posibilitatea efectuării unui
număr foarte mare de subculturi şi, din punct de vedere genetic, un minim de variabilitate.
2.3.2 Explante constituite din diferite tipuri de ţesut

Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate în ţesuturi fără o organizare structurală,
putând proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpină, frunze, rădăcini) sau generativ (ax floral,
sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct).

Celulele ce răspund la cultura in vitro trebuie să treacă prin procesul de dediferenţiere, adică sa se
întoarcă la stadiul de celule nediferenţiate. Acest tip de reversie este mai uşor de obţinut la celulele
vegetale şi mai greu la cele animale.

Observaţiile asupra acestui tip de celule au evidenţiat câteva modificări ce intervin în procesul
dediferenţierii: se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul se măreşte, citoplasma
devine mai densă. După realizarea acestor modificări celulele încep să se dividă, stadiu denumit
histogeneză, uşor de realizat prin adiţia în mediul de cultură a auxinelor. În al doilea stadiu, numit
organogeneză, citoplasma celulară devine şi mai densă, cu vacuole mici şi nucleu voluminos. Celulele
păstrează capacitatea de a se divide, dar celulele fiice vor fi capabile să se organizeze într-o masă
meristematică ce se va dezvolta într-un nou individ.

Observând un explant în cultură se observă formarea, mai întâi, a unei formaţiuni calusare cu rol
protector. Celulele aflate în imediata apropiere a mediului sunt primele ce încep să se dividă şi să se
dediferenţieze.

Dacă celulele ce vin în contact cu mediul brunifică, nu se mai formează calus şi deci tot explantul
moare. Celulele ce răspund la cultura in vitro au o poziţie precisă, de exemplu la Begonia rex, celulele
generatoare sunt cele subepidermale situate la baza perişorilor glandulari. În general celulele ţintă, adică
celulele ce răspund uşor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale, în special cele provenite din
tunică, dar pot avea şi alte origini. Aceste celule se vor organiza într-un meristem, care va dezvolta ulterior
o plantulă întreagă cu tulpini şi rădăcini, cum este cazul la Begonia şi Saintpaulia.

La alte specii, cum ar fi Pelargonium, se observă în primul stadiu formarea de calus (calusogeneza),
unde celulele regenerante se divid activ, şi doar în al doilea stadiu, ce poate avea loc pe acelaşi mediu de
cultură sau pe alt mediu, se dezvoltă meristemul ce va da naştere noii plantule. Când se formează
meristemul prezintă, în funcţie de specie, acelaşi mod de a se dezvolta ca şi explantele organizate, doar că
se cere un mediu mai complex pentru a asigura elementele nutritive necesare dezvoltării complete până la
stadiul de plantulă.

Al doilea proces de organizare, mai puţin frecvent, este acela în cursul căruia celulele se vor
comporta ca un ou fertilizat, urmând etapele embriogenezei. Vom vorbi astfel de embrioni sau
embriogeneză somatică. Acest fenomen, descris pentru prima dată la celule de morcov, a fost descoperit la
mai multe specii, atât anuale cât şi perene.

Ca o trăsătură generală, inducerea embriogenezei depinde în cea mai mare măsură de compoziţia
mediului de cultură, dar şi de genotipul de la care se prelevă celulele generatoare. În multe cazuri
embriogeneza somatică, este precedată de formarea de calus, în acest caz izolarea celulelor nu mai este un
factor decisiv (Fig 9).
În cursul dezvoltării se observă cum celulele se divid şi embrionii ajung în stadiul globular, apoi
apare simetrie între forme şi embrionul evoluează spre stadiul cordiform şi apoi într-un embrion capabil să
genereze o plantulă (Fig 10).

Pentru celulele capabile să genereze embrioni somatici sunt suficiente două medii de cultură.
Primul asigură formarea embrionilor, putând servi şi ca mediu de micropropagare, iar al doilea va induce
germinarea embrionilor.

Uneori sunt necesare mai multe subcultivări pe medii fără hormoni pentru a induce germinarea
embrionilor somatici şi creşterea plantulelor, în timpul acestor subcultivări are loc diluţia fitohormonilor la
nivel celular permiţând astfel dezvoltarea normală a celulelor.

Fig. 9 Embrioni somatici de morcov regeneraţi din calus

Utilizarea explantelor diferenţiate este foarte avantajoasă deoarece sursa de explante este
nelimitată şi rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. În funcţie de răspuns, aceste explante
prezintă unele dezavantaje la nivel genetic.

În primul rând, celulele ce dau naştere noilor plantule sunt somatice şi există probabilitatea ca
celule mutante să genereze embrioni din care să ia naştere noi plante.

a b c

Fig.10 Embrioni somatici de citrice: a) în stadiul globular, b) în stadiul cordiform, c) generând o plantulă
În al doilea rând, cea mai mare rată de inducere a embriogenezei somatice are loc din calus, caz în
care, datorită ritmului intens de diviziune celulară numeroase celule pot prezenta modificări la nivel genetic
(modificări cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau modificări citoplasmatice). Această
variabilitate poate fi suficient de mare şi în unele cazuri a fost chiar folosită pentru inducerea de mutanţi,
prin stimularea formării calusului pe medii adecvate fitohormonal şi chiar prin subculturi succesive ale
calusului pentru creşterea probabilităţii mutaţiilor. După fragmentarea calusurilor şi inocularea lor pe medii
pentru regenerare, s-a observat că printre plantulele neoformate unele prezentau modificări morfologice
evidente mai ales citoplasmatice. În consecinţă, de fiecare dată când propagarea unei specii necesită
trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calităţii genetice a plantelor obţinute.

Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetările asupra culturilor ce au pornit de la explante
diferenţiate au permis înţelegerea modului de acţiune al fitoregulatorilor de creştere, a căror echilibru în
mediul de cultură este determinant pentru orientarea celulelor să funcţioneze într-un ritm ales de
operator, ţinând cont de echilibrul endogenic. Nu se ştie nici în prezent care este modalitatea de a
determina exact concentraţia şi balanţa hormonală atunci când se apelează la fitoregulatori exogeni, dar
pe de altă parte, aceştia din urmă permit cercetătorilor manipularea materialului biologic în sensul dorit.

Aceste cercetări, ce sunt încă incomplete, sunt baza de la care s-a pornit în realizarea multor aplicaţii
practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a început să fie tot mai mult
folosit.