Imunologie LP 1 – 14.03.

2018

Reactii serologice

Reactie serologica= reactie Ag-Ac. Se foloseste in scop diagnostic ca sa masuram Ac sau Ag,
sau in scop terapeutic fie sa neutralizeze fie sa produca (reactie serologica in scop terapeutic ca sa
produca Ac: vaccinul).

Proceduri de diagnostic
Procedurile de diagnostic pot sa fie calitative si cantitative.
-calitativ= un rezultat prezent-absent.
-cantitativ= avem o cifra si o unitate de masura.
Exista tehnici sensibile si specifice. Tehnica sensibila inseamna putine rezultate fals-negative,
deci detecteaza tot ce poate fi detectat, deci e o tehnica care selecteaza indivizii la risc si se foloseste in
procedurile de screening ca sa selecteze cat mai multe cazuri posibile, are nivel jos de detectie. Necesita
intotdeauna confirmare printr-o metoda specifica, care are putine rezultate fals-pozitive si este o tehnica
de confirmare (deci avem screening urmat de confirmare).
Sensibila-specifica: in cancerul mamar orice femeie peste 40 de ani va face mamografie, care e
o tehnica sensibila de screening; confirmarea se face prin biopsie, dar nu incepi niciodata cu tehnica
specifica, pt ca nu se face anual biopsie la toate femeile peste 40 de ani.

Clasificare
1.Reactii serologice simple: vizualizare directa a reactiei Ac-Ag
2.Reactii serologice complexe in care pt vizualizare avem nevoie de un marcaj care se poate realiza cu:
a. O substanta fluorescenta, si avem reactii de imunofluorescenta
b. Marcajul se poate realiza cu o substanta radioactiva, deci reactia RIA
c. Marcajul se poate realiza enzimatic si avem tehnicile EIA
d. Marcajul se poate realiza cu o substanta extrasa din licurici= luciferina si avem tehnicile de
chemiluminiscenta.

1.Reactii serologice simple

Sunt de 2 catgorii:
a.Reactii de precipitare
b.Reactii de aglutinare

a.Reactii de precipitare
Atat Ag cat si Ac sunt solubile si la intalnirea Ag-Ac precipita, devin solide. Una dintre cele
mai folosite reactii de precipitare se numeste dubla imunodifuzie=DID. E o tehnica calitativa de
screening care identifica prezenta fie a Ag fie a Ac.
DID are nevoie de sistem martor.

Aflam Ag
Avem o placa de agar care are mai multe godeuri periferice si unul central. In cel central pun
Ac corespondent, intr-unul din godeurile periferice se pune Ag respectiv, martor. Ag difuzeaza catre Ac
sau invers, unde se intalnesc rezulta un arc de precipitare. Acesta este sistemul martor.
In celelalte godeuri periferice se pune produsul biologic in care vreau sa determin prezenta Ag
si sunt mai multe godeuri periferice pt ca pun mai multi pacienti, se face pt mai multi pacienti de o data.

1
Daca in dreptul godeului lui Popescu apare un arc de precipitare la fel ca cel martor inseamna ca Ag este
prezent.

Ex: vrem sa determinam Ag pneumococic in sputa: in godeul central pun Ac anti-pneumococ,

in cel periferic pun pneumococ, se face arcul de precipitare, si in alt godeu periferic pun sputa de la
pacient si daca apare arc de precipitare la fel ca cel martor inseamna ca e pneumococ.

Daca dubla-imuno-difuzie e pozitiva (+) trecem la o tehnica cantitativa si de confirmare care

este imunodifuzia radiala simpla= IDR.

Cum se face imunodifuzia radiala simpla=IDR?- vreau sa vad cat Ag e

Am o placa de agar in care Ac e turnat difuz in placa (Ac corespondent). In godeurile periferice
(sunt doar godeuri periferice) pun produsul biologic care a fost pozitiv (+) la dubla imunodifuzie (stiu
ca am Ag, dar vreau sa aflu cat Ag). Ag difuzeaza concentric catre Ac si se formeaza un cerc de
precipitare in jurul godeului. Difuziunea depinde de cantitatea de Ag, se masoara diametrul sau raza,
exista o scala la care ne raportam, atatia mm atatea mg.

Ca sa masor Ac, cum fac?

Se schimba sistemul martor. In godeul central am Ag, in cel periferic Ac martor, deci sistemul
martor se inverseaza. Si in IDR am turmat Ag.

b.Reactii de aglutinare
Inseamna Ag sau Ac fixat pe o particula, celalalt liber in solutie. La intalnirea Ag-Ac particulele
aglutineaza. Cea mai cunoscuta tehnica se numeste tehnica Latex. Care e o tehnica sensibila si se
foloseste in screening. Particulele de latex nu sunt vizibile cu ochiul liber si devin vizibile doar prin
aglutinare (se fac guguloaie). Se pot folosi fie pt detectia Ag fie a Ac.
Vreau sa determin Ac: particula de latex e invelita cu Ag, in momentul in care pun Ac de
determinare apare aglutinarea. Daca vreau sa determin Ag particula va fi invelita cu Ac.
Tehnica latex se poate efectua calitativ pe lama (aglutinare prezent-absent) si cantitativ in tuburi
in care se fac dilutii progresive din produsul biologic de testat. De ex: determina un anume Ag: latex e
invelit cu Ac pe suprafata si pun produsul biologic cu Ag. Daca apare aglunitare reactia e + , pun in
contratie nediluata 1/1; in a 2-a eprubeta il diluez la jumatate pun jumatate din cantitate, doar produsul
biologic il diluez, latexul ramane la fel; fac dilutii progresive pana cand nu mai apare aglutinare (1/1, ½,
¼...). Ultima dilutie care a determinat aglutinare este titrul substantei respective, deci reactia latex e
exprimata fie cu prezent absent fie 1/32, 1/64, adica e ultima din dilutii care a determinat aglutinare.
Unde se foloseste tehnica latex cel mai mult? In diagnosticul bacteriologic rapid pt detectia Ag
bacteriene sau a Ac anti-bacterieni. Dar cel mai frecvent pt Ag: particulele de latex sunt invelite cu Ac
anti-bacterieni, peste ele punem produsul biologic de testat si daca apare aglutinare inseamna ca bacteria
respectiva e prezenta
Ex: vine pacient cu infectie urinara. Trebuie sa ii incepem un tratament antibiotic si nu stim ce
bacterie e acolo si pana vine cultura dureaza mult si face in felul urmator: avem 3 lame: pe una latex
invelit cu Ac anti-haemophilus, pe a 2-a Ac invelit cu anti- E. coli, pe a 3-a Ac anti-clebsiela. Punem
pipi peste fiecare lama, pipi presupunem ca contine Ag bacterian, si unde apare aglutinare aia e bacteria.
Se poate face asta cu pipi, sputa, lichid articular.
Latexul e o metoda de screening (pot sa incep tratamentul antibiotic dar am nevoie si de
confirmare) si confirmarea se face prin cultura cu antibiograma.

A 2-a tehnica de aglutinare este testul Coombs care se foloseste in detectia Ac anti-eritrocitari
care distrug hematiile in anemiile hemolitice autoimune. Pt detectia acestor Ac se foloseste acest test
Coombs.

2
 Se foloseste ser anti gama globulina umana=SAG umana care este un Ac impotriva unui alt Ac.
Anticorpul in sine de fapt este Ag si serul SAG este indreptat impotriva Ac umani. SAG se obtine prin
injectarea imunoglobulinelor umane la alta specie (iepure, cal etc); specia respectiva recunoaste
imunoglobulinele umane ca non-self, ca Ag, si va fabrica impotriva lor Ac, deci Ac impotriva IgG, IgM
umane. Deci SAG este de 2 feluri: polispecific care e indreptat impotriva tutor celor 5 clase de Ig, sau
poate sa fie monospecific: anti-IgG, etc, sau pot sa-l fac si mai specific, doar anti lanturi k (usoare) sau
lambda.
Testul Coombs direct: identifica Ac fixati pe suprafata hematiilor.
Testul Coomb indirect determina Ac circulanti in serul apcientului.

Testul Coombs direct: se recolteaza hematii de la pacient, asta inseamna sange pe anticoagulant
urmat de centrifugare cu separarea hematiilor. Hematiile presupunem ca au pe suprafata Ac anti-
eritrocitari; deci hematiile pacientului se pun in contact cu SAG umana. Daca ele au Ac fixati pe
suprafata, Ac sunt recunoscuti ca Ag de SAG si apare aglutinarea. Daca aglutinarea este prezenta cu ser
polispecific (1-a etapa), SAG polispecific, se repeta reactia cu SAG monospecific (a 2-a etapa) pt ca
vreau sa stiu ce fel de Ac am acolo. A 3-a etapa: se fac dilutii progresive ca sa determinam titrul Ac.
Cum se fac dilutiile: in eprubete am SAG, se pastreaza in cantitate constanta, in prima eprubeta
pun toate hematiile pacientului, in a 2-a jumatate din hematii si tot asa.
A 4-a etapa este determinarea amplitudinii termice a Ac. Amplitudinea termica este temperatura
la care Ac anti-eritrocitari distrug hematia. Exista Ac anti-eritrocitari la cald care distrug hematia la
37°C, este T corpului, si Ac anti-eritrocitari la rece care distrug hematia la 22°C si la 4°C. Amplitudinea
termica are consecinte clinice pt ca daca ai Ac la cald distructia e continua pt ca e temperatura corpului,
daca ai Ac la rece distructia hematiilor apare numai cand te expui la frig, daca stai la caldura nu patesti
nimic, cat de frig depinde de amplitudine, daca sunt la 22°C sau 4°C. Dpdv al tratamentului difera pt ca
daca ai hemoliza la rece se incalzeste pacientul. Determinarea amplitudini termice se face lucrand in
triplicat (impart hematiile pacientului in 3): intr-o prima eprubeta incubarea cu SAG se face la
temperatura camerei (22°C), in a 2-a eprubeta incubarea se face la frigider (4°C) si in a 3-a se pune la
incubator (37°C). Si acolo unde apare aglutinarea aia sunt tipuri de Ac ce ii ai.
Deci testul Coombs direct are 4 etape:
1. Ser polispecific
2. Ser monospecific
3. Titru prin dilutii progresive
4. Amplitudine termica

Testul Coombs indirect: determina Ac circulanti in serul pacientului. Deci se recolteaza sange
fara anticoagulant, se separa serul si serul respectiv se pune in contact cu hematii test obtinute de la un
om sanatos cu acelasi grup sanguin si Rh cu pacientul testat. Daca exista Ac anti-eritrocitari in serul
pacientului acestia se fixeaza pe hematii. Deci prima etapa e sa incubez serul pacientului cu hematiile
test. Daca au existat Ac anti-eritrocitari s-au fixat pe hematiile test. Apoi se adauga SAG umana
polispecific si se continua cu etapele testului Coombs direct.

2.Reactii serologice complexe

Sunt tehnicile de imunofluorescenta, tehnica calitativa dar inalt specifica pt ca fluorescenta doar
o vezi, nu o masori. Se foloseste pt confirmare de diagnostic.
Fluorescenta este emisa de substante fluorocrome. Cea mai cunoscuta este fluoresceina care
emite fluorescenta verde. Un alt fluorocrom este rodamina care are fluorescenta rosie.
Cum se emite fluorescenta? Ca sa emita fluorescenta trebuie iradiere cu UV. Ca sa vezi
fluorescenta trebuie sa fie camp intunecat ca sa fie contrast. Fluorescenta se vede la un microscop
special care are lampa cu UV si camp intunecat. Fluorescenta e calitativa, o vezi sau nu o vezi, nu poti
sa o masori, dar e ff specifica, ff putine rezultate fals-pozitive.

3
a.Imunofluorescenta
Imunoflorescenta se face direct pt detectia Ag si indirect pt detectia Ac.

a.1.Imunofluorescenta directa
Produsul biologic in care vreau sa identific Ag se fixeaza pe o lama sub forma unui frotiu. Peste
el se adauga Ac corespondent marcar fluorescent. Urmeaza o etapa ff importanta: se spala, ca daca uit
sa spal vad oricum fluorescenta. Daca a existat Ag pe lama Ac fluorescent s-a fixat pe lama, daca nu a
existat Ag pe lama Ac se spala si se duce. Apoi ma uit la microscop si daca apare fluorescenta inseamna
ca a fost prezent Ag pe lama.
Se foloseste in:
-este diagnostic bacteriologic de certitudine pt microbii care nu cresc in culturi (clamidia,
mycoplasma)
-se folosesc pt caracterizarea antigenica a tumorilor= dg de certitudine; daca sunt prezente Ag
tumorale Ac anti-tumorali sigur se fixeaza si ai diagnostic de certitudine
O varianta a imunofluorescentei directe pt Ag tumorale si nu numai, poarta numele de
imunohistochimie in care pe langa detectia Ag vedem si distributia lor tisulara, adica deasupra sau sub
membrana bazala, in jurul fibrei musculare, deci vedem unde anume sunt Ag intr-un tesut, adica
distributia lor tisulara. Singura diferenta este pt ca imunohistochimie nu am frotiu ci am o sectiune de
tesut, presupusa contine Ag respective, deci pe lama e o sectiune de tesut. Peste sectiunea de tesut pun
Ac fluorescenti, daca exista Ag in tesutul respectiv Ac se fixeaza pe lama, spal si ma uit la microscop.
Si nu vad doar prezenta lor pe lama ci vad si unde sunt in functie de structura tesutului (langa vase etc).

a.2.Imunofluorescenta indirecta
Identifica Ac prin ceea ce se numeste tehnica sandwich. Si anume: Ac de determinare (pe care
vreau sa il determin) se pune in contact cu un Ag cunoscut fixat pe lama. Pe lama pun Ag cunoscut, al
meu de laborator. Peste lama pun produsul biologic in care vreau sa vad daca exista sau nu Ac. Las sa
se incubeze, deci daca exista Ac se fixeaza pe lama, de Ag corespondent. Spal. Daca nu a existat Ac s-
a dus tot. Adaug apoi SAG umana marcat fluorescent si iarasi las sa se incubeze. Daca a fost Ac acesta
se leaga si el de lama si apoi spal si ma uit la microscop si daca apare fluorescenta inseamna ca au fost
prezenti Ac.
Tehnica calitativa si specifica.
SAG se fixeaza de o imunoglobulina, adica de un Ac. Ac de determinat este prins intre un Ag
cunoscut si SAG→ tehnica sandwich.
2 etape de spalare:
-spal Ag cu produsul biologic de testat, in care vreau sa vad daca am sau nu Ac
-adaug SAG, las sa se incubeze, apoi iar spal

b.Tehnicile RIA
Sunt tehnici specifice si cantitative pt ca radioactivitatea se masoara cu contorul Geiger. RIA se
face competitiv pt Ag si necompetitiv pt Ac.

b.1.Tehnica competitiva pt Ag
Doreste sa identifice Ag, sa il masoare. Ag de determinat se pune in contact cu Ag cunoscut si
identic marcat radioactiv si cu Ac cunoscut corespondent impotriva Ag. Se formeaza 2 tipuri de
complexe imune: intre Ag de determinat si Ac si intre Ag radioactiv si Ac. Intre cele 2 Ag exista
competitie pt legarea Ac.
Se masoara radioactivitatea amestecului. Daca Ag de determinat nu e deloc radioactivitatea
amestecului o sa fie 100%. Pe masura ce creste cantitatea de Ag de determinat disloca Ag radioactiv si
radioactivitatea o sa scada logaritmic in functie de canitatea de Ag de determinat. Pe masura ce creste
cantitatea de Ag de determinat scade cantitatea de Ag radioactiv pana la 50%.

4
 Radioactivitatea scade proportional cu cantitatea de Ag de determiant. Deci cu cat e mai mult
Ag de determinat cu atat e mai mica radioactivitatea pt ca l-a impins afara din reactie pe cel radioactiv.

b.2.Tehnica necompetitiva pt Ac
Identifica Ac prin metoda sandwich, adica Ag cunoscut, produs biologic de testat. Daca exista
Ac s-au legat de Ag, spal. Adaug apoi SAG, doar ca SAG este marcat radioactiv si iar spal si masor
radioactivitatea care de data aceasta este direct proportionala cu cantitatea de Ac de determinat. Deci cu
cat e mai mult Ac cu atat se fixeaza pe el mai mult SAG radioactiv. In urma spalarii se indeparteaza tot
ce nu s-a fixat. Daca nu a existat Ac se indeparteaza 100% si cu cat a existat mai mult Ac cu atat se
fixeaza de Ac si ai mai multa radioactivitate.

Exercitiu: Vrem sa determinam prin RIA competitiv Ag pisica. Am praful dintr-o incapere in care vreau
sa vad daca am Ag pisica. Praful il pun in contact cu Ag pisica marcat radioactiv si cu Ac anti-pisica.
Masor radioactivitatea. Daca radioactivitatea e de 100% inseamna ca in praful respectiv nu e Ag pisica,
daca radioactivitatea este de 50% inseamna ca e ff mult Ag pisica (valorile se calculeaza in functie de
scala de transformare numita scala de readioactivitate).

Exercitiu: Vreau sa determin Ac IgE specifici pt acarieni, deci am serul pacientului si vreau sa vad daca
are IgE specifici pt acarieni. Pe lama am acarieni, peste ea pun serul pacientului si las sa se incubeze.
Daca am IgE specifi pt acarieni se leaga de acarienii de pe lama, spal apoi. Daca nu am avut Ac IgE nu
am nimic. Dupa care adaug SAG umana marcat radioactiv, iar spal. Daca radioactivitatea e de 0%
inseamna ca nu exista IgE specifici.

Tehnicile RIA au 2 dezavantaje: necesita echipament special de protectie si reactivii folositi sunt
foarte perisabili, au durata de viata ff scurta. Deci tehnicile RIA au fost inlocuite cu tehnicile EIA

c.Tehnicile EIA= enzyme imuno-essay

Se fac identic cu RIA: competitiv pt Ag, necompetitiv pt Ac, doar ca marcajul se face enzimatic
si nu vad enzima si necesita o etapa suplimentara in care se adauga substratul enzimei si se obtine o
reactie de culoare care se citeste la spectofotometru.
Deci e o tehnica cantitativa si specifica. Tehnicile EIA au dezavantajul ca sunt foarte laborioase,
necesita cel putin 72h. Tind sa fie inlocuite de tehnicile de chemiluminiscenta

d.Tehnicile de chemiluminiscenta
Sunt identice, competitiv pt Ag si necompetitiv pt Ac, doar ca marcajul se face cu luciferina si
emisia de lumina se masoara cu luminometrul. Deci e o tehnica cantitativa si nu necesita etapa
suplimentara pt ca masor direct emisia de lumina.