Laboratorio de Bioquímica 2018-II

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN MANZANA -ROJA Y VERDE-,

DEBIDO AL PARDAMIENTO SOBRE COMPUESTOS POLIFENOLICOS
CONTROL OF ACTIVITY ENZYMATIC IN APPLE-RED AND GREEN-, DUE TO THE
PARTITION ON POLYPHENOLIC COMPOUNDS

Juan Esteban Serna Osuna. jesernao@uqvirtual.edu.co cc 1098311031.

Universidad del Quindío, Facultad de Ciencias Básicas y Tecnológicas.
Programa de Química, Bioquímica.
Docente: Clara María Mejía Doria, Qca, M, Sc.

RESUMEN

Las enzimas son catalizadores muy específicos y selectivos. Son de origen biológico y han
ido evolucionando a través de los siglos para cumplir mejor las necesidades fisiológicas de
los seres vivos. El objetivo de la práctica fue comprender e identificar los mecanismos y las
condiciones que retardan o activan el pardeamiento enzimática en la manzana roja y verde.
Primero se extrajeron 20 mL de manzana y se dividió en partes iguales a un vaso de
precipitados y en una caja de Petri, seguido se emplearon los reactivos; Hidróxido de sodio
(0.1 N), Acido clorhídrico (0.1 N), Ácido acético 1%, cloruro de sodio 1% y materia
orgánica (limón, naranja), para conocer el efecto del pH. También se realizaron pruebas
para determinar el efecto que ejerce la temperatura, situando 5 mL de Zumo de manzana
en cada tubo (A, B, C, D) sumergidos en baño María en condiciones respectivas de
temperatura (10, 40,100, 24) oC. Así, se logró conocer el comportamiento de pardeamiento
debido principalmente a las polifenoloxidasas presentes en la manzana.

PALABRAS CLAVE: Enzimas, mecanismos, pardeamiento, baño María.

ABSTRACT

Enzymes are very specific and selective catalysts. They are of biological origin and have
evolved over the centuries to better meet the physiological needs of living beings. The
objective of the practice was to understand and identify the mechanisms and conditions that
retard or activate the enzymatic browning in the red and green apple. The first 20 ml of apple
were extracted and divided equally in a beaker and in a Petri dish, followed by the reagents;
Sodium hydroxide (0.1 N), hydrochloric acid (0.1 N), acetic acid 1%, sodium chloride 1%
and organic matter (lemon, orange), to know the effect of pH. Tests were also carried out to
determine the effect of temperature, placing 5 ml of apple juice in each tube (A, B, C, D)
immersed in a water bath under respective temperature conditions (10, 40, 100, 24)oC Thus,
it was possible to know the browning behavior mainly due to the polyphenoloxidases present
in the apple.

KEY WORDS: Enzymes, mechanisms, browning, bath Maria.

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1. INTRODUCCIÓN
La historia de las enzimas está
estrechamente conectada con el gran
aumento del conocimiento en el campo de
la química y de la tecnología de alimentos;
se señala que fue estas dos disciplinas que
la actividad catalizadora de las enzimas
fue observada por primera vez [1]
Las enzimas son polímeros biológicos que
catalizan las reacciones químicas que
hacen posible la vida tal como la
conocemos. La presencia y el
mantenimiento de un conjunto completo y
equilibrado de enzimas son esenciales para
la desintegración de nutrientes afín de que
proporcionen energía y bloques de
construcción químicos; el montaje de esos
bloques de construcción hacia proteínas,
DNA, membranas, células y tejidos, y la
utilización de energía para impulsar la
motilidad celular, la función neural y la
contracción muscular. Con la excepción de
las moléculas de RNA catalíticas, o
ribosomas, las enzimas son proteínas. La
capacidad para valorar la actividad de
enzimas específicas en la sangre, otros
líquidos hísticos, o extractos celulares,
ayuda en el diagnóstico y el pronóstico de
enfermedad [2].
Diversas investigaciones han relacionado
la actividad de la fracción
citoplasmática(soluble de
polifenoloxidasa (EC 1.14.18.1 PFO) y
peroxidasa(EC 1.11.1.7, POD) con el
deterioro del color , sabor, textura y valor
nutricional de vegetales frescos y
procesados , ya que justamente esta
fracción es la que entra más fácilmente en
contacto con los sustratos propios de las
células[3].Se sabe que las enzimas PFO y
POD extraídas de diferentes tejidos
vegetales pueden ser inactivadas por
tratamientos térmico[4] y por ciertos
compuestos químicos usados en la
industria de alimentos como cloruro de
sodio , sulfitos , ácido ascórbico, sacarosa
, EDTA y Acido benzoico [5].
La práctica se planteó con el objetivo de
conocer las condiciones que activan o
inhiben el pardeamiento enzimático (PFO
en la manzana, siendo un tema de gran
importancia en la industria alimenticia.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Para el desarrollo de esta práctica los
materiales fueron facilitados por el
almacén de materiales del Programa de
Química de la Universidad del Quindío.
Los materiales orgánicos fueron
comprados en un Mercado de frutas.
Para la solubilidad se empleó aceite de
oliva comercial.
Pruebas para reconocimiento del
pardeamiento enzimático:
2.1 Pardeamiento enzimático
Se pelaron dos manzanas verdes, para
retirarles el corazón. Seguido se licuaron
en aproximadamente 80 mL de agua.
Luego se extrajo en zumo con un lienzo.
Se transfirieron de a 10 mL en un vaso de
precipitado y en una caja de Petri. Se
dejaron a temperatura ambiente durante 15
min y se observaron los cambios.
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2.2 Efecto de la temperatura oxígeno. Esta enzima puede catalizar la

oxidación de los O-difenoles para
Se colocaron 5 mL de zumo de naranja en formar O-quinonas[7]
cada uno de los tubos de ensayo con
diferentes condiciones de temperatura,
durante 15 minutos aproximadamente. El
tubo marcado con la A, se colocó en baño
de agua fría (10 oC). se colocaron en baño
maría los tubos B (40 oC) y C (100 oC). el
tubo D a temperatura ambiente. Se
compararon los grados de pardeamiento
Fig. 1. Mecanismo del pardeamiento
2.3 Efecto del pH enzimático por una polifenoloxidasa.

Se tomaron 6 tubos de ensayo en los cuales La rápida polimerización de las O-

se rotularon y se les adiciono las siguientes quinonas produce pigmentos de color
sustancias; en el A-Zumo de Limón-, B - negro, marrón o rojo, lo que a su vez es la
Zumo de naranja-, C-Agua destilada-, D- causa del pardeamiento enzimático. [8]
NaOH 0,1N-, E-HCl 0,1N-, F-Vinagre-,
G-NaCl al 1%-. Se determinó con papel A continuación, se revela en resultado
indicador el pH de cada solución y de la según el procedimiento de la sección 2.1
manzana, seguido se adicionaron
pequeños trozos de manzana. Esperamos 1
hora y registramos los grados de
pardeamiento.
.

3. RESULTADOS Y ANÁLISIS

3.1 Determinación del pardeamiento

enzimático. Fig.2 Solución caja de Petri(izquierda ) y
vaso de precipitado (derecha).
El pardeamiento enzimático es una
reacción de oxidación en la que interviene Al trascurrir los 15 min, transferimos de la
como substrato el oxígeno molecular, caja de Petri y del vaso de precipitados a
catalizada por un tipo de enzimas que se tubos de ensayo, para observar mejor.
puede encontrar en prácticamente todos
los seres vivos. El enzima responsable del
pardeamiento enzimático recibe el nombre
de polifenoloxidasa [6].

La polifenoloxidasa (PPO, conocida

también como monofenol
monooxigenasa) es una enzima
tetraédrica que contiene cuatro átomos de
cobre por molécula, y posee sitios de Fig 3. Solución caja de Petri(izquierda ) y
unión para compuestos aromáticos y vaso de precipitado (derecha).
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Por tanto, las enzimas suelen estar
inmovilizadas en interfaces en la célula,
con sus membranas y orgánulos.
Entonces los sustratos de la manzana han
de alcanzarlas para ser transformados. Al
licuar ocasiona daños mecánicos que
rompen estas interfaces celulares y va
acompañada de la liberación de
polifenololoxidasa (PFO), que se
combina luego con el oxígeno y los
fenoles para causar la reacción de
pardeamiento enzimático [9].
Es decir que la caja de Petri sufre más
pardeamiento al tener mayor superficie de
contacto con el oxígeno, aunque en
ambos es evidente según la fig. 3. Por
tanto, Los compartimentos en donde se
encuentran las enzimas hace que estas se
encuentres eficazmente separadas de sus
sustratos.
Entonces para el mantenimiento o la
destrucción de la integridad de la
localización de las enzimas, es importante
mantener la integridad del tejido vegetal,
la perdida de algunos pigmentos y la
ganancia en otros, la acumulación de
azucares, el ablandamiento y la
biosíntesis de los componentes del aroma,
deben ocurrir de un modo que requiere la
integridad bioquímica del alimento.
1 mecanico , etc.), que produce un cambio en su
Reacción sufrida por las proteínas al cambiar su
entorno ( calor,pH, concentracion de sales , esfuerzo
3.2 Determinación del efecto de la
temperatura
Las enzimas son catalizadores complejos,
constituidas por proteínas globulares, que
a temperaturas en torno a 30-40 oC,
presentan su actividad óptima; acelerando
las reacciones químicas por un factor de
1012 a 1020 respecto a las reacciones no
catalizadas y por encima de 45 oC
comienzan a desnaturalizarse1.Los
procesos enzimáticos en la preparación y
conservación de los alimentos son
controlados en la mayor parte de los casos
por la temperatura.
Lo resultados se enseñan en la siguiente
figura;
Fig. 4. efecto de la temperatura en el
pardeamiento enzimático
La importancia del control de
pardeamiento es debido a que tienen en
algunos casos consecuencias negativas
sobre el aroma, color textura o valor
nutricional, son bien frenados color
temperaturas bajas o bien eliminadas por
inactivación térmica de los enzimas
responsables.
estructura secundaria , terciario y cuaternaria (#)
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Entonces la estabilidad de los enzimas a
las altas temperaturas es muy diversa,
algunos pierden su actividad catalítica a
temperatura relativamente bajas, otros
soportan durante corto periodo de tiempo
un alto tratamiento termiónico[10].Desde
el punto de vita termodinámico la
ecuación fundamental para explicar la
desnaturalización es
∆G = ∆H – T * ∆S
Donde:
∆G es el cambio en la energía libre de Gibbs. ∆H
cambio de entalpia ; + Endotérmico (Absorbe
Calor) , - Exotérmico (libera Calor).,∆S cambio
en la entropía ,T temperatura en grados Kelvin.
Según la sección 2.1, el análisis para el
tubo:
A. Temperatura baja
I. Las bajas energías de activación
de las reacciones enzimáticas
indican que una reducción de la
temperatura tiene relativamente
poco efecto sobre las velocidades
de reacción. En consecuencia, las
enzimas pueden ser bastante
activas incluso a temperaturas de
congelación y resultar, por ello,
importantes estimulantes de las
reacciones degradativas en los
alimentos refrigerados o
congelados.
II. La principal razón por la que los
alimentos de exponen a bajas
temperaturas, es evitar el
crecimiento microbiano
manteniendo en lo posible los
atributos de calidad del alimento.
Debido a que muchas enzimas no
se ven afectadas en mayor grado.
Por lo tanto, ni ocurrió
desnaturalización, ni tampoco se
inactivo la enzima por medio de la
congelación, entonces la actividad de
pardeamiento continuo.
D. Temperatura Ambiente
III. La velocidad del complejo enzima
sustrato es de esperar que se
encuentre controlada por la
difusión.
IV. La magniud de ∆H supera la de –
T*∆S, dando lugar a un calor
positivo para ∆G y a que las
condiciones sean desfavorables
para la desnaturalización
Por lo tanto, a temperatura ambiente
la enzima es cercana a la temperatura
opima a la cual trabaja la enzima. El
pardeamiento es evidente.
Para B y C. Temperatura Elevada
V. A temperaturas elevadas ∆S para
la desnaturalización es
suficientemente grande para que
el valor absoluto –T*∆S sea
mayor que el valor absoluto de
∆H, haciendo a ∆G negativo y la
desnaturalización favorable.
VI. Las temperaturas elevadas pueden
afectar el estado de disociación de
los grupos funcionales en la
reacción enzimática, a la afinidad
de la enzima por activadores o
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inhibidores2 y a otras cuestiones II. la actividad catalítica depende de

secundarias, como a la solubilidad que los grupos prototropos del
del oxígeno , que puede ser uno de centro activo se encuentren en una
los sustratos de la reacción. situación de carga determinada.

Por lo tanto, para C y D. ocurrieron III. Los Ph Extremos suelen inactivar

Grandes cambios espaciales por los a las enzimas. por lo general las
cuales las cadenas laterales de los enzimas presentan una máxima
aminoácidos ganan una libertad de actividad a un valor determinado
movimientos que no tenían en el de pH, que se denomina pH
estado nativo. Por lo tanto, la óptimo.
desnaturalización fu acompañada de
un aumento significativo en entropía Por ejemplo el comportamiento de la
(+∆S) . El cambio en entalpia durante pepsina y la glucosa 6- fosfatasa :
el proceso también será grande y
positivo, puesto que la enzima debe
absorber calor para romper los
numerosos enlaces electrostáticos y
puentes de hidrogeno que estabilizan
la estructura nativa y hace evitar el
pardeamiento.

Nota: La peroxidasa sirve como

indicador de la inactivación de todas las
demás, porque es el último que cesa su
actividad por calentamiento.

3.3 determinación del efecto del pH

Cada enzima es activo catalíticamente

solo en un intervalo restringido de pH,
comprendido normalmente entre 5,5 y
7,5. Debido a dos causas [11]

I. modificaciones de la estructura
proteica, hasta la
desnaturalización irreversible.

2
Inhibidor, compuestos que reduce la velocidad de la
catálisis, activador, aquellos que ejercen el efecto
contrario.
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Los resultados del laboratorio se enseñan sustrato, modificando la constante de

en la siguiente figura. equilibrio de la reacción enzimática,
retirando un inhibidor de la reacción,
desplazando un ion metálico ineficaz
del centro activo o sustrato,
desplazando el equilibrio.

Al sacar los trozos de mañana en

solución, estos fueron los resultados

Fig. 5. Soluciones según la descripción

2.3, efecto del pH en el pardeamiento.

A continuación, se enseñan el pH de cada

reactivo empleado.

Tubo de Antes de la Después de

Ensayo Adición la adicion
A 3 4 Fig.6. trozos de manzana después de 1
B 4 4.5 hora en soluciones de A-H.
C 5.5 5
D 11 10 De acuerdo a la literatura, encontramos;
E 1 1
F 3 3.5 ACTIVIDAD DE AGUA (aw)
G 5 4
Tab.1 pH antes y después de la El agua libre sirve como vehiculó de los
disolución con la manzana procesos enzimáticos Muchas
características de las actividades
Algunas enzimas requieren para su enzimáticas en los sistemas congelados se
actividad ciertos iones, mientras que otras dan también en los alimentos
son particularmente afectadas por estos deshidratados, en los que la actividad de
(Hg2+, Pb2+, Ag+), dependiendo de la agua se encuentra restringida.
enzima que se trate. También depende de
la concentración. Los aniones tienden a INTERACCIÓN IONICA
ser inespecíficos, mientras que con La concentración salina afecta de distinto
frecuencia las enzimas emplean modo la solubilidad de los demás
cationes(Na+,K+,Mg2+,Zn2+,H+ ....)[1] componentes, lo que puede determinar
Los iones pueden activar las enzimas que la concentración de un sustrato dado
por mecanismos como: aumente o disminuya.

Llegando a ser parte del centro activo,

formando enlaces entre la enzima y el
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ESTABILIDAD
Al someter las enzimas al salzonado estas
pueden ser inactivadas por las
concentraciones de electrolitos y su
cantidad depende del ion. Estos efectos
son específicos y difieren dependiendo de
la enzima. [12]
ANALISIS
A,B Un aumento en la viscosidad del
medio impide crecientemente la difusión
del sustrato.
A, B, E, como por lo general las enzimas
presentan una máxima actividad a un
valor de pH óptimo. Entones ese pH, en
solución no es el ideal para que trabaje la
enzima, según la tabla 1. Esta muy acido,
por esa razón en G se evidencia un grado
mayor de pardeamiento, al estar más
cerca del pH optimo
La concentración de electrolitos en G
inactiva el pardeamiento. Esto se debe a
una fuerte preferencia electrolítica para
ligarse a la enzima
La solución de D y F. no impiden el
pardeamiento, de cierta manera
Por lo tanto, la actividad catalítica de una
enzima viene influida, nos solo por la
concentración de sustrato, sino también
por el tipo y la concentración de
efectores. Cuando un sustrato es
disociable, la influencia del pH en su
ionización puede ser además un factor
importante en la velocidad de la reacción.
Para C , El agua formo en torno a las
moléculas apolares adyacentes , así las
diversas entidades apolares pierden su
capacidad de interaccionar unas con otras.
Las actividades de las enzimas no
hidrolíticas se ven influenciadas por el
aw,como ya se comprobó de las
polifenoloxidasa, el agua sirve como
medio para la reacción y como vehículo
para el sustrato . cuando el agua se
encuentra fuertemente ligada, la
oxidación enzimática se enlentece o
resulta imposible [13]
CONCLUSIONES
I. la reacción enzimática puede
utilizar enzimas para llevar a cabo
funciones deseadas de tratamiento
análisis y para facilitar la
conversión de materias primas en
alimentos de mayor calidad y más
apetecibles
II. Para la catálisis será consecuencia
de la dependencia de V y Km
respecto a pH. En general la
existencia de cargas contrapuestas
conduce a un enriquecimiento en
sustrato procedente de la solución
y por tanto a un valor aparente de
Km más bajo
III. uno de los fines del tratamiento
térmico es desnaturalizar e
inactivar las enzimas, de tal modo
que los alimentos no se
encuentren sujetos a su continua
actividad. Entonces los procesos
enzimáticos en la preparación y
conservación de los alimentos son
controlados en la mayor parte de
los casos por la temperatura.
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IV. La velocidad de la mayor parte de enzimas/tirosinasa.html. Tomado el

las transformaciones se reduce 21/02/2019
con la disminución de la actividad
[7] tomado de
de agua. Puesto que garantiza la
https://www.pinterest.at/pin/5255138502
difusión del sustrato hasta la 51706273/?autologin=true . Accessed
enzima. 19/02/2019

V. El pH puede ser controlado para [8] Worthington Enzyme Manual

evitar, inhibir o potencializar al http://www.worthington-
máximo una reacción enzimática. biochem.com/TY/default.html,
Polyphenol Oxidase -. Accessed
19/02/2019

VI. A concentraciones altas todos los [9] Eskin N.A.M.,H.M. Henderson , And
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