Recibido 15/06/2016, Aceptado 14/19/2016, Disponible online 31/12/2016

Identificación de factores microbiológicos asociados al deterioro de jugo

(naranja-mandarina) mínimamente procesado para su bioconservación.

Victor Clavijo-Romero1, Duvan Ortiz C2. Johanna A. Serna-Jiménez3*

1-2 Universidad
la Gran Colombia seccional Armenia, Campus Santa María del Saber, Km. 7 vía
Armenia - La Tebaida, Quindío. Colombia. Estudiante programa de Ingeniería Agroindustrial.
3 Docente programa de Ingeniería Agroindustrial.

*sernajimjohanna@miugca.edu.co

Resumen

Una de las tendencias de alimentos, es la de mínimamente procesados, tendencia que

atiende la necesidad de consumidores que quieren ingerir productos con el menor nivel
de transformación acompañado, de poca intervención industrial, sin adición de
sustancias químicas. Es así como en esta investigación se planteó identificar factores
microbiológicos alterantes en jugo de naranja (sweety-valencia) y mandarina
(arrayana) para su bioconservación. Para esto, se realizó caracterización fisicoquímica
y microbiológica en jugos almacenados a 3 temperaturas diferentes (refrigeración-
abuso) por 120 horas. Las variables a medir fueron: sólidos solubles (°Brix), potencial
de hidrogeno (pH) y porcentaje de acidez para las fisicoquímicas; en las
microbiológicas, se realizó conteo y aislamiento de mesófilos-aerobios, psicrófilos-
aerobios, bacterias ácido-lácticas, mohos-levaduras; así como la caracterización
macro-microscópica de los microrganismos presentes en el jugo, estos, se organizaron
en grupos asociados con el deterioro y llevados a identificación molecular. Para la
bioconservación; se utilizó extracto etanólico de hojas de naranja y moringa, aceite
esencial de naranja, bacteriocinas de bacterias ácido-lácticas y como control benzoato
de sodio y oxitetraciclina contra microorganismos patógenos y alterantes Escherichia
coli, Salmonella spp. Saccharomyces cerevisiae y dos de las levaduras alterantes
aisladas; los ensayos de reto se realizaron por la técnica de pozos y ciclos log
reducidos, retando con población inicial de 108 UFC/mL, dos concentraciones de
extractos (50 y 25% v/v). Los resultados fisicoquímicos arrojaron un aumento de
acidez, una disminución de pH y °Brix, el aislamiento y la identificación molecular arrojó
que los microorganismos comunes en los jugos evaluados eran Rhodotorula sp y
Pichia sp. Los resultados de pozos lograron evidenciar capacidad inhibitoria para
S.cerevisiae, Rhodotorula y Pichia retadas con extractos (Naranja - Moringa) y
bacteriocinas. En cuanto a los ciclos reducidos se alcanzaron 7 ciclos-log para estos
microorganismos. Estos resultados permiten encontrar bioconservantes de recursos
orgánicos mitigando la alteración de productos mínimamente procesados.

Vol 24, No 39 (2016), Revista Alimentos Hoy -156

Palabras clave: Microorganismos, Fisicoquímicas, Extracto etanólicos, inhibición,
Temperaturas de abuso.

Abstract

One of the food trends is that of product minimally processed, a trend that addresses
the need for consumers who want to consume products with the lowest level of
transformation accompanied by little industrial action, without adding chemicals; Thus,
the objective of this research was to identify microbiological spoilage factors that can
alter the orange juice (sweety-valence) and tangerine (arrayana) during their
bioconservation. For this purpose a physicochemical and microbiological
characterization was performed in juices stored at 3 different temperatures (cooling-
abuse) for 120 hours. Variables measured were: soluble solids (Brix), hydrogen
potential (pH) and percentage of acidity for physicochemical characteristics; in
microbiological characteristics: counting and isolation of mesophilic-aerobic,
psychrophilic-aerobic, lactic acid bacteria, mold-yeast; as well as the macro-
microscopic characterization of the microorganisms present in the juice. These were
organized in groups associated with the deterioration and taken to molecular
identification. For bioconservation it was used ethanolic extract of orange and moringa
leaves, orange essential oil, bacteriocins of lactic acid bacteria as sodium benzoate
and oxytetracycline control against pathogens and spoilage microorganisms
Escherichia coli, Salmonella spp. Saccharomyces cerevisiae and spoilage yeasts
isolated; assays were performed by first technique wells and calculating reduced to an
initial population of 108 UFC/ mL with two concentrations of extracts log cycles 50 and
25% v/v. Physicochemical results showed increased acidity, decreased pH and Brix.
Isolation and molecular identification showed that the common organisms in the juices
were Rhodotorula sp and Pichia sp. The results achieved demonstrated the inhibitory
wells capacity for S. cerevisiae, Rhodotorula and Pichia challenged with extracts of
Orange - Moringa and bacteriocins. In terms of the reduced cycle-log it was reached 7
cycles for these microorganisms. These results allow to find biopreservatives from
organic sources which can mitigate the changes of foods minimally processed.

Keywords: Microorganisms, Physicochemical, ethanolic extract, inhibition,

temperatures abuse.

I. Introducción procesados. Un gran cambio en los

Una de las tendencias en la
industria alimentaria en los últimos
años, es el consumo de alimentos
saludables y mínimamente
patrones de consumo viene ocurriendo
en la sociedad, en respuesta a la
demanda del mercado. Los
consumidores piden productos de alta
calidad, frescos y con ingredientes

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naturales (Sanjinez-Argandoña, 2010),
que conserven sus propiedades
organolépticas y nutricionales. Sin
embargo, dentro de este target la
industria alimentaria debe procurar que
los productos se deterioren lo menos
posible con buenas prácticas de
manufactura y sistemas que controlen
la presencia de microorganismos
(mesófilos, levaduras y mohos) que
alteren las propiedades fisicoquímicas y
sensoriales (Villena, 1995).
Como factor adicional, dentro de
la postproducción y periodos de
almacenamiento hasta consumo final
las temperaturas de abuso juegan un
papel importante en las que los
microorganismos se reproducen
rápidamente, deteriorando y alterando
el producto, teniendo en cuenta que a
medida que se incrementa la
temperatura; las reacciones químicas y
enzimáticas de la célula son más
rápidas y el crecimiento se acelera
volviéndose oportunistas los
microorganismos presentes (Madigan,
Martinko, & Parker, 2004).
Tratando de mitigar dichos
factores, la industria biotecnológica y
microbiológica ha encontrado nuevos
agentes antimicrobianos de origen
natural, como sustitutos de los
tradicionalmente utilizados (Nychas,
2003), bacteriocinas, extractos
etanólicos o aceites esenciales de
plantas, así como el uso de
antioxidantes y antimicrobianos se
convierten en alternativas naturales
para la prevención y control de la
microflora alterante (Sauceda, 2011). El
uso de bioconservantes se utilizan
actualmente para evitar y prevenir el
crecimiento de bacterias como,
Saccharomyces cerevisiae, Candida
stellata, Zygosaccharomyces rouxii
(Deak, 1993).
Dentro la bioconservación, las
bacteriocinas más comunes utilizadas
son las bacterias acido lácticas (BAL),
que también pueden inhibir el
crecimiento de mohos y levaduras, al
igual que producir otras sustancias tales
como ácidos orgánicos, peróxido,
bacteriocinas y otros ácidos con
actividad antifúngica (Delavenne, y
otros, 2013). Estudios bacteriológicos
demostraron la actividad antimicrobiana
de los extractos de moringa, los cuales
floculan bacterias Gram positivas y
Gram negativas del mismo modo que lo
hacen con los coloides del agua; su
acción bacteriostática consiste en la
disrupción de la membrana celular por
inhibición de enzimas esenciales (M.
Suarez, 2003).
De igual manera muchas
investigaciones han demostrado el
poder antimicrobiano de los aceites
esenciales, especialmente los extraídos
de frutas cítricas, principalmente de
mandarina, naranja y toronja frente a
cepas bacterianas de: Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Pseudomonas aeruginosa y
Salmonella (Roger Dabbah, 1970).
Con base en lo anterior en aras
de buscar nuevas alternativas de
compuestos de origen natural que
fortalezcan la inhibición de los
microorganismos presentes en el
deterioro de un jugo mínimamente
Vol 24, No 39 (2016), Revista Alimentos Hoy -158
procesado, se propuso por medio de
este proyecto de investigación
identificar los factores microbiológicos
que alteran la calidad de la mezcla de
jugos cítricos frescos extraídos de
naranja sweety, valencia y mandarina
arrayana con el fin de desarrollar
procesos de bioconservación.
II. Materiales y métodos
Estandarización del jugo
Para la estandarización del jugo
fueron utilizadas variedades de Naranja
Valencia, Naranja Sweety y Mandarina
Arrayana, atendiendo a las pérdidas en
postproducción generadas por la
flexibilidad de precios en el mercado de
algunos productores de cítricos del
Quindío.
Se realizó la desinfección con
una solución de hipoclorito de sodio
(NaClO) a 200 partes por millón (ppm)
para los utensilios que fueron utilizados
como lo establece la Guía Técnica
Colombiana de limpieza y desinfección
para plantas de alimentos (GTC) 85,
mientras que, para las diferentes
variedades utilizadas en la elaboración
del jugo fueron, lavadas y desinfectadas
con una solución de Citrosan Diken
International (3 mL/L) sumergiendo las
muestras durante 5 minutos siguiendo
las recomendaciones de etiqueta.
Para la elaboración del jugo se
seleccionaron naranjas en un estado de
maduración entre 3 y 4 como lo
establece la Norma Técnica
Colombiana (NTC) 4086 para la
variedad Valencia, mientras que para la
variedad Sweety y la mandarina
Arrayana no se encontró tabla de color,
se tomó como parámetro un índice de
color inicial (IC) > 6 como color
comercial para cítricos (Salvador,
2013).
Las naranjas fueron cortadas por
su parte ecuatorial y se exprimieron con
un exprimidor de cítricos (Oster 4100);
a la mandarina se le retiró la cáscara
obteniendo los gajos a los cuales se le
extrajo el jugo usando un lienzo
previamente lavado y desinfectado el
cual sirvió como filtro para el jugo de las
otras dos variedades.
Posteriormente, se realizó la mezcla de
las 3 variedades para la obtención del
jugo con variables respuesta como:
Solidos solubles totales (°Brix) según
norma NTC 4086 (Icontec, 1997) y
Acidez titulable norma NTC 4086
(Icontec, 1997).
Deterioro y alteración
Se preparó el jugo, tomándose
alícuotas de 200 mL en frascos estériles
para su posterior incubación en
refrigeración a 5±2 °C (temperatura
control), a 20 °C como temperatura de
abuso de refrigeración y a 30 °C como
temperatura de deterioro. Cada 24
horas se tomaron muestras de 1mL, las
cuales fueron llevadas a diluciones
seriadas en agua peptona estéril y
sembradas en medio Plate Count Agar
(PCA) (MERCK, Alemania) y Agar Man
Rogosa Sharpe (MRS) (Scharlau,
España) las cajas se llevaron a
incubación a 30 °C (PCA) y 37 °C Agar
MRS; se incubaron por 48 horas y
posterior a esto se hizo el conteo en
placa.
Vol 24, No 39 (2016), Revista Alimentos Hoy -159

Pruebas físico-químicas
Cada 24 horas se realizó una
toma de muestra para medir sólidos
solubles (°Brix) utilizando un
refractómetro (ATAGO, Estados
Unidos, Pocket), acidez titulable con
hidróxido de sodio NaOH al 0,1% y
potencial de hidrogeno (pH) con el
potenciómetro (Jenway – USA). Todas
las pruebas se realizaron por triplicado.
Pruebas Microbiológicas
Se tomaron muestras
microbiológicas de 1mL las cuales se
diluyeron en 9mL de agua peptona
(MERCK, Alemania) al 0,1%, para
luego ser sembradas en medio (PCA)
(MERCK, Alemania) y Agar Man
Rogosa Sharpe (MRS) (Scharlau,
España). Seguidamente las cajas
fueron llevadas a incubación según el
medio de cultivo, para (PCA) a 30 °C y
para MRS a 37° C por un período total
de 48 horas, la incubación se desarrolló
en incubadoras (BINDER - Alemania) y
posteriormente se hizo el conteo en
placa para el cálculo de las unidades
formadoras de colonia (UFC) por
mililitro.
Aislamiento de microorganismos
Al cabo de 120 horas (5 días) de
muestreo del jugo, se procedió a aislar
las colonias características en medios
selectivos y por medio de siembra en
estría. Para la caracterización
microscópica se utilizó el método de
tinción de Gram agrupando las colonias
por morfologías microscópicas. Luego
se agruparon por morfologías
macroscópicas y microscópicas.
Extracciones de los extractos
etanólicos
Para la extracción se utilizaron
hojas de (Naranja – Moringa),
previamente secadas 72 horas a 53 °C
en una estufa de circulación forzada
(BINDER – Alemania), luego, se
maceraron en morteros con etanol 90%.
Posteriormente, se llevó a agitación por
24 horas en un agitador recíproco a 150
RPM, al final se hizo la recuperación del
etanol en el rotavapor (Heidolph –
Alemania) por 5 horas, logrando así
obtener el extracto etanólicos para la
inhibición.
Obtención de las bacteriocinas
Para la obtención de las
bacteriocinas se utilizó un cultivo de
Lactobacillus sp., del cepario de la
Universidad Gran Colombia Armenia,
las cuales fueron llevadas a caldo MRS
a 27 °C por 48Horas., posteriormente
se llevó a centrifugación a 30 min, el
sobrenadante se pasó por un filtro de
0,2 μm, así obteniendo las
Bacteriocinas utilizadas para la
inhibición.
Pruebas de inhibición
Técnica de pozos:
Para las pruebas de inhibición
por técnica de pozos se utilizó Agar
Yeast Extract Glucose Chloramphenicol
(YGC) (MERCK, Alemania); que fue el
medio de cultivo selectivo y Tryptic
Soya Broth (TSB) (OXOID - Inglaterra),
donde fueron activados las levaduras
Vol 24, No 39 (2016), Revista Alimentos Hoy -160
alterantes aisladas del jugo y los
microorganismos patógenos alterantes
como Escherichia coli, Salmonella spp.
y Saccharomyces cerevisiae.
Posteriormente se adicionó en una caja
Petri el medio de cultivo a 37+-2 ºC.
Luego se realizaron los pozos de 10mm
de diámetro, en cada pozo, se adicionó
20 μL de extracto etanólicos de hojas de
naranja y moringa, aceite esencial de
naranja, bacteriocinas de bacterias
ácido-lácticas y como control benzoato
de sodio comercial y Oxitetraciclina
(ERMA – Colombia). Posteriormente se
llevó a incubación 24horas a 27 °C,
pasado el tiempo de incubación se
realizó la medición de halos de
inhibición (mm)
Cálculo de ciclos log reducidos:
Se preparó 50mL de Tryptic
Soya Broth (TSB) (OXOID - Inglaterra),
para las levaduras y caldo nutritivo
(Merck- Alemania) a los cuales se les
adicionó los microorganismos a retar,
posterior a esto se añadió una muestra
de 1mL a 9mL de agua peptona para
hacer las diluciones seriadas y luego se
llevó a incubación según temperatura
del microorganismo.
III. Resultados y discusiones
Resultados físico químicos
En esta prueba las variables a
medir fueron: sólidos solubles (°Brix),
potencial de hidrogeno (pH) y
porcentaje de acidez para las
fisicoquímicas, mostrando que en las
temperaturas de abuso y deterioro
mostró una disminución en el pH y
°Brix, aumento en la acidez (Tabla 1);
esto se debe posiblemente a las
reacciones de deterioro causadas por el
crecimiento de los microorganismos,
producción de metabolitos como ácidos
y consumo de los azúcares presentes
en el medio. En la temperatura de 30 °C
se presentó un mayor descenso de las
variables, posiblemente ya que está, es
una temperatura óptima para el
crecimiento de mesófilos.

Tabla 1 – Resultados de : °Brix, pH y acidez para el control (refrigerado) a temperaturas de 25 y 30°C y los
delta de cada una de las variables medidas (Final-inicial).

Temperatura
Control 20 °C 30 °C
Variables Valores Δ Valores Δ Valores Δ
°Brix Inicial 8,7 -0,70 8,70 -2,10 8,70 -1,30
Final 8 6,60 7,40
Acidez Inicial 0,44 º 0,44 0,44 0,44 0,22
Final 0,57 0,87 0,66
pH Inicial 4,16 -0,16 4,16 -0,66 4,16 -0,43
Final 4 3,5 3,73

Vol 24, No 39 (2016), Revista Alimentos Hoy -161

Resultados microbiológicos finalmente 5 características
De las temperaturas evaluadas, morfológicas; asociadas posiblemente
se encontraron 10 morfologías, estas, al deterioro y alteración del producto.
fueron aisladas y se agruparon según Cada microorganismo se encuentra
características macroscópicas y puro en cajas de petri.
microscópicas, obteniéndose

Tabla 2 – Pruebas macro y microscópicas de los microorganismos alterantes

N° Microscópica Gram Macroscópica Diámetro Forma Textura

1 Bacilos corto Positivo Blanco 4mm Redonda Cremosa
2 Levaduras Blanco 6mm Redonda Cremosa
3 Cocos Positivo Blanco 1mm Punteada Cremosa
4 Bacilos largo Positivo Blanco 6mm Punteada Seca
5 Levaduras Blanco 1mm Punteada Cremosa

Estos microorganismos Gram Técnica de Pozos

positivos están asociados al deterioro y
alteración de diversas matrices
alimentarias, además se conoce que las
levaduras son causantes de los
procesos de fermentación y deterioro
de productos, como ya lo ha
mencionado (Delavenne, y otros,
2013). Otro caso de contaminación
puede ser la manipulación de los
procesos de transformación y las
temperaturas a las cuales puede ser
sometido este tipo de producto.
En esta prueba se evaluó la
capacidad de inhibición que tiene
algunas sustancias como Benzoato de
sodio comercial, Oxitetraciclina, aceite
esencial de naranja, bacteriocinas de
bacterias acidolácticas y extractos
etanólicos de hojas de naranja y
moringa contra microorganismos
patógenos como Salmonella enterica
sbsp eneterica Typhimurium ATCC
14028, Escherichia coli ATCC 35218
KS2C y levaduras como
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4098
0534P, las halladas en el jugo
Rhodotorula sp y Pichia sp.

Vol 24, No 39 (2016), Revista Alimentos Hoy -162

Tabla 3 – Resultados de los halos (mm) de inhibición de las sustancias retadoras

Microorganismos 1 2 3 4 5 6
Salmonella 21,36 4,70 2,88 2,28
Escherichia Coli 2,94
Saccharomyces 16,64 1,98 1,84 3,27 4,86
Rhodotorula sp. 3,3 22,46 2,42 1,87
Pichia sp. 9,84 2,04 13,26 3,46 1.98

1. Oxitetraciclina 4. Bacteriocina
2. Benzoato 5. Extracto de naranja
3. Aceite de Naranja 6. Extracto de moringa

En la tabla 3, se puede analizar cerevisiae., obteniendo halos de hasta

que el aceite esencial de naranja no
tiene capacidad inhibitoria contra este
tipo de microorganismos, por el
contrario se pudo observar que los
extractos etanólicos de hojas (Naranja
– Moringa) tuvieron una mejor retención
de los alterantes, logrando halos de
inhibición entre 2,28 y 4,86mm en las 3
levaduras; las bacteriocinas tuvieron
una capacidad de inhibición efectiva
contra levaduras como Rhodotorula sp,
Pichia sp. y Saccharomyces
22,46mm
Cálculo de ciclos log reducidos:
Para la reducción de ciclos Log
de los microorganismos Rhodotorula
sp., Pichia sp. y Saccharomyces
cerevisiae se realizó el cálculo con las
UFC finales- las UFC iniciales. Esto se
analizó solo con los extractos etanólicos
(moringa – naranja), ya que fueron las
que mayor efectividad tuvieron en los
halos de inhibición Gráfica 1.

Vol 24, No 39 (2016), Revista Alimentos Hoy -163

Gráfica 1 – Resultados de los ciclos Log reducidos.

1 Bacteriocina A:100%, B:50%; 2 Moringa A:100%, B:50% ; 3

Naranja A:100%, B:50%
0
-1 1A 1B 2A 2B 3A 3B
Ciclos Log reducidos

-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8

Rhodotorula sp Saccharomyces cerevisiae Pichia sp

Los extractos etanólicos de hojas este sentido, se resalta la capacidad

de (moringa – naranja) no se encontró antimicrobiana de los compuesto
un crecimiento de las levaduras terpénicos y flavonoides presentes en
evaluadas, siendo este un frutas citricas (Espina et al, 2011). Se
comportamiento similar a otros estudios trata de compuestos localizados
donde se eliminan efectivamente cepas mayoritariamente en la piel, semillas y
patógenas de Escherichia coli, hojas de las frutas y su composición es
Salmonella typhi y Shigella dysenteriae variable dependiendo de la variedad.
(Oluduro, 2010), ya que la moringa Son compuestos lipídicos responsables
muestra la presencia de compuestos 4- de las propiedades aromáticas de los
(L-ramnopiranosiloxi) isotiocinato de productos cítricos, además poseen
bencilo, metil N-4-(L-ramnopiranosil- propiedades antimicrobianas de interés
oxi) bencil carbamato y 4-(D- para la industria alimentaria y
glucopiranosil-1-4-L ramnopiranosiloxi)- farmacéutica (Sobrino-López et al,
tiocarbozamida bencilo, todos 2006; Quintavalla et al, 2002).
mostrando una actividad bactericida
muy alta contra los patógenos Dichas propiedades
mencionados anteriormente (Oluduro et antimicrobianas, han sido testadas
al., 2010). tanto frente a bacterias Gram positivas
como Gram negativas siendo
Posiblemente el efecto que mas especialmente eficaces frente a las
condiciona las propiedades de Gram negativas, como en este caso S.
alteracion de los subproductos sea la typhimurium y E. coli O157:H7
propia composicion de los mismo. En (Raybaudi-Massilia et al, 2009). Sin

Vol 24, No 39 (2016), Revista Alimentos Hoy -164

embargo, hasta la fecha el mecanismo moringa) poseen propiedades
responsable de la actividad antimicrobianas efectivas frente a
antimicrobiana de los terpenos y los levaduras como Saccharomyces
flavonoides no está totalmente claro. cerevisiae ATCC 4098 0534P,
Rhodotorula sp y Pichia sp en las
Otras investigaciones reportan a concentraciones ensayadas, siendo
nivel molecular el asilamiento de una necesario solo concentraciones de
proteina coagulante presente en las extracto de 25%, obteniendo reducción
hoja de Moringa oleifera Lam, capaz de de ciclos log hasta de 7,6 UFC/ml.
absorber bacterias gram positivas y
gram negativas (Broin, 2002). De La investigación ha demostrado que
igual manera el 100% de la inhibición de Salmonella entérica sbsp eneterica
los microorganismos alterantes se pudo Typhimurium ATCC 14028, Escherichia
haber dado por la presencia de de coli ATCC 35218, posee una menor
algunos metabolitos secundarios sensibilidad a las propiedades
presentes en los extractos etanolicos, antimicrobiana de los extractos
como lo menciona (Corzo Barragán, etanólicos.
2012).

IV. Conclusiones

La utilización de bacteriocinas como

un antimicrobiano natural presenta un
gran interés en la industria alimentaria,
ya que constituye una gran alternativa
para la aplicación en una amplia
variedad de productos, encontrando un
potencial para sustituir los
conservantes sintéticos, abriendo un
nuevo paso a tecnologías de
bioconservación alimentaria.

La utilización de subproductos de
frutas cítricas como la cascara de
naranja, el cual tiene posibles
ingredientes naturales que poseen
propiedades antimicrobianas, dicha
utilización de esté reduciría los
problemas ambientales generados por
la agricultura

Los resultados obteniditos muestran

que los extractos de hojas (naranja –

Vol 24, No 39 (2016), Revista Alimentos Hoy -165


V. Referencias
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Agradecimientos

Los autores agradecen a la

Universidad La Gran Colombia por su
apoyo desde el inicio del proceso de
investigación, y por la prestacion de
cada una de las intalaciones, equipos
y materiales del laboratorio de
biotecnologia. De igual manera a Lina
María Jaramillo Echeverry, lider de
laboratorio, por apoyo incondicional
en el transcurso de la investigación.

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