UNIVERSIDAD NACIONAL AMAZONICA DE MADRE DE DIOS

FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

TEMA:
“TRATAMIENTO DE LOS PRODUCTOS DE LAS
BIOREACCIONES, CONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN”

ALUMNO : JHON BRAYAN QUICO SONCCO

CURSO : BIOPROCESOS

CODIGO : 13210002

DOCENTE : ING. VIRNE MEGO MEGO

SEMESTRE : 2018 – II

PUERTO MALDONADO – PERU

2018
 INFORME N.-2

TRATAMIENTO DE LOS PRODUCTOS DE LAS BIOREACCIONES, CONCENTRACIÓN Y

PURIFICACIÓN

I. INTRODUCCION
La ultrafiltración en particular, puede ser empleada tanto para la separación de sólidos
como para la concentración del producto y cuando se utiliza para la concentración, el
producto permeado tiene posibilidades de ser enviado a una ósmosis reversa para
obtener una mayor concentración, lo que da una idea de las múltiples posibilidades de
combinación que existen entre los distintos procesos.
En este punto es importante señalar que ha existido una tendencia a considerar juntos
los procesos de membrana, tanto los que se usan como alternativa a los filtros
convencionales en la separación sólido-líquido como los utilizados para las
separaciones moleculares, lo cual no es correcto ya que en ambos casos, aunque
existen aspectos comunes como los fenómenos de ensuciamiento de las membranas,
los mecanismos que influyen son diferentes. En las separaciones sólido-líquido el
mecanismo predominante es de esencialmente mecánico, mientras que en las
separaciones mecánicas predomina la difusión.
También se pueden emplear para la concentración la adsorción en desecadores como
la alúmina activada. Y existen otras posibilidades de interés, como son el uso de la
extracción con membranas preselectivas
 Purificación de los productos
Las etapas de purificación finales de los procesos de bioseparación conllevan la
separación de las micromoléculas de las macromoléculas, seguidas de la
separación entre las macromoléculas. Estas etapas pueden clasificarse como
una etapa de purificación primaria, seguida de una etapa final de aislamiento. En
las etapas primarias de purificación se incluyen el uso de diálisis, electrodiálisis,
extracción, ultrafiltración, tratamiento iónico, cromatrografía de permeación por
gel y cromatografía de alto rendimiento. Las etapas de aislamiento final,
incluyen la precipitación, extracción, cromatografía de intercambio iónico y
cromatografía de afinidad.
Estas dos etapas no son mutuamente excluyentes y los límites entre las mismas
están definidos de manera arbitraria y no muy precisa, los métodosprimarios
tienen diversos grados de aplicación en las industrias de bioprocesamiento. Por
ejemplo, la diálisis y la electrodiálisis se han usadas durante muchos años en
las aplicaciones bioquímicas y biomédicas y en las mismas, las tasas de flujo
por unidad de área tienden a ser bajas debido a que el transporte a través de la
membrana es forzado por una diferencia de concentración. En el caso de la
electrodiálisis se utiliza un campo eléctrico para mejorar el movimiento de los
iones a través de una serie de membranas.
La extracción con fluidos supercríticos es un método de separación que
promete mucho en los bioprocesos. El solvente más empleado en este tipo de
procesos es el dióxido de carbono supercrítico, el cual permite la necesaria
limpieza y con el cual se logra incrementar las tasas de extracción normales.
 Además, el uso de pequeñas cantidades de un solvente puede mejorar
considerablemente la solubilidad de las biomoléculas y por ejemplo se ha
obtenido una mejora de varias veces en la solubilización de colesterol,
estimasterol y ergosterol mediante la adición de 3.5 % molar de etanol o
metanol, al solvente dióxido de carbono (Wong y Johnston, 1986).
En los últimos años, un proceso que ha recibido mucha atención es la
extracción de biomoléculas utilizando dos fases acuosas inmiscibles, las que se
obtienen, por ejemplo, añadiendo al agua materiales como dextrana y
polietileno, con lo cual pueden surgir dos fases inmiscibles en determinadas
condiciones.
 Precipitación de proteínas
Las operaciones de precipitación se utilizan ampliamente para la recuperación
de biomoléculas y especialmente de proteínas. La precipitación se induce
normalmente por adición de sal o de un solvente orgánico, para alterar
la naturaleza de la solución, de manera tal que las proteínas precipiten. La
precipitación selectiva de unas proteínas de una solución de varias proteínas, es
una de las técnicas más antiguas de concentración y purificación (Chisti y Moo-
Young, 1991).
Los factores de purificación que se obtienen están entre 3 y 10 veces, lo que
resulta modesto comparado, por ejemplo, con los métodos cromatográficos. Los
métodos de precipitación se pueden aplicar a grandes cantidades de materiales
que pueden estar bastantes crudos (residuos celulares, sólidos suspendidos,
contaminantes, etc.) y además, permiten la aplicación efectiva de la operación
continua. Por todas esas características, la precipitación se encuentra
frecuentemente en los esquemas industriales de purificación de proteínas,
fundamentalmente en las primeras etapas de purificación.
El proceso de precipitación convierte la proteína soluble en una forma insoluble
alterando las interacciones soluto-solvente. Las moléculas de proteínas pueden
acarrear cargas positivas y negativas, estando en dependencia la carga neta
del pH de la solución. Cuando la proteína está en su pH isoeléctrico, la molécula
de proteína lleva carga neta cero y es menos soluble en un solvente polar, como
es el caso del agua. Ese punto isoeléctrico es normalmente muy diferente en las
distintas proteínas y esto hace posible que mediante la variación por pasos del
pH de una solución de proteínas se puedan precipitar y colectar fracciones
diversas, aunque hay que tener en cuenta que la exposición a valores de pH
extremos puede provocar la desnaturalización de las proteínas y causar la
pérdida de su actividad biológica. Esta técnica de separación de proteínas por
variación del pH se emplea en la industria de los alimentos, por ejemplo en la
coagulación de la leche.
El agua es un solvente polar fuerte, con una alta constante dieléctrica (K 21 a
20C), por quel interactúa con la proteína cargada, manteniéndola en solución. La
adición de un solvente menos polar como algunos compuestos
orgánicos (metanol, etanol, acetona) reducen la constante dieléctrica de la
solución y de manera correspondiente disminuye la solubilidad de la proteína.
Los solventes orgánicos tienen una gran afinidad con las superficies
hidrofóbicas de las proteínas y esto provoca la desnaturalización de las
proteínas junto con su precipitación y por ello la concentración de solvente
orgánico normalmente se mantiene baja, aunque existen algunos como el 2
Metil-2,4-Pentano Diol (MPD), el Dimetil Sulfóxido (DMSO) y el etanol que se
pueden utilizar también en altas concentraciones.
En general, la técnica de precipitación de proteínas más utilizada es
la precipitación por adición de sales, conocida como precipitación por
salado(salting-out). La adición de sal (como sólido cristalino o como solución
concentrada), a las soluciones de proteínas, reduce la solubilidad de las
proteínas. El efecto se deber al parecer, de la reducción de la actividad del agua
o de la disponibilidad de agua para la hidratación de la proteína aunque el
mecanismo exacto del proceso es hasta ahora discutible.
La efectividad de aniones y cationes en el proceso de precipitación por
salado de las proteínas depende de su carga iónica y en general, mientras más
alta es la carga más efectivo es el ión. Basado en esa observación, muchos
iones pueden agruparse en una serie de eficiencia de precipitación por salado,
conocida como serie liotrópica o serie de Hofmeister (Tabla 1), aunque esto no
constituye una relación completa de todos los posibles iones. Las sales que
comúnmente se emplean son los sulfatos de amonio y sodio y los fosfatos de
sodio y potasio. De ellas, el sulfato de amonio es bastante usado por ser barato
y soluble a bajas temperaturas, sin embargo es también corrosivo y libera
amoniaco en un ambiente alcalino. Este proceso de precipitación por sales se
controla por la fuerza iónica I de la solución, la que se calcula mediante:
(1)

Tabla 1. Serie liotrópica de iones

La parte lineal de ese gráfico se describe por la llamada ecuación de Cohn:

( 2)

donde KSL es la constante de precipitación por salado.

La constante depende del pH, la temperatura y la proteína, pero se afecta poco
por el tipo de sal
Las características de los precipitados de proteínas dependen
significativamente de factores tales como el método de contacto de la sal y la
solución de la proteína, la naturaleza del mezclado y la magnitud de los campos
de cizalladura en el reactor de precipitación, así como efectos del
envejecimiento.
Figura 2. Comportamiento típico de la solubilidad de una proteína en función de
la fuerza iónica (De Chisti y Moo-Young, 1991).
En la práctica se ha comprobado que los recipientes de mezclado, agitados con
impelentes helicoidales de cinta, de baja razón de cizalladura, resultan muy
útiles para el proceso de contacto entre el reactivo y las soluciones de proteínas
(Figura 3).

Figura 3. Mezclador con impelente de cinta helicoidal para la precipitación de

proteínas (De Chisti y Moo-Young, 1991).
 Extracción líquido-líquido
La extracción líquido-líquido es mucho más practicada en las industrias
biotécnicas y en su forma más convencional, se utiliza un solvente para extraer
uno o más componentes de una mezcla líquida. Este tipo de operación puede
requerir más de una etapa de contacto en equilibrio, con flujos en modo cruzado
o a contracorriente. En las bioseparaciones se han utilizado ampliamente
extractores especiales como los contactores centrífugos Podbielniak
Es un método de remoción selectiva de una sustancia deseada desde una
mezcla en fase líquida hacia un segundo líquido inmiscible. El soluto
(antibiótico, ácido orgánico) se encuentra normalmente en una solución acuosa
(caldo de fermentación o licor) y cuando contacta con un solvente inmiscible se
distribuye o particiona por si propio, entre las dos fases. La extensión de la
partición se determina por el coeficiente de partición kp que se define como:

(3)
Para ácidos orgánicos y bases tales como penicilinas, ácido benzoico, ácido
cítrico y eritromicina, kp depende fuertemente del pH: las formas de sales de
esos compuestos, ejemplo benzoato de sodio, tienen solubilidad preferencial en
medio acuoso, mientras que las formas ácido (ácido benzoico) o base
(eritromicina) muestran más solubilidad en compuestos orgánicos menos
polares.Para realizar las extracciones deseadas se realizan variaciones de pH y
para ello se utilizan adiciones de sales inorgánicas, ácidos grasos, detergentes,
etc. También se han utilizado fases orgánicas compuestas de mezclas de dos o
más solventes orgánicos y en esos casos la kp puede ser alterada cambiando la
composición del solvente.
La relación entre la cantidad total de soluto en las dos fases se conoce
como grado de separación (G) y depende de los volúmenes de solvente y de
caldo:

(4)
hay que tener en cuenta que esta ecuación, además de la ecuación 3, son
relaciones de equilibrio.
En la industria hay disponibles diversos tipos de equipos de extracción líquido-
líquido y en particular, en la industria de los antibióticos se han utilizado
extractores centrífugos como el mencionado extractor Podbielniak, para lograr
una extracción muy rápida Figura,4.
Las proteínas y otros biopolímeros que presenten una solubilidad razonable
solamente en soluciones acuosas, o que se desnaturizan en los solventes
orgánicos, pueden ser purificados por extracción líquido-líquido entre dos fases
acuosas. En esos casos se producen fases acuosas inmiscibles, disolviendo en
las mismas concentraciones elevadas de dos polímeros diferentes o de
combinaciones de polímero y sales en agua

Figura 4. Extractor centrífugo tipo Podbielnak

 Cromatografía
La aplicación industrial de cromatografía como una tecnología de separación
industrial, a gran escala ha probado por sí misma ser particularmente valiosa
para la purificación de proteínas. La producción de
insulina, hormonas y enzimas medicinales hacen ya uso de esta técnica
mientras que el fraccionamiento de plasma sanguíneo por cromatografía está
también en rápido desarrollo. En general mezclas muy complejas pueden ser
separadas o resueltas en sus componentes por esta técnica.
Todas las separaciones cromatográficas dependen de interacciones
fisicoquímicas entre los componentes disueltos de una mezcla y una fase
estacionaria. Esta última es comúnmente un sólido o un líquido soportado sobre
un sólido, que están contenidos en una columna empacada. La mezcla a separar
se aplica a la columna en un pequeño volumen de solución y posteriormente la
columna se lava con un solvente que constituye la fase móvil y los distintos
componentes de la mezcla se mueven hacia abajo en la columna, con
velocidades diferentes que dependen de cuan fuerte sea la interacciónentre el
compuesto en particular y la fase estacionaria. Los compuestos que se asocian
fuertemente con la fase estacionaria, fluyen hacia abajo a una velocidad menor
que aquellos que no lo hacen tan fuerte (Chisti y Moo-Young, 1991).
En las separaciones biológicas industriales la fase móvil es siempre un líquido,
normalmente una solución acuosa. Sin embargo la naturaleza de las
interacciones entre los componentes de la mezcla y la fase estacionaria pueden
ser diferentes, lo que da lugar a diferentes tipos de cromatografía, entre las que
se incluyen: afinidad, intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica, así
como filtración por gel. Todas son útiles en las separaciones biotecnológicas,
siendo usadas ampliamente las de intercambio iónico para la purificación de
proteínas, mientras que la cromatografía de afinidadconstituye una técnica
especialmente poderosa para las sustancias biológicamente activas.
El proceso de cromatografía en general comienza cuando la mezcla se aplica a
la columna cromatográfica y el flujo de solvente comienza. Entonces la variación
de la concentración de los componentes en el tiempo se comporta de la forma
que se muestra en la figura 5

Figura 5. Cromatograma típico (De Chisti y Moo-Young, 1991).

En ese ejemplo, los picos corresponden a los dos componentes A y B de la
mezcla y la extensión de la separación se mide por los picos de resolución Rz,
definidos como la diferencia entre los tiempos de retención (ta y tb) de los
componentes, dividido por el ancho promedio del pico:

( 5)
Los anchos de los picos se miden en unidades de tiempo. Cuando Rz es igual a
1.0, el área de solapamiento de los dos picos es aproximadamente el 2% del área
total de los picos. Para reducir el solapamiento a 0.1%, la resolución debe ser de
1.5 o mayor. (Chisti y Moo-Young, 1991).
Como se señaló anteriormente, se han utilizado varios tipos de cromatografía
para el aislamiento de las biomoléculas, entre las que se destaca
la Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC), con la cual se
ha estado trabajando intensivamente en los últimos años con relación
principalmente a la determinación adecuada de los parámetros de escalado
necesarios para las capacidades industriales requeridas. Para este proceso de
escalado es imprescindible contar con modelos matemáticos adecuados que
permitan pasar de los resultados de laboratorio a los requerimientos industriales
y también en este campo se han obtenido avances importantes

Figura 6. Comparación entre los resultados de una cromatografía analítica y otra

preparativa
En la figura 6. se presenta una comparación entre los comatogramas de la
escala analítica y la escala preparativa, para la purificación de la uracil-ADN-
glicosilasa, Se aprecia claramente como la columna más grande (escala
 preparativa) no hace un corte tan preciso entre las enzimas y las proteínas, en
gran parte debido al grado de mezcla de los fluidos en su flujo por la columna.
En este aspecto hay que considerar los requerimientos diferentes que tienen
ambos tipos de cromatografía, ya que en la analítica, por ejemplo, lo
determinante es la precisión de la separación, sin importar mucho el costoentre
otras cosas por la pequeña escala de operación, mientras que en el caso de la
escala preparativa, por el contrario, los costos tienen una gran importancia. En
la actualidad se han obtenido grandes avances en este campo y por lo tanto las
técnicas de HPLC ofrecen una gran perspectiva para el escalado de la
producción de productos proteicos de la biotecnología
Otro método cromatográfico prominente es la cromatografía de afinidad,
denominada en ocasiones adsorción bioespecífica. Esta operación puede verse
de forma muy similar a un adsorbedor de cama fija, pero con limitaciones con
relación a la capacidad y con requerimientos de refrigeración. En este proceso,
un ligando específico como un inhibidor enzimático, se agrega a un soporte
sólido, como las perlas de agarosa y se empacan en la columna de contacto.
Una enzima específica en la mezcla alimentada interactuará con el ligando
inmovilizado, efectuando de esa forma la separación.
En el modo de regeneración, la enzima capturada se remueve con una corriente
que tiene una fortaleza iónica modificada o con cualquier otra propiedadque
sirva a las necesidades de remoción.
 Productos recombinantes
4.1 Solubilización de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinates cuando se expresan en bacterias, generalmente, se
forman agregados proteicos inactivos e insolubles denominados cuerpos de
inclusión. En células eucariotas las proteínas heterólogas son secretadas al
medio de cultivo y raramente dichas proteínas se obtienen intracelularmente
asociadas a la estructura de la membrana mediante interacciones iónicas o por
enlaces de hidrógeno.
Para la purificación a partir de los cuerpos de inclusión o las que quedan
enlazadas a las membranas deben ser solubilizadas con agentes caotrópicos o
desnaturalizante que se conoce como extracción o solubilización. En la
composición del medio adecuado para la extracción se debe tener en cuenta
diferentes factores como el pH, la fuerza iónica, las interacciones hidrofóbicas,
el potencial redox y la presencia de proteasas. Estos deben garantizar la
estabilidad de la proteína y su remoción eficiente de las células o tejidos. La
solución final involucra un compromiso entre el máximo de recobrado y la
pureza superior.
 Renaturalización de proteínas recombinantes
Los agentes caotrópicos y reductores empleados en la extracción provoca la
ruptura de los puentes disulfuro y de las interacciones hidrofóbicas dando como
resultado la pérdida de las estructuras terciarias y secundarias y la obtención de
cadenas polipeptídicas linéales, fenómenos que se conocen como
desnaturalización. La renaturalización es el proceso contrario donde la proteína
recupera su estructura terciaria nativa, que le confiere su actividad biológica
específica. Existen métodos que se pueden emplear para la renaturalización
entre ellos se pueden mencionar a la dilución, diálisis, diafiltración y
cromatografía por filtración en gel. El objetivo consiste en cambiar o remover el
exceso de agentes desnaturalizantes y reductores, lo que permite que las
proteínas en cuestión vuelvan a su estado natural. Las principales
características de cada método se muestran en la tabla 2.
El problema fundamental del proceso de renaturalización es el bajo recobrado
de algunas proteínas debido a la formación de agregados de especies plegadas
de una manera incorrecta. Esta agregación es un fenómeno intermolecular, por
lo que es altamente dependiente de la concentración proteica.
Tabla 2. Comparacion de los métodos más utilizados en la renaturalización de
proteínas.

Filtración
Razón Dilución Diálisis Diafiltración
en gel

Simplicida
Muy fácil Fácil Fácil Fácil
d

Eficiencia
Depende de
de ~ 100% si se
la dilución ~ 100% ~ 95%
desalinizac completa
utilizada
ión

Los sacos
Completam Completam Las fibras se
Confiabilid pueden
ente ente pueden
ad abrirse o
confiable confiable perforar
perforarse

Cercana al
95% de
100% de
Lenta, entre desalinizació
Velocidad desalinizaci Muy lenta
8 y 24 horas n en 20
ón en 15
minutos
minutos

Variable Problemas
necesidad de 70% o menor
de ajustar adsorción a a bajas
Recobrado ~ 100%
las bajas concentracio
principales concentraci nes
variables ones

Dilución Depende de Depende Pequeña Pequeña

la del tamaño
 concentraci
ón del
de la cama
agente
caotrópico

Los estudios mas actuales han demostrado que se originan por las
interacciones entre las regiones hidrofóbicas en las cadenas polipeptídicas
plegadas parcialmente por lo que provoca que las condiciones en que las
proteínas se renaturaliza tienen que ser cuidadosamente seleccionadas teniendo
en cuenta parámetros externos como es la temperatura, el pH, la fuerza iónica, la
agitación y los factores internos como la concentración de proteínas y el tiempo.
Para evitar la agregación se han utilizado aditivos como: L-arginina, moléculas
chaperonas, sales y alcoholes de cadenas cortas, que aumentan la solubilidad
de los intermediarios con plegamiento parcial e inhiben la reacción de
agregación.
 Precipitación de proteínas recombinantes
Al comenzar la purificación de las proteínas recombinantes extracelulares o
intracelulares hay un concentrado de proteínas, lípidos y otros componentes
como polisacáridos, sales y agua. En la mayoría de los casos hay muchos
contaminantes .Por lo primero se emplea generalmente un paso de limpieza o
pretratamiento que permite clarificar el flujo de materiales suspendidos, sales y
contaminantes no proteicos. Las operaciones típicas de este paso incluyen la
absorción, interacción hidrofóbica, separación de dos faces acuosas o la
precipitación de proteínas.
La precipitación de proteínas es la operación más ampliamente estudiada y
usada para una purificación parcial antes de utilizar un paso de alta resolución.
El principio básico de esta técnica es provocar una alteración de alguna
propiedad del solvente original que promueve la insolubilización de las
proteínas.
Entre las ventajas del uso de la precipitación: la operación es fácilmente
adaptable a gran escala, se puede hacer continuamente, requiere de un
equipamiento simple y se puede basar en número grande de alternativas
además se usan reactivos a muy bajas concentraciones.
Los métodos mas utilizados en la precipitación de proteínas son: la
precipitación de euglobulinas; por salado o "salting-out"; con solventes
orgánicos; con polímeros orgánicos neutros; con polielectrolitos; con iones
metálicos; por inmunoafinidad; por desnaturalización selectiva y con colorantes.
La precipitación de euglobulinas se basa en la insolubilización de estos tipos de
proteínas insolubles en agua, a medida que se le disminuye la concentración
salina hasta valores cercanos a 0.
Una de las técnicas más ampliamente utilizadas en la purificación es la
precipitación por salado o "salting-out". Una gran ventaja del fraccionamiento
por sulfato de amonio, que lo sitúa virtualmente por encima de las otras
técnicas, a demás de su sencillez es la estabilización que ocurre en las
proteínas. Un precipitado proteico es a menudo estable por años y constituye el
método natural de empacar las proteínas comerciales. Las altas
concentraciones de sal previenen la acción proteolítica y bacteriana, por ello es
útil tener siempre en una purificación una etapa donde la muestra pueda ser
dejada durante la noche.
Otra precipitación muy utilizada por su simplicidad es isoeléctrica. Se basa en el
ajuste del pH al punto donde la carga neta es 0. De esta forma, se minimiza la
repulsión y se puede tener como resultado una atracción electrostática de cada
una de las moléculas entre si. Este es el punto de mínima solubilidad o pH
isoeléctrico y en muchos casos tal ajuste resulta en precipitación. Cuando el pH
de una mezcla de proteínas se ajusta al pH isoeléctrico de unos de sus
componentes, la mayor parte o casi todo el componente precipitará, quedando
en la solución las proteínas cuyos valores de pH isoeléctricos se encuentren por
encima o por debajo de aquel. La proteína precipitada isoeléctricamente
permanece en su conformación nativa, y puede redisolverse en un medio de pH
apropiado y concentración salina adecuada.
Por otra parte, el método de precipitación proteica mediante solvente orgánica
se basa en la adición de un solvente orgánico miscible en el agua, como el
etanol o la acetona, a un extracto acuoso que contiene proteínas. Esto provoca
una variedad de efectos que, combinados, conduce a la precipitación proteica.
Una ventaja del fraccionamiento con solventes orgánicos es que este puede
operar a temperaturas inferiores a 0°C, ya que todos los solventes miscibles
forman mezclas con agua que se congelan a temperatura bien por debajo de
0°C.
Las sales y los solventes orgánicos no son los únicos materiales que pueden
provocar agregación de proteínas sin desnaturalización. Se han investigado la
capacidad de una variedad de polímeros de alto peso molecular, neutrales y
solubles en agua, para precipitar las proteínas. Sin embargo, la
alta viscosidad de la mayoría de las soluciones resultó una desventaja para que
su uso como precipitantes no fuera práctico. Uno de los polímeros mas usados
y que se pudiera considerar una excepción es el polietilenglicol (PEG).
Los polielectrolitos son polímeros solubles en agua que
contienen grupos ionizables repetidos. Estos han sido usados en la purificación
de proteínas, especialmente a escala industrial, los cuales pueden ser
reutilizados.
La acción precipitante de los iones metálicos se utiliza en la purificación de
proteínas. Este método se basa en la habilidad de estos para reaccionar con
sitios específicos de la molécula de proteína aunque no todos los complejos
metal – proteína son insolubles.
La existencia de interacciones altamente específicas entre las proteínas y
moléculas biológicas o sintéticas se ha utilizado para desarrollar una técnica
especialmente selectiva, conocida como precipitación por afinidad. El método es
conceptualmente similar a la cromatografía por afinidad y utiliza ligandos
 específicos como sustratos, coenzimas o inmunoglobulinas, enlazados a un
polímero soluble en agua.
Existe un gran número de proteínas que son muy resistentes, incluso a
condiciones extremas. Se puede utilizar esta excepcional estabilidad
exponiendo un preparado impuro a estas condiciones donde las proteínas no
deseadas se desnaturalizan y precipitan fuera de la solución, fenómeno
conocido por desnaturalización selectiva. Se crean condiciones donde la
proteína de interés no se desnaturalice y los contaminantes se desnaturalicen y
precipiten. Los parámetros en que se han puesto el mayor énfasis han sido la
temperatura, el pH y los solventes orgánicos.
 Purificación de alta resolución
En dependencia de la pureza requerida para el uso del producto, la etapa de
pretratamiento pudiera ser suficiente. Después de este paso probablemente se
usara un método de purificación de proteínas de alta resolución, que
generalmente se realiza por cromatografía. La selección se basa en las
diferentes técnicas cromatografías para separar la proteína de interés de sus
contaminantes como cromatografía de adsorción, de fase reversa, de
interacción hidrofóbica, de afinidad, cromatoenfoque, siendo la cromatografía
defiltración en gel y de intercambio iónico, las más empleadas por su alta
resolución capacidad y simpleza
 Referencias
Aiba S., Humphrey A. E. And Millis N. F. 1973. Biochemical Engineering, 2da
edition, Academic Press, New York.
Chisti, Y., Moo-Young, M., in Biotechnology: The Science and the Business,
Moses, V., Cape, R. E., eds, Harwood Academic Publishers, New York, 1991, pp.
167-209. Fermentation technology, bioprocessing, scale-up and manufacture.
Scragg. A. H 1997. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas biológicos en
procesos tecnológicos. Ed. Limusa, S.A de C. Grupo Noriega. Editores Balderas
95, México. D.F

https://www.monografias.com/trabajos82/tratamiento-productos-bioreacciones-
concentracion-y-purificacion/tratamiento-productos-bioreacciones-
concentracion-y-purificacion2.shtml

I.1. Objetivo General

 Estudiar sobre la producción de etanol a partir de biomasa

II. MARCO TEORICO

ETANOL
El etanol es muy conocido por sus posibilidades dionisiacas, el también llamado
alcohol etílico, tiene múltiples usos. Según el uso, el etanol se puede clasificar como:
• Potable: en la preparación de bebidas;
• Industrial: como desinfectante, solvente, anticongelante (en los radiadores de
automóviles), o en la preparación de otros compuestos orgánicos; y
• Combustible: principalmente para el transporte.
El etanol es un excelente
combustible para motores:
• tiene un índice de octanos1 para
motores el cual excede al de la
gasolina.
• tiene una presión de vapor
menor2 que el de la gasolina lo
que resulta en una emisión por
evaporación menor.
• es menos inflamable que la
gasolina lo cual reduce el número
y la severidad de los incendios de
los vehículos;
• Tiene un contenido energético menor que la gasolina (2/3), pero rendimiento similar.

I.2. El etanol como un aditivo de la gasolina

En el mercado de combustibles actual, el etanol, como algunos de los otros
oxigenantes y combustibles alternativos, es empleado sobre todo como un
aditivo de la gasolina convencional. Aunque los niveles bajos de etanol (del 3
al 22% de etanol) no requieren modificación alguna del motor de gasolina,
mientras que en los altos niveles de mezcla, (del 85% y 95% de etanol),
exigen la construcción de motores específicamente diseñados para tales
combustibles (Taherzadeh, 1999; Bailey, 1996).

I.3. Breve historia del etanol combustible

La idea de utilizar el etanol como combustible líquido no es nueva. En los
primeros motores de combustión interna, década de 1870, se empleaba
 indistintamente alcohol o gasolina, y por los años 1920 y 1930 se discutió
considerablemente su uso como combustible para motores (se afirma que
Ford usaba etanol como combustible en los primeros años del automóvil).
Posteriormente, la atención sobre el etanol decayó.
En la segunda mitad de la década de los 70, como una respuesta a la primera
crisis del petróleo, dos gobiernos inician el apoyo de programas para estudiar
y desarrollar combustibles alternativos de una manera económica a partir de
materias primas provenientes de la agricultura.

I.4. Tecnologías convencionales de producción de etanol

La producción de etanol por la fermentación de materias primas de origen
vegetal ricas en azucares o almidones, (granos, tallos, raíces, etc.), es una de
las técnicas más antiguas utilizadas por el hombre. Se cree que los chinos
fueron los primeros en destilar el alcohol directamente a partir del licor
fermentado de arroz, cerca del año 800 A.C.

I.5. Conversión de la sacarosa de la caña a etanol

La sacarosa, principal componente de la caña de azúcar, se descompone
Por hidrólisis en glucosa y fructosa. Estos azucares pueden ser convertidos
directamente a etanol por enzimas producidas por variedades específicas de
levaduras (saccharomyces cerevisie), y bacterias. Convencionalmente, los
pasos comprendidos en la producción de azúcar y alcohol a partir de la caña
de azúcar difieren solamente en las etapas que siguen a continuación de la
extracción del jugo de la caña, el cual puede ser, en un caso fermentado para
producir etanol, o, en otro, tratado para producir azúcar.

I.6. Composición de materiales lignocelulósicos

Compuestos principalmente de tres tipos diferentes de polímeros, celulosa,
hemicelulosa y lignina

I.6.1. Celulosa
Está conformada por subunidades de D-glucosa, unidas por b-1,4 glicosídicos
(Fengel y Wegener, 1984), monosacárido de gran importancia en la
 fermentación. La celulosa posee dos estructuras una cristalina (organizada) y
otra amorfa.

I.6.2. H
emi
cel
ulo
sa

Carbohidrato complejo y heterogéneo ya que su estructura posee diferentes

polímeros como pentosas (como xilosa y arabinosa), hexosas (como manosa,
glucosa y galactosa), azúcar y ácidos, entrelazadas entre sí
glucosídicamente(Production, n.d.)

I.6.3. Lignina
Heteropolímero amorfo que consta de tres diferentes unidades de fenilpropano
(pcoumaril, coniferil y sinapil alcohol)
que se mantienen unidos por
diferentes enlaces. El
heteropolímero amorfo no es soluble
en agua y ópticamente inactivo; todo
esto hace que la degradación de la
lignina sea muy complicada (Fengel
y Wegener, 1984).

I.7. Producción de etanol a partir de

lignocelulosas
La biomasa lignocelulosa
corresponde a las hojas y el tallo de las plantas. Esta parte de las plantas no
es comestible y tiene usualmente un valor mucho menor. Esto es muy
significativo: por ejemplo, donde un acre de caña de azúcar produce cerca de
10 toneladas de azúcar comestible y tres toneladas de melaza, también
produce (en la forma de hojas y tallos) de 20 a 25 toneladas adicionales de
materiales no comestibles. La biomasa lignocelulósica también se refiere a
cultivos de pastos y de árboles para propósitos energéticos, residuos de
madera, pulpa de papel, e incluso algunos residuos municipales(Ch & Herrera,
n.d.)
I.8. Procesamiento de los materiales lignocelulósicos
 La fermentación tradicional convierte la glucosa en etanol, pero en el caso de
los materiales lignocelulósicos, la celulosa debe ser primero convertida a
azúcares simples por hidrólisis y entonces fermentada para producir etanol.
Debido a esto, la materia prima lignocelulósica debe ser procesada
Por las etapas que se muestran a continuación:
1. Preparación del material lignocelulósico.
2. Pre-tratamiento (fraccionamiento de las hemicelulosas y parte de la lignina).
3. Purificación del hidrolizado (si es necesario).
4. Hidrólisis principal (fraccionamiento de la celulosa).
5. Purificación del hidrolizado (si es necesario).
6. Fermentación.
7. Recuperación del etanol.

I.8.1. Preparación del material lignocelulósico

Los residuos lignocelulósicos, después de colectados, deben ser procesados
adecuadamente, mediante la reducción del tamaño por procesos de cortado
y/o molido y posteriormente lavado, si fuera necesario.

I.8.2. Pre-tratamientos del material lignocelulósico

Para la utilización de los carbohidratos que constituyen la biomasa es
necesario el rompimiento de la estructura lignocelulósica, a través de un pre-
tratamiento, con el fin de separar la fracción hemicelulósica, rica en xilosa y
parte de la lignina. El pre-tratamiento de los materiales lignocelulósicos es una
etapa muy importante para mejorar la eficiencia del proceso de
fraccionamiento de la celulosa, debido a ser estos materiales poco
susceptibles a ataques enzimáticos y microbianos por su composición y
estructura físico-química.

I.8.3. Purificación de hidrolizados hemicelulósicos

Posterior al proceso de pre-tratamiento o de hidrólisis de la celulosa, en
algunos casos es necesario un proceso de purificación debido a la existencia
en el hidrolizado de compuestos tóxicos que pueden afectar la fermentación
del hidrolizado a etanol, por lo que en la literatura se reportan los estudios
siguientes:
• Hidrolizados de bagazo de caña de azúcar, obtenidos por explosión a vapor,
sometidos a purificación enzimática por tratamiento con lacasa fenol oxidasa y
purificación química por el proceso overliming.

• Hidrolizados de madera pre-tratados por explosión a vapor fueron purificados

por los métodos overliming con hidróxido de calcio, lavado con agua y lavado
en dos fases con agua y acetato de etilo.

• Hidrolizados de fibras de maíz con ácido sulfúrico fueron sometidos a un

proceso de neutralización por dos variantes: tratamiento con cal y tratamiento
con resina aniónica.
 • Hidrolizados de madera blanda fueron tratados por el proceso overliming con
cenizas de madera para aumentar la fermentatividad del hidrolizado y se logró
la reducción de inhibidores furánicos y compuestos fenólicos.

I.8.4. Fraccionamiento de la celulosa

Después del tratamiento, el material se somete a una hidrólisis química o
enzimática. Los métodos químicos más empleados para convertir la celulosa a
azúcares simples son la hidrólisis ácida concentrada y diluida, ambas usando
ácido sulfúrico.
I.8.4.1. Hidrólisis ácido diluido
La hidrólisis ácida diluida se realiza en dos etapas por las diferencias que
existen entre la degradación de la celulosa y las hemicelulosas, la primera
etapa es un pre tratamiento. El fraccionamiento de la celulosa se realiza a altas
temperaturas optimizar la hidrólisis de la celulosa.
.
I.8.4.2. Hidrólisis ácido concentrado
Según Di Pardo (2003) (5) para tratar el producto lignocelulósico con el
tratamiento de hidrólisis ácido diluido, la biomasa se seca antes de la adición
del ácido sulfúrico concentrado; posteriormente, se adiciona agua para diluir el
ácido y se calienta para liberar los azúcares para producir un gel que puede ser
separado del residual sólido.

I.8.4.3. Hidrólisis enzimática

El mayor potencial para la producción de etanol de biomasa se encuentra en la
hidrólisis enzimática de la celulosa. La enzima celulosa reemplaza el ácido
sulfúrico en la etapa de hidrólisis y las temperaturas son de 30 a 50 ºC, lo cual
reduce la degradación de los azúcares.

I.8.5. Sacarificación y fermentación simultáneas

El proceso mejorado de la hidrólisis enzimática de la biomasa es la
introducción de la sacarificación y fermentación simultánea (SSF) que fue
patentado por la Oíl Company y la Universidad de Arkansas. Este esquema del
proceso reduce el número de reactores y elimina el reactor de hidrólisis.
Además, evita el problema de la inhibición asociada con las enzimas, por lo
que se lleva a cabo eficiente y económicamente.
En este esquema las enzimas celulosas y los microbios fermentativos se
combinan. Los azúcares son producidos por las enzimas y los organismos
fermentativos los convierten a etanol.

I.8.6. Utilización de microorganismos genéticamente modificados

En la actualidad se estudia el uso de microorganismos genéticamente
modificados como una alternativa tecnológica viable para la producción de
etanol, debido a que para una producción de etanol más eficiente y con menos
 costo es necesario que la levadura tradicional fermente los azúcares de cuatro
y cinco a etanol o existan otros microorganismos que lo realicen.

I.8.7. Producción de etanol de biomasa en el mundo

Actualmente están en proyecto y producción varias plantas piloto en algunos
estados de Estados Unidos y Canadá. Entre ellas se reconocen:

• La empresa Arkenol está trabajando para establecer una instalación

comercial en Río Linda, Sacramento, estado de California, una planta para el
procesamiento de paja de arroz y otros residuos Agrícolas con una producción
de etanol de 75 710 l/año (5).
• En Misión Viejo, California se montó una planta piloto con la tecnología ácido
concentrado para obtener 380 l/Bach (5).
• La empresa BCI está construyendo instalaciones en Louisiana para convertir
Bagazo en etanol por el proceso ácido diluido, aunque en el futuro esta planta
pasará a proceso enzimático (5).
• La BC International (BCI) y la Oficina de Desarrollo del Combustible (DOE)
formaron una sociedad para producir 20 millones de galones por año de etanol,
a partir de biomasa en Jenning L.A., usando hidrólisis ácido diluido, como
material bagazo de caña de azúcar y cáscara de arroz y un microorganismo
genéticamente modificado.
• La BCI presentó el proyecto de plantas para usar la tecnología de dos etapas
de ácido sulfúrico diluido con paja de arroz y maderas residuales para obtener
etanol.
• Tenher y Pacific Ocean usan ácido diluido para producir pulpa de celulosa (8).
• La Iogen tiene el proyecto de una planta piloto en Ottawa, Canadá (6).

I.8.8. Las nuevas tecnologías de fermentación

Actualmente, el etanol combustible es producido principalmente por la
fermentación batch de almidón (de maíz) o de jarabe de glucosa (de la caña de
azúcar) utilizando cepas de Saccharomyces cerevisiae o Zymomonas mobilis
como el organismo fermentativo.
La S. cerevisiae presenta un buen número de ventajas para su aplicación en la
Fermentación de biomasa. Exhibe una gran selectividad en la fermentación,
produciendo etanol prácticamente como único producto. Es conocida por su
alta tolerancia al etanol, y su habilidad para fermentar azucares a bajos niveles
de pH proporciona protección contra la contaminación bacteria. Otra ventaja
clave es su habilidad para crecer y fermentar azucares en la presencia de
hidrolizados lignocelulósicos (Picataggio et al., 1994). Sin embargo, una de las
mayores limitaciones de la S. cerevisiae es su incapacidad para fermentar la
xilosa.

I.8.9. Nuevas técnicas de control del proceso de fermentación

 Durante la fermentación los parámetros como la temperatura, viscosidad, pH,
oxígeno disuelto, nutrientes, estado metabólico de las células, contaminación
del caldo, y muchos otros, determinan y son determinados por la actividad de
los agentes presentes en el bioreactor. Las posibilidades económicas de un
proceso de producción de etanol, un producto de bajo costo y altos volúmenes
de producción, dependen en gran medida de la optimización de la eficiencia del
proceso. Para lograr esta meta, en el bioreactor, las células deben crecer en un
ambiente controlado que permita reproducir fielmente la operación del
bioreactor de una carga a otra.

II. CONCLUSIONES
• La conversión bioquímica de la biomasa lignocelulósica a etanol es una alternativa
promisoria para obtener etanol combustible.

• La utilización de materiales lignocelulósicos como residuos agrícolas y maderables

está aparejado con el desarrollo de nuevas tecnologías para aumentar la producción
de alcohol a nivel mundial. El bagazo de la caña de azúcar, subproducto de la industria
azucarera, es el material más estudiado y en segundo lugar se encuentran los
residuos de la industria del procesamiento del maíz.
• El pre tratamiento del material lignocelulósico es una etapa muy importante en el
procesamiento de la biomasa y depende del material y la tecnología a utilizar para el
fraccionamiento de la celulosa.
• La tecnología más estudiada en la actualidad para la producción de etanol de
biomasa es la hidrólisis enzimática, siendo el proceso de sacarificación y fermentación
Simultánea la alternativa más eficiente.
• La utilización de bacterias genéticamente modificadas para obtener etanol de
lignocelulósicos se está estudiando. Se han obtenido resultados importantes en la
conversión de los azúcares de 4 y 5 átomos a etanol.

III. BIBLIOGRAFIA

Ch, J. O. D., & Herrera, F. (n.d.). Producción de etanol combustible a partir de

lignocelulosas.
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223123848002. (2012).
Production, B. (n.d.). Producción de bioetanol a partir de subproductos agroindustriales
lignocelulósicos Bioethanol Production from agroindustrial lignocellulosic byproducts,
61–91.