Universidad de la Sabana

Facultad de Ingeniería
Laboratorio de Biotecnología
Chía – Cundinamarca, 31 de octubre de 2018

CURVAS DE MUERTE TÉRMICA PARA ESCHERICHIA COLI.

María Camila Córdoba Chica código: 0000122159 María Fernanda Rodríguez Martínez código: 0000079816

INTRODUCCIÓN
Cuando se quiere analizar un cultivo en un medio o condiciones determinadas, su crecimiento y desarrollo son los factores
más importantes para estudiar, ya que cada especie requiere de condiciones específicas para que estas se generen de manera
adecuada. Dentro de estas condiciones, se encuentra el pH, la temperatura, los gases respiratorios y los principales sustratos
que mejoran el crecimiento del cultivo.

Para evaluar el comportamiento que tiene un cultivo a lo largo de su proceso de vida en un medio y la afinidad que presenta
con las condiciones del ambiente, se suele hacer uso de la construcción de una curva de crecimiento, en donde se presentan
las diferentes etapas por las que debe pasar un cultivo, empezando por su adaptación hasta la fase de su muerte. De esta
manera se logra evaluar los tiempos en los que las condiciones, en especial el sustrato, toma importancia en el crecimiento
y muerte del cultivo.

OBJETIVOS
General
Realizar la curva de crecimiento y determinar los valores importantes del desarrollo de un cultivo de E. coli, encontrando
características importantes en cada etapa y relacionarlo con los datos teóricos.

Específicos
- Identificar la afinidad que tiene el sustrato con el cultivo y evaluar su consumo.

- Determinar el tiempo que tarda en realizarse el proceso de crecimiento del cultivo.

- Utilizar análisis matemático, como linealizaciones y elaboración de gráficas que permitan evaluar comportamiento de
crecimiento de E. coli.

PROCEDIMIENTO

Reactivación de la cepa a partir del banco primario

Sembrar por
Rrtirar un tubo eppendorf del Destapar el tubo bajo Flamear la boca y aislamiento la asada Incubar las cajas a
congelador a -20°C y dejar condiciones de tomar una muestra del cutivo sobre agar 37°C por 24h.
descogelar a T. ambiente. esterilidad. con asa curva BHI.

Verificar puereza
mediante coloración
Preparación de la suspensión celular en solución salina al 0.85% (p/v) de Gram.
A partir de colonias Transferir a un tubo de Homogenizar la suspensión Si la suspensión muestra menor
aisladas en agar BHI 16x150mm que contiene en vórtex y comparar con el turbidez repetir el procedimiento
tomar una muestra 10mL de sln salina al tubo 1 de McFarland hasta obtener la misma turbidez
abundante con asa 0.85% (p/v). (3x10^8 células/mL) que el tubo patrón.
curva.

Producción del inóculo.

Inocular 10mL de la suspensión de E. Coli con 90mL de caldo BHI Incubar el el erlenmeyer por 12h a 37°C y 150 Finalmente, verificar la
en un erlenmeyer de 500mL. RPM pureza mediante
coloración de Gram.
Fermentación discontinua.

Las muestras a las 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8 y 10.

Determinar la Inocular 6mL en cada uno Colocar los erlenmeyers en
Tomar una alícuota concentración de Hallar el sustrato inicial de los erlenmeyers de 250 un agitador orbital
de 2ml de medio glucosa presente en experimental mediante mL que contienen 54mL de termostatado y cultivar a
esteril el medio de cultivo. el método de DNS. caldo BHI. 37°C y 150 RPM.

Separar el sobrenandante Centrifugar el resto de Tomar 3mL de cultivo y leer la Medir el pH y realizar Retirar un erlenmeyer en
y descartar el agregado medio de la muestra absorbancia a 600nmusando coloración de Gram cada tiempo de muestreo
celular. durante 20 min a 5000g. como blanco medio esteril para cada vez que retire una equivalente a los tiempos
la determinación de biomasa. muestra. estipulados.

Realizar una segunda

centrifugación bajo las Guardar el
mismas condiciones de sobrenadante en tubos
tiempo y velocidad. falcón de 50mL a -20°C

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al realizarse las técnicas experimentales para cada realizar la curva patrón de DNS, se obtuvieron los siguientes datos; a
estos, fue necesario realizarles un rechazo de datos, para mejorar el comportamiento lineal de la gráfica, pasando de un
coeficiente de correlación de 0,92 a uno de 0,98, haciendo que al momento de utilizar la ecuación de la recta para obtener
concentraciones de sustrato el error experimental disminuyera un poco. Los datos y la gráfica se encuentran a
continuación.

Tabla 1. Datos sobre la curva patrón de DNS

Curva patrón
1
0.9
0.8 y = 0.581x - 0.0687
0.7 R² = 0.9842
Abs (540 nm)

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.5 1 1.5 2
Concentración (g/L)
Gráfica 1. curva patrón DNS
Se realizaron cultivos de E. coli los cuales fueron estudiados a diferentes tiempos, para lograr construir una curva de
crecimiento, analizando la relación que tiene el cultivo a lo largo de todas las etapas de desarrollo junto al sustrato y
además evaluar la velocidad de formación en todo el proceso. Para lograr esto se necesita graficar en primera medida una
relación concentración vs tiempo, en donde se evidencien las etapas del crecimiento del cultivo.

Tabla N°3 – Datos de biomasa a lo largo del tiempo

y = 0,564 x
Ecuación N°1- patrón de peso seco
Con la ecuación anterior, se utilizaron las absorbancias tomadas en cada uno de los tiempos y mediante la ecuación 1. Es
posible calcular la concentración de biomasa, donde la absorbancia corresponde al valor de “y”, al conocer este valor, es
posible despejar “x”, con lo que se hallaría la concentración de biomasa en términos de (g/L) y posteriormente es posible
realizar la construcción de la curva de crecimiento.

Curva de crecimiento E. coli

0.9
0.8
0.7
Concentración (g/L)

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5
Tiempo (h)
Gráfico N°3- Curva de crecimiento E. coli

Luego de tener la curva de crecimiento, se debe tomar la región que representa la fase exponencial del cultivo, siendo esta la que se
representa con el segmento de pendiente positiva y con este, realizar la linealización de la concentración, para luego identificar el
valor de la velocidad de formación (𝜇 máx.), encontrándose a partir de la ecuación de la recta que representa la fase exponencial. Los
datos de esta región se encuentran a continuación.

Tabla N°4 – Datos de la etapa exponencial

del cultivo E. coli
 Fase exponencial
1

0.8 y = 0.4529x - 0.0461

Concentración (g/L)
R² = 0.9957
0.6

0.4

0.2

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Tiempo (h)
Gráfica N°4 – Etapa exponencial del cultivo y ecuación de la recta
Según la teoría de crecimiento de cultivos, se dice que la máx., corresponde a la pendiente hallada en la ecuación
de la recta de la región de la fase estacionaria, por lo tanto, se tiene que:
máx. = 0,4529
Al obtener el máx. con la pendiente, se puede proceder a obtener el tiempo de duplicación, este valor representa el
tiempo que trascurre la formación de dos células a partir de una célula. Este valor para E. coli se reporta con
aproximadamente 20 minutos y experimentalmente se tiene cercano a 90 minutos. [1]
𝐿𝑛2
td = = 1,5304 h
µmáx
Esta diferencia, puede explicarse desde la curva de crecimiento y un análisis matemático. En primer lugar en esta curva
tuvo que realizarse rechazo de datos, además de que no se tomó la absorbancia en todas las horas indicadas, por lo que
se obtuvo una menor cantidad de puntos en la gráfica con respecto al sustrato, de esta manera al tomar la fase
exponencial, solo se tenían tres puntos, por lo que era probable que con tres punto se tuviera un comportamiento lineal,
como se observa en la gráfica N°4, por lo que no fue necesario realizar una linealización, pues el factor de correlación
(R^2) fue alrededor de 0,99, con lo que se obtuvo la ecuación de la recta y se halló el máx y con este con este, el tiempo
de duplicación; por lo tanto, al faltarle datos a la curva de crecimiento, pues lo ideal hubiese sido que fueran 9 tiempos,
pero en este caso sólo se graficaron 5 tiempos, el comportamiento no se evidenció por completo, afectando el resultado
al hallar el tiempo de duplicación, teniendo un error del 77,7% con respecto al teórico, pues E. coli suele ser un
microorganismo que crece mucho más rápido, pues al cabo de una hora, se estima que ya se han conseguido alrededor
de 3 generaciones de la cepa, gracias a la duplicación.

Mediante la metodología del DNS fue posible determino la cantidad de sustrato de los extractos obtenidos en el cultivo
en los diferentes tiempos de evaluación como se puede ver en la tabla N° 5. Con los datos correspondiente a la biomasa
producida y el sustrato residual se realizó una gráfica para representar su comportamiento.

Tabla N°5-Concentración de sustrato residual y consumido.

Consumo
Absorbancia Sustrato
Tiempo (h) de sustrato
540nm residual (g/L)
(g/L)
0 0.97 1.738 0.262
0.5 0.731 1.327 0.673
1 0.729 1.323 0.677
1.5 0.726 1.318 0.682
2 0.695 1.265 0.735
4 0.295 0.576 1.424
6 0.046 0.148 1.852
8 0.043 0.143 1.857
 Curva de crecimiento E. coli
2

Concentración (g/L)
1.5

0.5

0
0 2 4 6 8 10
Tiempo (h)

Biomasa Sustrato

Gráfica N°5-Formación de biomasa y sustrato residual

Gráfica N°6- Curva de crecimiento de E. coli teórica.

Como se puede ver en la gráfica N°5 la formación de la biomasa se da a medida que el sustrato se va consumiendo, en
cuanto a la curva de crecimiento para E. coli puede verse que duró 30 minutos en la fase de transición o lag, lo cual
teóricamente debería ser hasta alcanzar los 90 minutos y así entrar en la fase de crecimiento exponencial donde debería
durar hasta el tiempo 210 minutos mientras que en los datos experimentales toma un tiempo de 120 minutos para
terminar la fase exponencial, con esto se determina un error relativo del 43%. Como se puede observar en la gráfica N°6,
los datos obtenidos en el laboratorio son distintos a los reportados en la teoría ya que cada fase comienza antes de lo
reportado, pero su comportamiento se presenta como el reportado en la teoría, no es posible realizar una comparación
acertada de los datos obtenidos debido a que no se tienen la totalidad de este, experimentalmente se reportan valores
hasta un tiempo de 4h. [2]

Finalmente se calcula un rendimiento biomasa/sustrato, Yx/s=0.58 g/g el cual especifica cuántos gramos de biomasa se
producen por gramo de sustrato consumido.

CONCLUSIONES

- La curva de crecimiento necesita de análisis matemático, por lo que la exactitud y precisión a la hora de realizar la
práctica, es de suma importancia para que la obtención de valores como el tiempo de duplicación, se dé de manera óptima,
cuidando que los factores ambientales y del medio de cultivo, también sean los propicios según el microorganismo.
- Los datos teóricos con los experimentales distan en cuanto a los tiempos que hay entre el inicio y final de las fases en la
curva de crecimiento, para el caso de la fase exponencial se determina un error relativo del 43%, fue posible determinar
el tiempo de duplicación celular el cual fue de 91 min con un error del 77%, por esto se concluye que no se tuvieron datos
precisos ni exactos.

REFERENCIAS

[1] Dr. Pedro F. Mateos, Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia. Universidad de Salamanca,
(2007), “crecimiento microbiano”; recuperado (28/10/2018)

[2] Ramírez, J. Contreras, G. Gómez, M. (2005). La fase estacionaria en la bacteria Escherichia coli. Revista Latinoamericana
de microbiología. Recuperado el 28 de octubre de 2018 en http://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2005/mi05-
3_4f.pdf