LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GENERAL. ​3FV2.

SECCIÓN 1
Galicia Ornelas, Bryan & Meza Castrejón, G. Jesus
Práctica: Determinación de la actividad de SDH y sistema de citocromos y citocromo oxidasa.🐈

Introducción 6 min + ++ ++ +++ + ++ ++ ++

La enzima succinato deshidrogenasa pertenece a la
clase óxido-reductasa. Es una flavoenzima encargada 8 min + ++ ++ ++++ ++ ++ ++++ ++

de la oxidación de succinato en fumarato, que

10min + ++ ++ ++++ ++ +++ ++++ +++
transporta un grupo hemo que funciona como parte del
sistema citocromo b y constituye el ejemplo más A mayor número de (+) mayor de decoloración presentada.
característico de sistema enzimático que no precisa de Discusión
la colaboración de alguna coenzima de la serie La enzima succionato deshidrogensa “SDH” (1.3.99.1)
nicotinamídica (NAD y NADP)​1​. cataliza la reacción de conversión del succinato a
La enzima citocromo oxidasa pertenece a la clase fumarato obteniendo de esta manera FAD reducido.​1
óxido-reductasa, son las principales responsables de El azul de metileno es un identificador característico
la generación de ATP por la vía de transporte de que se encuentra oxidado y al decolorarse se reduce y
electrones. Está formada por un dímero que se por tanto identifica la actividad de la SDH. En el tubo 1
extiende desde la matriz hasta el espacio obtenemos un alto grado de decoloración, ya que no
intermembrana o el citosol, atravesando la membrana​2​. contiene inhibidor de la actividad enzimática, malonato
Objetivos de sodio. El testigo negativo que es el tubo 2 mantiene
-Identificar la presencia del sistema de citocromos y su una coloración azul pues en este no se agregó enzima.
oxidasa, y el efecto de inhibidores sobre la cadena El tubo 3 presentó decoloración ligera debido a la
transportadora de electrones. presencia de poco sustrato, ya que en este tubo no se
-Evaluar la actividad de la succinato deshidrogenasa adiciona succinato de sodio. El tubo 4 contiene una
en la fracción mitocondrial de hígado de rata en mayor cantidad de malonato, esto nos da una
presencia y en ausencia de un inhibidor competitivo. coloración verde-azul, decrementando la reacción.
Resultados Para el tubo 5 y 6 al disminuir la cantidad de inhibidor,
Tabla 1. Lecturas de decoloración en tubos. Actividad de SDH respectivamente se obtiene una decoloración mayor,
pues la enzima puede realizar su actividad con el
Tubo 1 2 3 4 5 6 7
succinato sin que el malonato interfiera en mayor
2 min + + - + + + + media. En el tubo 7 se obtiene la mayor decoloración
de la prueba, esto es por la presencia del succinato,
4 min ++ + - + + ++ ++
que es el sustrato de la enzima. En todos los tubos se
6 min +++ + - + ++ +++ +++ añadió aceite para así impedir la interacción del
oxígeno del ambiente y el azul de metileno.​3,4 ​(Fig. 1.1
8 min +++ + - + ++ ++++ ++++
y 1.2).
++++ ++ - + ++ +++++ +++++
Con respecto a la actividad de la citocromo
10 min
oxidasa (​1.9.3.1)​, se utilizó KCN como inhibidor. El
15 min ++++ +++ - + +++ ++++++ ++++++ cianuro de potasio se enlaza covalentemente con el
complejo IV impidiendo la función de la cadena
20 min ++++ +++ - + +++ ++++++ ++++++
respiratoria. En este experimento no se utiliza aceite
Mayor decoloración presentada (+). No hubo coloración (-) dado que el oxígeno es reducido en el complejo IV
Tabla 2. Lecturas de decoloración en tubos. Actividad del
para obtener H​2​O​5​. (Fig. 2.1 y 2.2).
sistema de citocromos y citocromo oxidasa
Se utilizó N,N-p-dimetilfenildiamina como donador
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 artificial de electrones. Éste reemplaza al succinato y
+ + + + + + +
al NADH, y se mide la decoloración respecto al tiempo.
1 min
En el tubo 1, se considera como testigo positivo,
2 min + + + ++ + + + + obteniendo un color oscuro, pues contiene el extracto
crudo de SDH-CIT y el donador artificial. El tubo 2,
4 min + + ++ ++ + + ++ +
también se utilizó como testigo negativo, debido a que
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Galicia Ornelas, Bryan & Meza Castrejón, G. Jesus
Práctica: Determinación de la actividad de SDH y sistema de citocromos y citocromo oxidasa.🐈

no contiene SDH-CIT, obteniendo así un color azul, 4. Stryer L. (2008) “Bioquímica” Editorial Reverte.
causa de la oxidación espontánea del donador e-. En Mexico. España. pp. 698-700
el tubo 3 hubo una baja actividad por la presencia del 5. Vejar I. (2005) “Prácticas de Bioquímica
inhibidor KCN, que es de tipo irreversible y no permite descriptiva” Textos Académicos. Universidad
el transporte de electrones dando un color azul de Sonora. Mexico.
intenso. El tubo 4, no presentó coloración debido a que 6. Sierra, I. (28 de junio de 2013). ​Practica
sólo contenía agua y SDH-CIT, al no contener el grupo transporte de cargas 7.​ Url:
donador de electrones, ésta reacción no procede. http://es.slideshare.net/ingridjohanasierramejia/
Desde el tubo 5 al 8, se adicionó α-naftol. Se obtiene practica-transporte-de-cargas-7
un compuesto llamado azul de indofenol, el inhibidor Anexo​:
es aquí donde se une covalentemente y el
N,N-dimetilfenildiamina se oxida. En el tubo 5 hay una
reacción inmediata con la enzima y el grupo donador.
El tubo 6 al no contener la SDH-CIT, genera que no
haya reacción, la poca coloración presentada en este
tubo es causa de la oxidación directa del grupo
Imagen 1.1 Coloración de los tubos con deshidrogenasa
donador. Para el caso del tubo 7, la presencia de succínica antes del calentamiento
inhibidor influye en el complejo IV y no hay reacción.
En el tubo 8, no hay reacción debido a la ausencia del
SDH-CIT y la coloración es debido a la oxidación de la
N,N-p-dimetilparafenildiamina​6​.
Conclusiones
La actividad enzimática de las óxido-reductasas es
Imagen 1.2: Coloración de los tubos con deshidrogenasa
afectada por la presencia o ausencia de diferentes succínica después del calentamiento
elementos, entre los que se encuentran el sustrato, el
cofactor e inhibidores.
Se pudo visualizar la actividad enzimática gracias a la
presencia del identificador, en caso de la SDH, azul
de metileno, el cual se reduce debido a los reductores Imagen 2.1 Tubos al inicio de la reacción del sistema de
producidos en la reacción catalizada por esas citocromos.
enzimas. Para el caso de la citocromo oxidasa,
coloración es ocasionada porque la fenilendiamina se
oxida.
Bibliografía
1. Alvarado et.al. (2008). ​BIOQUIMICA II. Url:
http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.com.mx/
media/users/10/523320/files/51871/Ma​.
2. Jenner Us Martin. (2014). Oxidorreductasa. Url: Imagen 2.2 Coloración de los tubos con citocromo, y
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz1 citocromo oxidasa después del calentamiento
3.htm#c1
3. BRENDA. (2015). ​Información sobre EC
1.3.99.1 - succinato deshidrogenasa. Url:
http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?e
cno=1.3.99.1&Suchword=succinato+deshidroge
nasa&organism%5B%5D=#INHIBITORS