UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN

MARCOS

INFORME N° 5:
CROMATOGRAFÍA DE COMPUESTOS ORGÁNICOS

EXPERIENCIA

elaborada en el curso de Laboratorio de Química Orgánica

MESA:

Grupo 3

HORARIO:

Miércoles 2-4 pm

PROFESOR
Mg. Q.F. Walter Rivas Altez

LIMA – PERÚ
2019
1. INTRODUCCION.

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización

de mezclas complejas, para lo cual tiene diferentes aplicaciones en la rama

de las ciencias e ingenierías. Es un conjunto de técnicas basadas en el

principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos

componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las

cantidades de dichos componentes. Deferencias sutiles es el coeficiente de

partición de los compuestos da como resultado una retención diferencial

sobre la fase estacionaria y por lo tanto una separación electiva en funcion

de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen

mutuamente:

- Separar los componentes de la mezcla, para obtener su pureza y que

puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).

- Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad

analítica). En este caso, las cantidades del material empleadas son

pequeñas.
 2. MARCO TEORICO.

CROMATOGRAFIA

 ¿En qué consiste?

La cromatografía comprende un conjunto de

técnicas que tienen como finalidad la
separación de mezclas basándose en la
diferente capacidad de interacción de cada
componente en otra sustancia. De forma
general, consiste en pasar una fase móvil
(una muestra constituida por una mezcla que
contiene el compuesto deseado en el
disolvente) a través de una fase estacionaria
fija sólida.

La fase estacionaria retrasa el paso de los

componentes de la muestra, de forma que los
componentes la atraviesan a diferentes velocidades y se separan en el tiempo.
Cada uno de los componentes de la mezcla presenta un tiempo característico de
paso por el sistema, denominado tiempo de retención. Cuando el tiempo de
retención del compuesto deseado difiere del de los otros componentes de la
mezcla, éste se puede separar mediante la separación cromatográfica.

La separación de los diferentes componentes de una mezcla que se encuentran

en un líquido o gas es el resultado de las diferentes interacciones de los solutos a
medida que se desplazan alrededor o sobre una sustancia líquida o sólida (la fase
estacionaria). Las diversas técnicas para la separación de mezclas complejas se
fundamentan en la diversidad de afinidades de las substancias por un medio móvil
gas o líquido y un medio absorbente estacionario (papel, gelatina, alúmina o sílice)
a través del cual circulan.
 ¿Por qué se separan los componentes?

Dejamos que se mueva la mezcla por un soporte y los componentes se separan

por que se mueven a diferentes velocidades, debido a las diferentes fuerzas de
adsorción que ejerce el soporte sobre cada elemento, así de fácil. Si no nos
hemos equivocado es adsorción, que puede confundirse con absorción pero no es
lo mismo. Vamos a explicarlo.

La absorción es cuando una sustancia se introduce en la estructura de otra.

Ejemplo: una esponja absorbe agua, entonces si cortamos la esponja en pedazos
vamos a encontrar agua en todas partes de la estructura de la esponja.

La adsorción es un fenómeno superficial, la sustancia adsorbida no se introduce

en el volumen del cuerpo, sino solo se adhiere a la superficie.

¿Para qué se utiliza la Cromatografía?

La cromatografía se utiliza para lograr la separación de los componentes de una

mezcla como para medir la proporción de cada elemento en la mezcla.

Fases de la cromatografía

Las cromatografías se hacen en dos fases. Una estática y otra móvil.

En la fase estática o estacionaria, la mezcla se coloca sobre un soporte fijo, por

ejemplo papel. En esta fase tenemos ya la mezcla sobre un soporte, en nuestro
ejemplo un papel.

En la fase móvil se hace mover otra sustancia sobre la mezcla que ya está sobre
el soporte de la fase estática, por ejemplo un líquido que se mueve por el papel
con la mezcla. En la fase móvil empezará el proceso de separación de los
componentes de la mezcla al moverse a distintas velocidades por el líquido los
distintos componentes de la mezcla sobre el papel.

 Tipos de Cromatografía
Aunque hay muchas y variadas técnicas cromatografías, el objetivo de todas es
separar las sustancias que forman una mezcla y enviarlas secuencialmente a un
detector para que las determine y cuantifique. Todas se basan en el mismo
fenómeno: permitir que las sustancias que forman una mezcla entren en contacto
con dos fases (un líquido y un gas, un sólido y un líquido, etc.). Una de las fases
es estática (no se mueve) y tenderá a retener las sustancias en mayor o menor
grado; la otra, fase móvil, tenderá a arrastrarlas. Cada sustancia química tiene
distinta tendencia a ser retenida y a ser arrastrada. Dependiendo de la naturaleza
de la fase estática y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de
cromatografía

a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estática o estacionaria es un sólido y la

móvil un líquido.

b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estática o estacionaria es un líquido

anclado a un soporte sólido.

c) Cromatografía líquido-gas. La fase estática o estacionaria es un líquido no

volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.

d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.

Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla

y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre:

a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de

adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.

b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de

solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que
son ambas líquidas.

c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que lleva

anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por
aquellos iones presentes en la fase móvil.
  TECNICAS DE SEPARACIÓN
La cromatografía y métodos de separación clásicos se basa en la separación de
componentes de una muestra. Estas técnicas no son de caracterización
propiamente dicha; las propiedades de los materiales dependen de los
componentes y de la proporción existente entre ellos.

Estas técnicas no dan información de la naturaleza de los componentes, para eso

se necesitan otros métodos de análisis.

Mecanismos de Separación

a) Separación por adsorción (cromatografía de adsorción):

Diferente afinidad de los componentes de la muestra sobre la superficie de un
sólido activo (componentes con polaridad baja o media).
b) Separación por reparto (cromatografía de reparto):
Diferente solubilidad en fases estacionaria y móvil (Componentes con
polaridad media o alta).
c) Separación por tamaño molecular (Cromatografía de permeación de gel,
de tamiz molecular o de exclusión por tamaños):
Parámetros de columna
-Intervalo de trabajo: intervalo de M que pueden ser separados.
- Límite de exclusión: M mínimo a partir del cual las macromoléculas no
experimentan retención.

Las moléculas pequeñas penetran en los poros de las partículas de gel, por lo que
necesitan más tiempo para salir al final de la columna. Las moléculas grandes, en
cambio, al no penetrar en las partículas de gel se mueven con el disolvente a una
velocidad mayor de elución y salen antes de la columna. Por tanto, a mayor masa
molecular menor tiempo de elución. Este método permite separar por tamaños
moleculares siendo posible obtener incluso distribuciones de masas moleculares.

d) Separación por Intercambio iónico

La separación se basa principalmente en la diferente afinidad para el
intercambio de iones de los componentes de la muestra.
Las especies cargadas negativamente se unen a la matriz sólida cargada
positivamente y son retenidas, mientras que las especies positivas son
rechazadas. De esta manera en función de la carga las especies se eluyen a
distintos tiempos dando lugar a la correspondiente separación. La elución de las
especies retenidas se consigue cambiando el pH del disolvente.
 Métodos de análisis cromatográfica
a) Análisis por desarrollo (cromatografía en papel o capa fina).
b) Análisis por elución (cromatografía de gases, cromatografía líquida).
c) Análisis frontal.
d) Análisis por desplazamiento
ANÁLISIS POR ELUCIÓN
 ANÁLISIS POR DESARROLLO

 Clasificación de acuerdo con la forma del lecho cromatográfica

a) Cromatografía en columna.
a. Columna empaquetada.
b. Columna tubular abierta.
b) Cromatografía plana (o de lecho abierto).
a. Cromatografía en papel.
b. Cromatografía en capa fina (TLC).
  Clasificación de acuerdo con el estado físico de la fase móvil
a) Técnicas cromatográficos.
a. GLC
b. GSC
c. LLC
d. LSC
b) Cromatografía de gases (siempre en columna).

c) Cromatografía Líquida (en columna o sobre plano).

a. Cromatografía Líquida de Alta Eficacia o de Alta Presión, HPLC.

d) Cromatografía con fluido supercrítico.

 Técnicas especiales

a) Cromatografía con fase invertida

b) Cromatografía con fase normal
c) Análisis isocrático (composición F. móvil constante)
d) Elución con gradiente (Composición F. móvil cambia de forma continua)
e) Elución en etapas o escalonada (Composición F. móvil cambia de forma
escalonada)
f) Cromatografía bidimensional (etapas adicionales de separación)

CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA

La cromatografía en capa fina (en inglés thin layer chromatography o TLC) es

una técnica analítica rápida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de
Química Orgánica. Entre otras cosas permite:
- Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así,
por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación.
- Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser
idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma
sustancia.
- Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo
desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es
lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado. La muestra a analizar se
deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que
previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase
estacionaria). Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que
contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente o fase móvil). A medida
que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a través del adsorbente,
se produce un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra
entre el disolvente y el adsorbente.

 Absorbentes y eluyentes

Los dos adsorbentes (fase estacionaria) más ampliamente utilizados son la gel
de sílice (SiO2) y la alúmina (Al2O3), ambas de carácter polar. La alúmina
anhidra es el más activo de los dos, es decir, es el que retiene con más fuerza
a los compuestos; por ello se utiliza para separar compuestos relativamente
apolares (hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y cetonas). El gel
de sílice, por el contrario, se utiliza para separar sustancias más polares
(alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos). El proceso de adsorción se debe a
interacciones intermoleculares de tipo dipolo-dipolo o enlaces de hidrógeno
entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las
sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de
descomposición. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante
interacción dipolo-dipolo o mediante enlace de hidrógeno si lo presentan. El
orden de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de
la fase móvil o eluyente.

El eluyente puede ser un disolvente único o dos miscibles de distinta polaridad.

En el siguiente recuadro se recoge por orden creciente de fuerza eluyente los
disolventes más comúnmente empleados.

Hexano < tetraclorometano < cloroformo < diclorometano < acetato de

etilo < acetona < 2-propanol < metanol < agua

En general, estos disolventes se caracterizan por tener bajos puntos de

ebullición y viscosidad, lo que les permite moverse con rapidez. Raramente se
emplea un disolvente más polar que el metanol. Usualmente se emplea una
mezcla de dos disolventes en proporción variable; la polaridad de la mezcla
será el valor promediado en función de la cantidad de cada disolvente
empleada. El eluyente idóneo para cada caso ha de encontrarse por "el
método del ensayo y del error".

 Determinación de Rf

La retención se puede explicar en base a la competencia que se establece

entre el soluto a separar y la fase móvil por adsorberse a los centros
activos polares de la fase estacionaria. Así, las moléculas de soluto se
encuentran adsorbidas en la fase estacionaria y a medida que se produce
la elución van siendo desplazadas por la fase móvil. La retención y la
 selectividad en la separación dependen de los valores respectivos de las
constantes de los diferentes equilibrios químicos que tienen lugar, que
están en función de:
- la polaridad del compuesto, determinada por el número y naturaleza de
los grupos funcionales presentes. Los solutos más polares quedarán más
retenidos puesto que se adsorben más firmemente a los centros activos de
la fase estacionaria, mientras que los no polares se eludirán con mayor
facilidad.
- naturaleza del disolvente. Así, para un mismo compuesto, un aumento en
la polaridad del disolvente facilita su desplazamiento en la placa.

La relación entre las distancias recorridas por el soluto y por el eluyente desde
el origen de la placa se conoce como Rf, y tiene un valor constante para cada
compuesto en unas condiciones cromatográficos determinadas (adsorbente,
disolvente, tamaño de la cubeta, temperatura, etc.). Debido a que es
prácticamente imposible reproducir exactamente las condiciones
experimentales, la comparación de una muestra con otra debe realizarse
eluyendo ambas en la misma placa.
Para calcular el Rf se aplica la siguiente expresión:
La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha.
Si ésta es excesivamente grande se obtendrá un valor erróneo del Rf. Se
recomienda elegir un eluyente en el que los componentes de la mezcla
presenten un Rf medio entorno a 0.3-0.5. Para compuestos poco polares, se
debe utilizar un disolvente apolar como el hexano. En el caso de compuestos
con polaridad media, se aconseja utilizar mezclas hexano/acetato de etilo en
distintas proporciones. Los productos más polares, requieren disolventes más
polares como mezclas de diclorometano/metanol en distintas proporciones.

 Revelado de las placas

La mayor parte de las placas de cromatografía llevan un indicador fluorescente

que permite la visualización de los compuestos activos a la luz ultravioleta (254
nm). El indicador absorbe la luz UV y emite luz visible. La presencia de un
compuesto activo en el UV evita que el indicador absorba la luz en la zona en
la que se encuentra el producto, y el resultado es la visualización de una
mancha en la placa que indica la presencia de un compuesto.
En el caso de compuestos que no absorben luz UV, la visualización (o
revelado) del cronograma requiere utilizar un agente revelador. Este tiene que
reaccionar con los productos adsorbidos proporcionando compuestos
coloreados.

3. COMPETENCIAS.
- Conocer la técnica de la cromatografía para la separación mezclas de
sustancias, características y los factores que en ella intervienen.
- Estudiar la incidencia del coeficiente de reparto entre la fase móvil y la
fase estacionaria.
- Analizar la influencia del solvente en la separación cromatografía.
3. MATERIALES

a) Tubo de prueba
c) Mechero

a) Beaker

d) Trípode

e) Portaobjeto

b) Capilares

f) Papel filtro
 i) Cámara de revelado

g) Silica gel G Actividad

h) Rejilla
h. lapiz
4. PARTE EXPERIMENTAL

Utilizando la muestra de la práctica anterior y usando de soporte el silicagel G

activado, el sistema de solvente Bz – AcOEt y vapores de Yodo metálico como

reveladores, marcamos 1 cm del borde inferior del portaobjeto dos puntos de

igual distancia con un lápiz. Con un capilar aplicamos el colesterol y la muestra

patrón de identificación, unas tres o cinco veces. Luego, introducimos el

cromatográma en la cámara de saturación, el cual contiene 2Ml del sistema de

solvente. Antes de llegar al borde superior, quitamos el solvente de la cámara y

marcamos el frente. Por último, se dejó secar y revelar con los vapores de

yodo.

Fig. 1. Revelación con los vapores de yodo. Fig. 2. Calentamiento del portaobjetos.
5. CONCLUSIONES.

La cromatografía de capa fina (TLC) es una técnica muy simple, que

presenta una gran utilidad en separaciones de compuestos para llevar a
cabo un análisis cualitativo.
Resulta particularmente útil en la separación de colorantes, ya que al
tratarse de sustancias detectables a simple vista, no se necesita una etapa
extra de revelado de manchas.
Dado que la cuantificación de los compuestos separados por TLC presenta
una dificultad notable, los resultados obtenidos por esta técnica pueden
emplearse como etapa previa a un estudio por HPLC.

6. RESULTADOS.

Que precauciones debió tener en cuenta durante el desarrollo del

cromatograma:
Al romper el capilar se debió hacer por el centro de este tubo y una
adecuada exposición al fuego del mechero.
La expansión del silicagel en el porta objeto debe ser fino y homogéneo.

Que debe tener en cuenta para que la muestra pueda ser aplicada en la
cromatografía.
Haber hecho las marcas respectivas, para lograr los cálculos de las
distancias recorridas.
Con respecto al trato que se le debe hacer a la placa , pues una vez ya
absorbida, entonces debemos manipularla con cuidado, evitando que se
contamine.

Que precauciones se debe tener en cuenta durante el sembrado de las

muestras en el cromatofolio.

Mantener la distancia prudente para que el líquido revelador logre su

objetivo.

El Rf de la muestra de la cromatografía en capa fina es:

No se concluyó el experimento para examinarlas las particulares distancias.
 Podemos decir en conclusión que:
La cromatografía en capa fina es una técnica simple, que presenta una gran
utilidad en separaciones de compuestos para llevar a cabo un análisis
cualitativo.
Es útil en la separación de colorantes, puesto que se detectan a simple
vista y no se requiere de una etapa de revelado.

7. CUESTIONARIO.

7.1. ¿Qué es una serie eluotropica?

Una serie eluotrópica es un listado de diferentes s compuestos ordenados

según su poder de elución para un adsorbente dado. Tales series son útiles
para determinar los disolventes necesarios en la cromatografía de una
mezcla de compuestos químicos. Normalmente tales series comienzan con
disolventes no-polares, como el n-hexano, y finalizan en disolventes polares
como metanol o agua. El orden de disolventes en una serie eluotrópica
depende a la vez de la fase estacionaria así como del compuesto empleado
para determinar el orden.

7.2. Mencione las aplicaciones de la HPLC y la cromatografía

de gases (GC).

Algunas aplicaciones de la Cromatografía líquida de alta performance

(HPLC) son:
- Separación y purificación de metabolitos.
- Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de
muestras de orina.
- Purificación y separación de enantiómeros.
- Purificación de compuestos naturales.
 - Purificación y caracterización de enzimas y proteínas.
Aplicaciones de la Cromatografía de gases (GC) son:
- Medioambientales: Análisis de pesticidas y herbicidas, análisis de
hidrocarburos, semivolátiles y volátiles, análisis del aire...
- Alimentos y aromas: Análisis de fragancias y aromas, aceites, bebidas,
ácidos orgánicos, azúcares, FAMES, ésteres metílicos, triglicéridos,
alcoholes...
- Química Industrial: Análisis de alcoholes, ácidos orgánicos, aminas,
aldehídos y cetonas, ésteres y glicoles, hidrocarburos, disolventes, anilinas,
gases inorgánicos...
- Biociencia: Análisis de drogas, fármacos, alcoholes y contaminantes en
sangre, disolventes residuales...
- Derivadas del petróleo: Análisis de gas natural, gases permanentes, gas
de refinería, gasolinas, gasóleos, parafinas.

7.3. Diga que es la electroforesis y cuál es su fundamento.

La electroforesis es una técnica analítica de separación de moléculas en

función de su carga eléctrica neta. Se entiende por carga eléctrica neta de
una molécula a la suma de las cargas, positivas y negativas, de sus grupos
ionizables.
Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio con moléculas cargadas,
éstas se desplazarán hacia los electrodos en función de su carga. Las
moléculas cargadas negativamente, aniones, se desplazan hacia el
electrodo positivo, el ánodo. Por otra parte, las moléculas cargadas
positivamente, cationes, se desplazan hacia el electrodo negativo, el
cátodo.
En un sistema electroforético actúan dos fuerzas opuestas sobre cada una
de las moléculas cargadas. Una de ellas es la fuerza debida al campo
eléctrico que se le aplica al sistema. La otra es la fuerza de resistencia que
ejerce el medio sobre la molécula.
 La resultante de ambas fuerzas determinará el movimiento de la molécula,
a una velocidad constante. La velocidad es directamente proporcional a la
carga de la molécula e inversamente proporcional a su tamaño y a la
viscosidad del medio.

7.4. Diga Usted que métodos cromatográficos se podrían

aplicar en su carrera profesional. Explique cada uno.

Cromatografía de exclusión molecular

La cromatografía de exclusión molecular (Size Exclusión Chromatography,
SEC) es el nombre general para los procesos de separación de
biomoléculas de acuerdo a su tamaño cuando una solución fluye a través
de una cama empacada con un medio poroso. Para la separación se
utilizan las propiedades de tamiz molecular de una variedad de materiales
porosos. El proceso de separación depende del tamaño y el volumen
hidrodinámico (volumen que ocupa una molécula en solución), el cual
define la capacidad de la molécula de penetrar o no en los poros de la fase
estacionaria. De tal forma que, las moléculas de alto peso molecular son
excluidas de los poros debido a un efecto estérico y pasan rápidamente a
través de la matriz (ver Fig. 1). En el caso de biomoléculas pequeñas, estas
tienen diferente accesibilidad en las cavidades de la matriz porosa.
Cromatografía de intercambio iónico.
Separa las moléculas en base a su carga iónica neta. La separación se
lleva a cabo por la competencia entre proteínas con diferente carga
superficial por grupos cargados opuestamente sobre un adsorbente o una
matriz de intercambio icónico. Actualmente, IEC es una de las técnicas de
purificación de proteínas más usadas. En una separación utilizando IEC, las
interacciones hidrofóbicas reversibles entre los solutos son controladas con
el objetivo de favorecer la unión o elución de moléculas específicas
logrando su separación.
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).
Es uno de los métodos de purificación de macromoléculas biológicas más
utilizado, especialmente para proteínas terapéuticas. La HIC explota la
interacción reversible entre la superficie hidrofóbica de una proteína y una
matriz cromatográfica con un ligando hidrofóbico a moderadamente altas
concentraciones de sal, como el sulfato de amonio. Este tipo de sales tiene
alta polaridad y se unen fuertemente al agua, lo cual induce la exclusión del
agua sobre la proteína y la superficie del ligando lo que promueve las
interacciones hidrofóbicas y la precipitación de la proteína.
Cromatografía de fase reversa
La cromatografía de fase reversa (Reversed Phase Chromatography, RPC)
describe un tipo de cromatografía en la cual la fase estacionaria es menos
polar que la fase móvil. La RPC es una técnica de purificación capaz de
separar componentes con características muy similares, como proteínas
que difieren en solo un aminoácido e isómeros conformacionales de
péptidos. Sin embargo, el valor de la RPC puede estar limitado por diversos
factores, como el uso de solventes y su disposición final así como a los
bajos porcentajes de recuperación debidos a los cambios conformacionales
ocasionados por las interacciones envueltas en el proceso.
La asociación de una molécula con la fase estacionaria puede ocurrir tanto
por partición como por adsorción. Los mecanismos de adsorción están
basados en la teoría de Melander y Horvath (Horvath y Melander 1977),
que establece que la retención en RPC surge de la unión de las moléculas
en la fase estacionaria y se debe principalmente al resultado de las
interacciones hidrofóbicas entre el soluto y la fase móvil.
8. REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS.

1. Que es la cromatografía y que tipos existen. centros estudios cervantinos

(2018).
https://www.centroestudioscervantinos.es/que-es-la-cromatografia/
2. Cromatografía liquida de alta eficacia (2017).
PDFwww.mncn.csic.es › es_ES › cromatografía.