Revista Internacional de Investigación Ambiental y Salud pública.

Comunicación

Detección Molecular de ADN de Leptospira en

Agua en St. Kitts

Julienne Rawlins 1, Alexandra Portanova 1, Ilana Zuckerman 1 , Amanda Loftis 1,†

, Pietro Ceccato 2 , Arve Lee Willingham 1 and Ashutosh Verma 1

 Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad de Ross, Basseterre, St. Kitts, West

Indies

E-Mails: JRawlins@rossvet.edu.kn (J.R.); alexportanova@gmail.com (A.P.);

IlanaZuckerman@students.rossu.edu (I.Z.); adloftis@gmail.com (A.L.);

awillingham@rossvet.edu.kn (A.L.W.).

 Instituto Internacional de Investigaciones para el Clima y la Sociedad, The Earth Institute,

Universidad de Columbia,
Palisades, NY 10964, EE.UU.; Correo electrónico: ceccato@iri.columbia.edu.

 Dirección actual: Departamento de Microbiología e Inmunología, Midwestern University,

9555 North 59th Avenue, Glendale, AZ 85308, Estados Unidos.

 Autor a quien debe dirigirse la correspondencia; EMail: averma@rossvet.edu.cn;

Tel .: + 1-869-465-4161 (extensión 1230); Fax: + 1-869-465-6165.

Recibido: 31 de mayo de 2014; En forma revisada: 26 de junio de 2014 / Aceptado: 1 de julio de

2014 / Publicada: 7 de agosto de 2014.

Resumen: La leptospirosis es una importante enfermedad zoonótica causada por enfermedades

patógenas Leptospira. El patógeno se mantiene en una población debido a la colonización crónica
y Derramando de túbulos renales de animales domésticos y salvajes. Humanos y otros animales
Infectados cuando entran en contacto con la orina de animales infectados, Directamente o a
través de agua superficial contaminada con orina. En este estudio, Agua ambiental en la isla de St.
Kitts mediante el uso de un TaqMan basado en tiempo real Reacción en cadena de la polimerasa
cuantitativa (qPCR) dirigida a un leptospiral específico de patógeno Gen, lipl32. Nuestros
resultados indican que alrededor de un quinto de las fuentes de agua ADN de leptospiral
detectable.
Palabras llave:

Leptospira; Detección molecular; Transmisión ambiental; leptospirosis

INTRODUCCION

La leptospirosis es una importante enfermedad transmitida por el agua a través de las islas del
Caribe que explica la morbilidad y mortalidad significativa en animales y humanos [1]. El espectro
de las presentaciones clínicas en la leptospirosis humana es muy amplio, que van desde una forma
sub-clínica a un síndrome potencialmente mortal con fallas multiorgánicas. La leptospirosis en
perros, ganado vacuno, caballos y cerdos se caracteriza por Signos incluyendo insuficiencia renal y
/ o reproductiva. Los animales portadores silvestres, como los roedores y las mangostas,
desempeñan un papel importante en el ciclo de transmisión y suelen ser asintomáticos

La leptospirosis se mantiene en una población debido a una infección renal crónica de una amplia
variedad de mamíferos domésticos, peridomésticos y salvajes. Las leptospiras patógenas viven en
los túbulos renales proximales de estos animales y se desprenden de su orina, contaminando las
aguas superficiales y el suelo, donde las leptospiras pueden sobrevivir durante semanas o meses
[5]. La exposición a aguas superficiales contaminadas es un medio frecuente de transmisión a
humanos y animales sanos. La leptospirosis se considera una amenaza ocupacional para los
trabajadores expuestos a fuentes de agua abiertas o animales, incluidos veterinarios, agricultores,
trabajadores de mataderos, inspectores de carne y trabajadores de control de roedores.
Leptospirosis Se han reportado brotes poco después de desastres naturales como inundaciones y
huracanes.

La leptospirosis es también un peligro recreativo para las personas que nadan y vadear en el agua
contaminada [6,7]. En este estudio, se investigó la contaminación por leptospiras de las aguas
superficiales en la isla de St. Kitts. Para este fin, se tamizó las muestras de agua superficial de
diversas ubicaciones en la isla mediante una PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) [8]. Este
ensayo se dirige al gen lipl32 que está presente en todos los leptospiros patogénicos Especies,
pero está ausente en especies intermedias o no patógenas de Leptospira.

2. Sección Experimental

2.1. Colección de muestras de agua

Se recogieron muestras de agua de 44 sitios a lo largo de la isla (Figura 1), durante un período de
ocho meses. Estos sitios incluían estanques, arroyos, manantiales de montaña, presas de agua y
charcos.
Figura 1. Mapa St. Kitts que muestra las áreas y tipos de muestreo (https://www.google.com/m

Lo que esta en recuadro en la parte inferior a mano izquierda

Estanques Charcos Represas de agua Primavera de montañaArroyos

Los manantiales de montaña son fuentes de agua potable en la isla. Las represas de agua son de
110 pies de largo, 100 pies de ancho y 12 pies de profundidad de los embalses ubicados en las
montañas para recoger el agua de lluvia que es utilizada por los agricultores para el riego (Figura
2). Para qPCR, se recogieron 300 ml de agua de cada sitio. Cada muestra recibió un número único y
se almacenó a -20ºC, no más de 48 h, hasta que se procesó. Se recogieron muestras adicionales de
agua de 300 ml de ocho presas de agua y cinco muelles de montaña para cultivar las leptospiras. El
cultivo de otras muestras no se intentó.
Figura 2. Sitios de recolección de muestras: (a) un estanque; B) una presa de agua; Y (c) una
corriente.

2.2. Cultivo de Leptospira spp.

Para el cultivo, 300 ml de muestras de agua recogidas de presas de agua y manantiales de

montaña se centrifugaron inmediatamente a 3000 g durante 30 min a 6ºC y los sedimentos se
resuspendieron en medio de albúmina de suero bovino (NVSL) de polisorbato-80 con fluorouracilo
al 0,01% y se incubaron a 30ºC ° C durante 4 semanas. Cada muestra de cultivo se verificó
semanalmente bajo el microscopio de campo oscuro para crecimiento y contaminación.

2.3. Extracción de ADN

El ADN se extrajo de muestras de agua utilizando el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Valencia,
CA, EE.UU.). Las muestras de agua se centrifugaron como se ha descrito anteriormente y las
pastillas se procesaron siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones
Leptospira interrogans serovar Pomona se cultivó en medio de albúmina de suero bovino
Polysorbate-80 (NVSL) a 30 ° C, y el ADN genómico aislado, y cuantificado como se describió
anteriormente [10]. Basado en el tamaño del genoma de L. interrogans (4.659 Mb), los
equivalentes del genoma se calcularon como se describe [11]. L. interrogans La concentración de
ADN de 550 μg / mL fue equivalente a ~ 1,13 × 1011 unidades de genoma / mL
2.4. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)

Se utilizó un TaqMan basado PCR cuantitativa (qPCR) para dirigirse a una región de 242 pb de
leptospiral lipl32 , Como se describe anteriormente [8]. El ensayo se realizó en un MicroAmp Fast
Optical 96-well Placa de reacción (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Cada placa
contenía ADN equivalente a 10 elevado a la 5 , 10elevado a la 4 , 10 elevada a la 3, 10 elevada a la
2 , 10, 1, 0,1 y 0,01 unidades de genoma leptospiral. Cada columna, excepto el control positivo
Columnas, tenía un control sin plantilla. Cada reacción se realizó en un volumen final de 25 μL,
utilizando 5 μl De ADN extraído, 500 nM de LipL32-45F

(Primer cebador 5ꞌ- AAGCATTACCG CTTGTGGTG-3ꞌ) 500 nM de LipL32-286R (cebador inverso;

5ꞌ-GAACTCCCATTTCAGCGATT-3ꞌ) y 100 nM de LipL32 - 189P (sonda; FAM - 5 \ beta -
AAAGCCAGGACAAGCGCCG - 3 \ beta - BHQ1) [8]. El ensayo fue Realizado en un ABI
7500 (Applied Biosystems) utilizando Platinum Quantitative PCR SuperMix-
UDG(Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y las condiciones térmicas de una etapa de
retención de 95 ° C durante 20 s, y 40

3. Resultados y discusión
Este método qPCR se dirige a un gen, lipl32, que codifica para una proteína de
membrana de 32 kDa de leptospiras patógenas. Lipl32 se conserva bastante entre las
especies patógenas, pero está ausente en especies no patógenas e intermedias
leptospiral [8]. Por lo tanto, este ensayo no detecta las leptospiras saprófitas que pueden
estar presentes en las muestras ambientales. El ensayo se desarrolló previamente para la
detección de ADN leptospiral en muestras clínicas [8]. En esos estudios se encontró que
era un ensayo robusto con alta sensibilidad y especificidad. Hemos adaptado este ensayo
para la detección de ADN leptospiral en agua ambiental. Se recogieron trescientos
mililitros de muestra de agua de cada uno de los 44 sitios de la isla
El ADN extraído de las muestras de agua se analizó mediante el ensayo qPCR. Para el
análisis, se utilizó un umbral de 100.000 y la línea de base entre 5 y 12 ciclos. Los
experimentos que no cumplieron con los criterios de curva estándar de una pendiente
entre -3,33 y-3,60, y el valor R2 de más de 0,97 fueron invalidados. Las muestras
duplicadas que tenían Ct <40 se consideraron positivas. Las muestras que
fueronIndetectables o tenían un Ct de> 40 fueron considerados negativos. Además, una
corrida se consideró válida sólo si los diez controles sin plantilla eran negativos. La Figura
3 muestra una curva estándar obtenida con 10 a la 5,10 a la 4 10 a la 3 10 a la 2 0, 1, 0,1
y 0,01 unidades del genoma de L. interrogans serovar Pomona
La Tabla 1
resume nuestros resultados de qPCR. Se recogieron un total de 15 muestras de
estanques y se recogieron tres muestras de arroyos. Ninguna de estas muestras fue
positiva por nuestro método. De los ocho sitios de represas de agua, cinco (62,5%) fueron
positivos para el ADN leptospiral. Dos de los cinco manantiales de montaña también
fueron positivos. Sólo uno de los 13 sitios de charco fue positivo. Los valores de Ct de
muestras positivas oscilaron entre 35,2 y 36,7, lo que equivale a 56 a 20,6 unidades
genómicas por 300 mL de muestra de agua.

Figura 3. Curva estándar obtenida con 10 a la 5

, 10 a la 4 10 a la 310 a la 210, 1, 0,1 y 0,01 unidades de genoma
De L. interrogans serovar Pomona. La pendiente de la línea de regresión entre el umbral
del ciclo y las normas de ADN leptospiral es -3.485, y R2
Es 0,999.

La dosis infecciosa de leptospira en los seres humanos no se conoce, pero los incidentes
de infección adquirida a través de la exposición al agua recreativa sugieren una dosis baja
[12 - 16].
 tipo de origen Numero de muestra Numero positivo
estanques 15 0
charcas 13 1
Presas de agua 8 5
Manantiales de las 5 2
montañas
arroyos 3 0

El grado de contaminación ambiental depende de varios factores incluyendo el volumen

de orina, la frecuencia, la concentración de leptospiras en la orina, el acceso de los
animales a los sitios de agua y el tipo de agua o suelo, la temperatura y el movimiento del
agua. Nuestros resultados indican que las presas de agua proporcionan condiciones que
aumentan la probabilidad de contaminación por animales portadores y la posterior
supervivencia del organismo. Estas presas están abiertas, grandes hoyos (110 × 100 × 12
pies) forrados con láminas impermeables (Figura 2b) para recoger el agua de lluvia para
el riego. Dado que las presas no están cubiertas, son fácilmente accesibles para los
roedores, langostas, monos y otros animales que viven en las montañas. Los roedores y
mangostas son reservorios asintomáticos de la enfermedad en diferentes partes del
mundo y potencialmente una fuente de contaminación de estos sitios. Los puntos de
recolección de la primavera de la montaña son igualmente accesibles a los animales
salvajes. La mayoría de los estanques también son accesibles a mangostas y ratas,
aunque en menor grado, pero fueron negativos para el ADN leptospiral. Aunque no se
prueban, estos cuerpos de agua estancados pueden tener concentraciones muy altas de
sal u otros factores inhibidores para el crecimiento de leptospira.
Nuestros intentos de cultivar leptospires de agua de presa y las muestras de primavera de
montaña no fueron exitosos debido a la contaminación por otras bacterias, menos
exigentes. El método de PCR cuantitativo basado en TaqMan utilizado en este estudio es
una herramienta útil para detectar leptospiras en agua ambiental. Es un ensayo muy
sensible que es específico para la detección de leptospiras patógenas. En nuestras
manos, la detección El límite de este ensayo es 1 equivalente de genoma. Dado que los
ensayos de PCR detectan ADN, este ensayo también es limitado en que no puede
diferenciar entre bacterias muertas y vivas; Sin embargo, la vida media del ADN libre es
corta, y la posibilidad de ADN libre en estas muestras es extremadamente baja

Conclusiones
En este estudio se utilizó un ensayo cuantitativo de PCR para detectar el ADN leptospiral
en agua superficial onSt. Kitts. Se encontró que alrededor del 18% de los sitios tenían
niveles detectables de ADN leptospiral, pero esta contaminación se vio principalmente en
las represas de agua y otros puntos de recogida de agua en las montañas. El agua de
estos sitios contaminados se usa para riego o para beber; Por lo tanto, se deben tomar las
medidas adecuadas para minimizar el acceso de los animales y educar a la gente sobre
los peligros potenciales de la exposición al agua contaminada con Leptospira. El
conocimiento de las partes interesadas de estas pruebas será esencial para permitir
actividades de vigilancia y control de rutina destinada a comprender mejor y reducir el
riesgo De la infección humana y animal en la isla.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por la Escuela Ross de la Universidad de Medicina Veterinaria
de la subvención intra-muros a AV. Agradecemos a Albert Ko, a Elsio Wunder, a Michel
Vandenplas, a Gillian Carmichael-Branford, a Trellor Fraites, a Iona Simmonds, a Rosalie
Hezekiah, a Catherine Cote, a Adrianna Spinella, a Fortune Sithole por la ayuda técnica
ya comentarios provechosos. También agradecemos a Charles Pemberton, Cromwell
Williams, Denison Paul, Halla Sahely, Elma Stevens, Conrad Kelly y Alton Bass por su
ayuda con la recolección de agua.

Contribuciones de autor
Concebido y diseñado los experimentos: Ashutosh Verma, Pietro Ceccato, Arve Lee
Willingham Realizado los experimentos: Julienne Rawlins, Alexandra Portanova, Ilana
Zuckerman, Amanda Loftis, Ashutosh Verma. Analizó los datos: Ashutosh Verma,
Amanda Loftis Escribió el artículo: Ashutosh Verma.