PRÁCTICA N° 4

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL DE LABORATORIO

I. INTRODUCCIÓN

En el trabajo del laboratorio de Microbiología tienen importantísima

aplicación los procedimientos, técnicas y productos que suprimen o
disminuyen la vitalidad de los microorganismos patógenos. No existe un
procedimiento de esterilización y desinfección aplicable a todos los casos.
El método de esterilización será seleccionado para cada caso teniendo en
cuenta la naturaleza física del objeto y la naturaleza biológica del
contaminante. Como rara vez se conoce la población de microorganismos
sobre un objeto que debe ser tratado, debemos presuponer que se
encuentran presentes las formas microbianas más resistentes: las
endosporas.

La esterilización se define como el proceso validado, en el cual se obtiene

un producto final libre de microorganismos viables. Es necesario tener en
cuenta que no existe la esterilidad absoluta, y que el nivel de esterilidad se
puede medir por la cantidad de microorganismos que se encuentren en el
material. Los diferentes tipos de esterilización son: físicos y químicos.

II. OBJETIVOS

 Aprender a limpiar y preparar el material empleado en el laboratorio de

microbiología.
 Conocer los diferentes tipos de esterilización de material del laboratorio.

III. MATERIALES

 Materiales y equipos del laboratorio de Microbiología.

IV. METODOLOGÍA

1. Identificar material de vidrio

2. Lavar el material de vidrio y enjuagar con agua destilada.
3. Desinfectar la mesa con alcohol etílico al 70%.
4. Marcar los tubos, hacer tapones de algodón para los tubos de ensayo y
envolverlos con papel kraft. Anotar fecha y # de tubos.
5. Colocar tapones de algodón a los matraces, tapar con papel kraft y
etiquetar.
6. Envolver las placas petri en papel kraft, boca abajo y marcar.
7. Colocar tapón de algodón en la boquilla superior de las pipetas. Flamear y
envolver individualmente cada pipeta con papel kraft.
8. Programar el autoclave (temperatura, presión y tiempo).
9. Esterilización de las Asas de siembra con el flameado directo. (material de
metal).
V. FUNDAMENTO TEÓRICO

LAVADO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

NOTA: Es imprescindible el uso de guantes y lentes de seguridad

1. En bandeja plástica se prepara la cantidad adecuada de solución acuosa de

detergente.

2. El detergente se utiliza a una concentración de 5%.

3. Se vacía el material de vidrio en un recipiente de desechos adecuado

4. En función de la suciedad del mismo se enjuaga con agua potable.

5. Sumergir totalmente el material a limpiar en la solución de detergente

6. Dejar actuar 2 horas a temperatura ambiente. Si se desea una limpieza

rápida dejar actuar 5 minutos a 50°C.

7. Retirar el material, enjuagar con agua potable y si es necesario pasar cepillo

y/o esponja

8. Enjuagar con agua potable

9. Enjuagar tres veces con agua destilada.

10 .Acondicionar en bandejas y secar en estufas a 37°C.

EMPAQUETADO DE MATERIAL

El empaquetado debe adaptarse al método de esterilización utilizado para

asegurarse de que el agente de esterilización pueda penetrar el material del
empaquetado (por ejemplo, el vapor de agua). El empaque también brinda
protección durante el transporte y el almacenamiento. Un empaque adecuado
protege los artículos esterilizados de la contaminación micro bacteriano durante
el transporte y el almacenaje. Las unidades de empaque deben ser lo más
pequeñas posibles y presentar una etiqueta que indique su contenido, la fecha
de esterilización, la fecha límite de uso, el número de lote y el indicador de
esterilización.

PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO PARA SU ESTERELIZACIÓN

Este acondicionamiento debe realizarse de manera tal de asegurar la perfecta

esterilización del mismo en todos sus puntos y evitar la posterior
contaminación.

a. Placas de Petri: se envuelven en papel kraft tamaño A-4, se empaqueta

como si se tratara de un regalo, con dobleces hacia al centro y los dos
extremos se doblan en triángulo envolviéndolos hacia atrás. Luego se amarra
con hilo pabilo.
b. Tubos de ensayos: se confecciona el tapón de algodón, no deben quedar
muy apretados ni muy flojos. Luego empaquetar con papel kraft y amarrados
con hilo pabilo. Debe anotarse sobre el papel la medida de los tubos y la fecha
de esterilización.

c. Pipetas: se obtura el extremo superior con un filtro de algodón y se

introduce con una aguja, el fragmento sobresaliente se flamea con el mechero
y luego se envuelven con tiras de 4 a 5 cm. de ancho de papel kraft
comenzando por la punta de la misma. Debe rotularse cada una con la
capacidad y graduación correspondiente y la fecha de esterilización.

d. Matraz de Erlenmeyer y otros frascos: se colocan tapones de algodón

protegiéndolos con papel kraft, luego amarramos firmemente con hilo pabilo.

MATERIAL VENCIMIENTO
Vidrio (Placas, matraces, pipetas, etc) 1 MES (15 DIAS)
Medios de cultivo en tubos o frascos 2 MESES
Placas con medio en heladera 2 SEMANAS

ESTERILIZACIÓN

La esterilización es la muerte y/ o eliminación de todo microorganismo. No

existen grados de esterilidad, un objeto es estéril o no lo es.

1. FÍSICOS:

CALOR HÚMEDO: Esterilizar exclusivamente en calor húmedo: medios de

cultivos, recipientes contaminados, material de goma, y todo elemento que no
resista las altas temperaturas del calor seco.

El autoclave utiliza vapor a presión superior a la normal. Así, la temperatura del

vapor de agua asciende a 121ºC por 15 minutos y a 1 atmósfera de presión. El
vapor saturado penetra en los recipientes tomando contacto con los
microorganismos a destruir, allí se condensa liberando calor. El calentamiento
es rápido por la gran cantidad de calor latente del vapor de agua, que libera al
condensarse sobre la superficie del objeto.

 Tindalización (esterilización fraccionada): es una esterilización a vapor

fluente que implica el calentamiento del material a 100°C por 30 minutos
por tres días consecutivos con sucesivos periodos de incubación.
 Filtración: Las bacterias pueden eliminarse de los líquidos
haciéndolos pasar a través de filtros con poros muy pequeños que impiden
el paso de las bacterias pero, en general, no de los mycoplasmas, ni virus.
Se emplea este método para esterilizar el suero para su uso en el
laboratorio, las soluciones de antibióticos y los medios de cultivo especiales
que se alteran por el calor. Se utiliza también para separar los productos
solubles del crecimiento bacteriano (toxinas) de los medios de cultivo
líquidos.
 CALOR SECO: Deshidrata las bacterias, virus, etc. y facilita la coagulación o
desnaturalización de las proteínas. Se requieren mayores temperaturas para
producir daño irreversible (muerte). Se acepta que el calor seco actúe oxidando
los constituyentes intracelulares. En el proceso de esterilización son prioritarios
los procesos oxidativos y de fusión de membranas por sobre la
desnaturalización. Resulta lento por la menor eficacia del calor seco y por la
lentitud del transporte del calor (convección y radiación).

El horno es un equipo que trabaja con corriente eléctrica, proporciona

temperaturas de esterilización adecuadas para los materiales de vidrio o metal,
mas no de plástico y gomas, el tiempo de esterilización dependerá del tamaño
del material a esterilizar, el rango es de 1 a 2 horas a una temperatura de
160°C a 180°C.

 Flameado (calor al rojo): Los instrumentos tales como las asas y alambres
de siembra y varillas secas se esterilizan calentándolas en la llama de un
mechero bunsen hasta que se pongan al rojo vivo. Luego se retiran de
inmediato impidiendo que rocen con cualquier objeto si se desea tomar
alguna muestra.

2. QUÍMICOS:

Desinfectantes: son agentes antimicrobianos capaces de matar los

microorganismos patógenos (infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos
casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se
suelen emplear sólo sobre materiales inertes.

Esterilización por gas plasma: Es una de las tecnologías posibles para

esterilizar material termosensible. Consiste en crear un plasma (estado entre
líquido y gas), aplicando una radiofrecuencia a Peróxido de Hidrógeno que
ejerce la acción biocida. El plasma es considerado como el cuarto estado de la
materia consistente en un conjunto de iones, electrones y partículas atómicas
neutras. Tiene la ventaja de no dejar ningún residuo tóxico ya que se convierte
en agua y oxígeno al final del proceso. El material no precisa aireación. El ciclo
de esterilización es corto, dura entre 54 y 75 minutos.

Esterilización con óxido de etileno: este método se aplica a materiales

termosensibles, sondas, instrumental vario. Este gas se administra mediante un
autoclave especial. Para ejercer su efecto necesita humedad y una temperatura
moderada (60ºC). La desventaja es que genera residuos contaminantes que
deben recibir tratamiento antes de ser desechados. El material tratado debe ser
sometido a aireación forzada para eliminar los residuos tóxicos. El personal
debe protegerse adecuadamente.

VI. RESULTADOS

 Al realizar la práctica aprendimos la técnica adecuada para tener un

material libre de microorganismos, un material estéril, y en consecuencia de
realizar esta técnica obtuvimos nuestros materiales libres de cualquier
agente no deseado.
VII. CONCLUSIONES

 Aprendimos el procedimiento para empacar diversos materiales de uso en

microbiología así como el procedimiento de la esterilización.
 El proceso de esterilización por calor húmedo y seco se utiliza para la
destrucción de microorganismos, sean cuales sean sus propiedades y sus
características.
 El material debe ser esterilizado para poder ser usado antes de cultivar
microrganismos, porque de lo contrario podrían crecer otros organismos
que no son requeridos.

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Qué función tienen los tapones de algodón y el papel kraft?

2. Compare los métodos de esterilización por calor seco (estufa) y por calor
húmedo (autoclave) teniendo en cuenta: mecanismo de acción, tiempo,
temperatura y tipo de material a tratar.
3. ¿Cuáles son las ventajas de esterilizar en calor húmedo?
4. Mencione las normas de uso general del Autoclave.