Universidad Central de Venezuela

Facultad de Ciencias
Escuela de Química
Laboratorio de Instrumental Analítico

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN UN JARABE DE

VITAMINA C USANDO LA TÉCNICA DE HPLC EN FASE INVERSA

Profesor: Estudiante:

Mauro Martínez Victoria García A.

18363473

Fecha de realización de la práctica: 2 de Mayo de 2014.

Reseña:

La cromatografía es una técnica de separación de los componentes de una muestra,

haciéndola pasar a través de una fase estacionaria, asistida por una fase móvil; para
nuestro caso de estudio dicha fase móvil involucra a un líquido, por lo que se conoce como
Cromatografía de Líquidos.

La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación mas

ampliamente utilizada. Las razones de la popularidad de esta técnica son su sensibilidad,
su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la
separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a
sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y
para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen: aminoácidos,
proteínas, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, plaguicidas, antibióticos, esteroides,
especies organometálicas y una variedad de sustancias inorgánicas.

Objetivos

General:
• Determinar el contenido de ácido ascórbico en un jarabe de vitamina C usando la técnica
de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC).

Específicos:
• Adiestramiento en el manejo de equipos de cromatografía líquida de alta eficiencia.
• Aplicar el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtración y desgasificación de
los mismos.
• Ajustar los parámetros instrumentales, que permitan obtener una buena separación de
los picos en la muestra de vitamina C.
• Analizar cuantitativamente el contenido de ácido ascórbico mediante el uso de curva de
calibración externa (CCE).
• Determinar la precisión del análisis.
 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

Equipo
El equipo de cromatografía que se encuentra en el laboratorio de Instrumental analítico
tiene las siguientes características:
Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia, marca Jasco Modelo L6-2080-02 Terniary
gradient, Bomba Jasco PU-2080 plus HPLC, Desgasificador Populaire.
Detector: UV/Vis – 2075 plus (Fotomultiplicador)
Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μL
Columna de acero Inoxidable (fase estacionaria: C18); Longitud: 250 mm; Diámetro
interno: 4.6 mm; y Tamaño de partícula del soporte: 5 μm.

1. Preparación de las soluciones patrón de ácido ascórbico para curva de

calibración.
a. Se preparó una solución madre de (214±2) ppm de ácido ascórbico.
b. Se preparó por dilución 4 patrones según los valores de la tabla #1
c. Se inyectaron al HPLC bajo condiciones óptimas (*) y se graficaron los valores de área
de pico en función de la concentración.

Tabla # 1:
Patrón Alícuota (mL) Enrase(±0,04) Concentración
(mL) final (ppm)
1 (1,76±0,008) 25,00 (15,1±0,2)
2 (2,34±0,010) 25,00 (20,0±0,3)
3 (3,00±0,012) 25,00 (25,7±0,4)
4 (4,00±0,015) 25,00 (34,2±0,5)

2. Preparación de la muestra:

Pesar Disolver en Enrasar a 100,00mL, dilución

0,3000 g de agua 0,40/25 ml, filtrar (< 45 um) e
jarabe por desionizada inyectar al cromatógrafo.
triplicado

(*) Optimización de las condiciones del equipo:

La condición que se optimizo fue la longitud de onda:
 La longitud de onda de trabajo se escogió corriendo el patrón 2 (20,0ppm) a
diferentes longitudes de onda (254, 265 y 270) nm con un flujo de 0,90mL/min. y fase móvil
0,5% KH2PO4.
Condiciones finales de trabajo para la determinación cuantitativa de acido ascórbico
empleando patrones de referencia con la técnica de HPLC:

Inyectar la muestra y/o patrón bajo las siguientes condiciones:

Columna: fase estacionaria C18 dimensiones 250 x 4,6 mm 5

micrón

Bomba: Jasco PU-2080 PLUS

FM de trabajo: 0,5% KH2PO4

Flujo de FM de trabajo: 0,90 mL/min.

Inyector: Bucle de 10 µL

Detector: UV-2075 PLUS

λ: 265 nm

Programa del procesador de datos: Cromat 1.2

 Resultados obtenidos y discusión

(*) Optimización de las condiciones del equipo:

 Longitud de onda de trabajo:

 Gráfico 1: Cromatograma de un patrón de ácido ascórbico de concentración P 2 bajo

las condiciones de flujo y fase móvil especificadas, a 254, 265 y 270nm.

Los primeros dos picos corresponden a λ=254nm, los picos 3 al 6 corresponden a

λ=265nm y los picos 7 y 8 corresponden a λ=270nm.

 Gráfico 2: Cromatograma de un patrón de ácido ascórbico de concentración P 2 bajo

las condiciones de flujo y fase móvil especificadas a 254 y 265nm.

Los primeros dos picos corresponden a λ=254nm y los siguientes dos a λ=265nm.
Se selecciono como longitud de onda de trabajo λ=265nm, ya que fue la longitud de onda
donde se obtuvo mejor resolución en los picos y mayores alturas y áreas.
 En la cromatografía en fase inversa, como es éste caso, la fase estacionaria es no
polar, con frecuencia se trata de un hidrocarburo, y la fase móvil es relativamente polar. En
cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que
relativamente es el mas soluble en la fase móvil y un aumento de la polaridad de la fase
móvil provoca una disminución del tiempo de elución. Por contraste, en los métodos en
fase inversa, los componentes más polares aparecen primero, y un aumento de la
polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución.
Los rellenos de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando
el recubrimiento enlazado tiene un carácter no polar, y de fase normal cuando el
recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Por lo general, el grupo R del siloxano
en estos recubrimientos es una cadena C8 (n-octilo) o una cadena C18 (n-octadecilo)- en
este caso el recubrimiento es de C18-. En esta fase, los grupos de hidrocarburo de cadena
larga se alinean el uno junto al otro y en perpendicular a la superficie de la partícula, dando
una estructura semejante a una brocha o a un cepillo. Hasta el momento no está
completamente esclarecido el mecanismo por el cual estas superficies retienen a los
solutos.
Algunos científicos ven en el recubrimiento en forma de brocha una superficie
modificada en la que tiene lugar una adsorción física. Las moléculas de la fase móvil
compiten entonces con las del analito por una posición en la superficie orgánica.
Se escogió como fase móvil una solución de KH2PO4 al 0,5% p/v la cual es polar.

1. Patrones para curva de calibración:

 Gráfico 3: Cromatograma de patrones de ácido ascórbico de concentración P1, P2, P3

y P4, bajo las condiciones de longitud de onda, flujo y fase móvil especificadas.

(*)Los picos 1 al 4 corresponden al patrón 1(se descarto el pico 1 por tener menor área en comparación con
los demás); los picos 5 al 7 corresponden al patrón 2, los picos 8 al 10 corresponden al patrón 3 y los picos
11 al 15 corresponden al patrón 4( se descartaron los picos 11 y 12 por estar solapados).
Tabla II. Medición de la curva de calibración para la determinación de ácido ascórbico por
el método de CCE.

Patrón [Patrón] Señal (área

(mg/L) promedio)
P1 (15,1±0,2) 32161,15

P2 (20,0±0,3) 74306,03333

P3 (25,7±0,4) 294895,2

P4 (34,2±0,5) 294895,2

 Gráfico 4 Curva de calibración para la determinación de ácido ascórbico.

Tabla III. Pesos de alícuotas de jarabe empleados para la preparación de las soluciones
madres y diluidas de la muestra real de ácido ascórbico.

Masa de jarabe (g) Enrase

(±0,08) (mL)

0,3871(m1) 100,00
0,3553 (m2) 100,00
0,3549 (m3) 100,00
 Gráfico 5. Cromatograma de la muestra m1 diluida 0,40 en 25ml para la
determinación de ácido ascórbico.

 Gráfico 6. Cromatograma de la muestra m1 sin diluir para la determinación de ácido

ascórbico.

Nota: se utilizaron las muestras sin diluir para determinar la concentración de acido
ascórbico, ya que las muestras diluidas arrojaron muchos picos irregulares por la baja
concentración y rápida degradación de dicho acido.

 Gráfico 7. Cromatograma de la muestra m2, m3 y m1 (sometida al sol esta ultima) sin

diluir para la determinación de ácido ascórbico.
 (*) Los picos 1, 2 y 3 corresponden a la muestra m 2, los picos 4, 5 y 6 corresponden
a la muestra m3 y los picos 7, 8 ,9 y 10 corresponden a la muestra m 1 la cual fue
sometida al sol durante una hora aproximadamente, para los cálculos se descartó el
pico # 8 ya que arrojo un valor de área muy pequeño lo cual causaría mayor
dispersión.

Tabla IV. Determinación de la cantidad de ácido ascórbico en las muestras de un jarabe

de vitamina C usando el método de la curva de calibración externa.

Muestra Peso de Señal (área) Señal prom. Cantidad de Xprom

alicuota de (area) ácido (mg/L)
jarabe (g) ascórbico
(mg/L)
m1 0,3871 524516,3 551860,9 36,72805
631124,1
499942,3 32,2
m2 0,3553 392178,3 432981,9 32,04076
410451,4
496316
m3 0,3549 292714,7 325342,8333 27,79665
297383,4
385930,4
S 4,4

CV 12,5%

LC (95%) (32 ± 7)
La concentración de acido ascórbico reportada en el frasco de jarabe era: 100 mg de AA
por cada 5ml de jarabe, es decir, aproximadamente 20mg/ml y la concentración obtenida
fue 0,032mg/ml de AA. Dando un rendimiento de 0,16%.

La determinación cuantitativa de los componentes de una mezcla en una muestra

real o sintética mediante la técnica de HPLC en fase reversa se realiza mediante el
método de la curva de calibración externa (CCE), graficando las concentraciones de
patrón vs. el área del pico obtenido en el cromatograma. La columna del equipo de HPLC
empleada es una columna del tipo C18, por lo cual se emplean solventes polares en la
elución de la muestra que permiten competir en la disolución de muestras polares que se
adsorben sobre la columna.

Con una solución de (214±2) mg/L de ácido ascórbico y teniendo en cuenta que el
analito es una vitamina sensible a la degradación por cambios de temperatura y radiación,
se preparó el mismo día patrones frescos, los cuales se sometieron al análisis en las
mismas condiciones de operación (siempre el mismo operador, condiciones del equipo y
en pequeños intervalos de tiempo). Las réplicas de muestra ya disuelta y la solución
madre (214 ppm) se almacenaron en balones aforados protegidos de la luz y refrigerados
en baño de hielo para procurar la mínima degradación y pérdida del analito. A pesar de
ello en algunos cromatogramas se observa la aparición de un hombro en el pico del ácido
ascórbico, lo cual implica una degradación del ácido a productos intermediarios.

En la tabla # 4 se observa el CV > 5% el cual indica que el método de cuantificación

de ácido ascórbico (AA) no es reproducible, esto puede deberse a que el analito en
cuestión se degrada fácilmente por diversos factores, uno de los principales es la
temperatura. Este factor se considera fue el principal por el cual se reportó un porcentaje
tan bajo 0,032 mg/ml de AA en comparación con el esperado (20 mg/ml) en el jarabe ya
que la temperatura del laboratorio no contribuyó para los días en que se realizaron estos
experimentos (hubo temperatura elevada).

Según estudios realizados por la Magíster en Ciencias Químicas Tania M. Gutiérrez,

en el artículo titulado “DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN
UCHUVA, POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (CLAR)” señala
que “El ácido ascórbico presenta inestabilidad en soluciones acuosas aisladas, por tal
razón éstas deben prepararse inmediatamente antes de ser analizadas por CLAR”.
También señala que para su estudio partió de una solución de aproximadamente 25 ppm
de AA, almacenándola a unos 4oC (en incubadora) que, al cabo de nueve horas se había
degradado en un 44%.

Tomando en cuenta que la temperatura a la cual se resguardaron las muestras ya

disueltas y la solución madre no era inferior a los 10 oC (estimado), se justifica el bajo
porcentaje de ácido ascórbico obtenido.
 CONCLUSIONES

 De acuerdo a los gráficos 1 y 2, la longitud de onda de mayor sensibilidad para la

detección de ácido ascórbico fue la de 265 nm, con un área promedio de 58054,9
UA.
 La fase móvil de KH2PO4 al 0,5% presentó picos gaussianos con elevados valores
de area y altura reproducible, por lo cual se concluye que es una adecuada fase
móvil para realizar este experimento.
 El ácido ascórbico presenta inestabilidad en soluciones acuosas aisladas, por tal
razón éstas deben prepararse inmediatamente antes de ser analizadas por
cromatografía líquida de alta resolución.
 El método de cuantificación de ácido ascórbico (AA) no es reproducible, esto se
debe a que el analito en cuestión se degrada fácilmente por diversos factores.
 Para optimizar éste método se requiere principalmente preservar el analito a muy
bajas temperaturas y realizar los análisis correspondientes en un lapso corto de
tiempo inmediatamente luego de preparar las soluciones.
 BIBLIOGRAFÍA

o SKOOG-HOLLER-NIEMAN. Análisis instrumental. Ed. Mc Graw Hill, 5ta

edición. Madrid, España 2001. Capitulo 28. Págs. 785-828.
o Gutiérrez, Tania M. “DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO
ASCÓRBICO EN UCHUVA, POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN (CLAR)”. Facultad de ciencias agropecuarias. Vol. 5. Nro. 1.
Marzo 2007. Págs. 70-79.