Materiale pentru regenerarea sistemului nervos

periferic

Student: Crețu Maria Gabriela

Coordonator: S.I.Dr.Ing. Cristina Busuioc
An universitar 2018/2019

1
 1. Introducere

Am ales ca temă regenerarea nervilor deoarece problematica este de actualitate iar

semnele de întrebare ridicate își găsesc treptat răspunsurile prin utilizarea unor materiale
inovatoare.
Nervii sunt elementele care conectează sistemul nervos central cu efectorii. Aceștia sunt
formați din axonii neuronilor, prelungiri care pot atinge lungimea de un metru. Lezarea acestora
poate avea loc cu ușurință având în vedere fragilitatea lor și are drept consecință întreruperea
legăturii cu mușchii sau organele în cazul în care survine o ruptură ori durere, amorțeală și
slăbiciune a mușchilor atunci când leziunea este provocată de presiune sau întindere. Anatomia și
fiziologia nervilor reprezintă un aspect esențial în înțelegerea problematicii regenerării lor,
întrucât acestea dictează modalitățile de tratament.
Cele trei materiale compozite alese pentru regenerarea nervoasă sunt:
- scaffold-uri hibride chitosan/CaTiO3
- poli(3,4-etilendioxitiofen)-acid hialuronic/chitosan/gelatină
- acid poli(l-lactic co-ε-caprolactonic)/mătase acoperit cu polipirol
Alegerea unor materiale compozite în locul celor simple este motivată de necesitatea
îmbinării unor proprietăți conductive ( deoarece impulsul nervos este transmis sub formă de
curent electric ) cu cele de biocompatibilitate, mecanice.De asemenea, materialele trebuie să
prezinte și proprietăți regenerative, astfel încât producerea de țesut cicatricial să fie minimă.
Țesutul cicatricial împiedică transmiterea impulsurilor nervoase, putând provoca pe lângă altele
și durere.
 Chitosanul, polizaharidă naturală extrasă din carapacele crustaceelor, a fost ales
datorită proprietății de biocompatibilitate excelentă dar și datorită faptului că
aceasta poate interacționa cu speciile încărcate negativ.
 Acidul hialuronic este un glicozaminoglican ce se găsește în mod natural la
nivelul țesutului nervos, de aici și utilizarea sa în compozitele pentru regenerarea
nervilor
 Gelatina este aleasă deoarece este ușor de găsit, ieftină, iar adăugată chitosanului
îi îmbunătățește proprietățile mecanice. Fiind derivată din colagen, prezintă o
slabă activitate antigenică, proprietate de dorit în aplicația de față
 Fiecare dintre cele trei compozite prezintă o componentă conductivă electric,
precum titanatul de calciu, poli(3,4-etilendioxitiofen) (PEDOT) și polipirolul, atât
pentru conducerea impulsurilor nervoase cât și pentru stimularea regenerării
celulare

2
 2. Obținerea materialelor

 Scaffold-urile hibride chitosan/CaTiO3

Întâi se prepară soluția de chitosan prin dizolvarea chitosanului în acid acetic de utilizând
un agitator magnetic. Amestecul se lasă la agitat temperatura camerei după care este lăsată să se
"odihnească" la pentru o zi cu scopul de a se elimina bulele de aer din soluție.
Următorul pas este reprezentat de adaosul nanoparticulelor de CaTiO3 în soluția de
chitosan și încorporarea energică a acestora în soluție. După amestecare, din soluțiile rezultate se
elimină gazul utilizând un cuptor cu vacuum, după care soluțiile sunt liofilizate.
Scaffold-urile rezultate sunt imersate în soluție de NaOH pentru îndepărtarea acidului
acetic. Scaffold-urile sunt spălate mai apoi cu apă deionizată până când sunt neutralizate și se re-
liofilizează.
Probele obținute în funcție de cantitatea de nanoparticule (CS/CaTiO3) adăugate:
- CS, neconținând CaTiO3
- CS/CaTiO3-1, conținând 1 mg de CaTiO3
- CS/CaTiO3-5, conținând 5 mg de CaTiO3
- CS/CaTiO3-10, conținând 10 mg de CaTiO3 [1]

 Scaffold-uri din PEDOT-acid hialuronic/chitosan/gelatină

Soluția de acid hialuronic se amestecă cu EDOT. Polimerizarea oxidativă se inițiază prin
adăugarea de persulfat de amoniu în amestec după care soluția rezultată se centrifughează. Pentru
îndepărtarea reactanților reziduali, sedimentul se spală cu etanol si apă deionizată de 3 ori.
Sedimentul se usucă mai apoi în vacuum la temperatura camerei pentru o săptămână, obținându-
se nanoparticule de PEDOT-HA.
Chitosanul se dizolvă în soluție de acid acetic iar gelatina se dizolvă în apă deionizată. Se
adaugă nanoparticulele de PEDOT-HA, soluția este omogenizată și se elimină bulele de gaz prin
amestecare și dispersare ultrasonică.
Amestecul rezultat se congelează. Următorul pas este reprezentat de liofilizare iar mai
apoi scaffold-urile se pun în soluție de etanol cu hidroclorură de 1-(3-dimetilaminopropol)-3-
etilcarbodiimidă hidrocloridă/N-hidroxi-succinimidă pentru a reticula. Scaffold-urile sunt
deacidifiate utilizând Na2HPO4 , spălate cu apă deionizată și liofilizate după ce au stat o zi la
congelat [2].

Probele obținute în funcție de cantitatea de nanoparticule (PEDOT-HA)adăugate:

- 0% PEDOT-HA/Cs/Gel
- 2% PEDOT-HA/Cs/Gel

3
 - 5% PEDOT-HA/Cs/Gel
- 8% PEDOT-HA/Cs/Gel
- 10% PEDOT-HA/Cs/Gel

 Acid poli(l-lactic co-ε-caprolactonic)/fibroină acoperit cu polipirol

Procedeul începe prin dizolvarea PLCL și a fibroinei la temperatura camerei timp de 4
ore, și mai apoi producerea de nanofibre prin electrospinning. Nanofibrele rezultate se acoperă
cu polipirol prin imersarea loc în soluție apoasă ce conține soluție de pirol, după care în sistemul
de reacție se adaugă FeCl3 ca agent oxidant și pTS ca agent dopant.
Materialul se obține prin agitare după care se spală cu apă deionizată și etanol și se usucă.
[3]

4
 3. Caracterizarea materialelor obținute prin microscopie electronică de baleiaj

Microscopia electronică de baleiaj este în prezent cea mai utilizată tehnică de

caracterizare în domeniul fizicii și al ingineriei materialelor. Diferența considerabilă între
microscopul electronic de baleiaj și cel optic este cea că în loc de fascicule de lumină, așa cum
utilizează microscopul optic, cel electronic de baleiaj utilizează fascicule de electroni. [4]
Pregătirea probelor: probele au fost acoperite în prealabil cu aur pentru a deveni
conductive, după ce au fost lipite cu bandă dublu-adezivă pe un suport.

 Scaffold-urile hibride chitosan/CaTiO3

În figura 1 se regăsesc imaginile obținute prin microscopia electronică de baleiaj ale celor
4 probe.
Scaffold-ul din chitosan simplu prezintă o morfologie de tip strip cu pori numeroși. În
urma hibridizării scaffold-urilor de chitosan se observă numeroase agregate de nanoparticule
cvasisferice, a căror distribuție este relativ omogenă. Cu cât concentrația de CaTiO3 crește, cu
atât nanoparticulele au tendința mai mare de aglomerare. De asemenea, se observă că după
hibridizarea scaffold-urilor, morfologia acestora nu mai este de tip strip

Figura 1. Imaginile de microscopie electronică de baleiaj pentru scaffold-urile CS/CaTiO3

5
  Scaffold-uri din PEDOT-acid hialuronic/chitosan/gelatină
În imaginile obținute prin microscopia electronică de baleiaj se observă structuri poroase,
de diferite dimensiuni. Porii sunt rezultatul sublimării apei și sunt interconectați în proporție
mare la toate concentrațiile de PEDOT-HA. Dimensiunile porilor cresc într-o mică proporție
odată cu creșterea concentrației nanoparticulelor. Săgețile roșii marchează prezența
nanoparticulelor pe suprafața porilor, având dimensiuni submicronice, și având o morfologie
cvasisferică.

Figura 2. Imaginile de microscopie electronică de baleiaj ale scaffold-urilor pe

bază de PEDOT, la diferite concentrații

 Acid poli(l-lactic co-ε-caprolactonic)/fibroină acoperit cu polipirol

În figura 3 se poate observa morfologia fibroasă a materialului rezultat. Fibrele din

imaginea F au suprafața relativ netedă, diametru nanometric și se intercalează pe alocuri. În
imaginea G se observă aglomerate de nanoparticule pe suprafața fibrelor, aspect care sugerează
că acoperirea cu polipirol a fost un succes.

6
Figura 3. Imagini de microscopie electronică de baleiaj a materialului PLCL/SF (F) și a
materialului PLCL/SF/Ppy

7
 4. Perspective și îmbunătățiri posibile

Strategiile implicate în repararea și regenerarea nervilor trebuie să satisfacă o serie de cerințe

precum:
- să potențeze regenerarea axonală
- să mărească șansele de supraviețuire neuronală
- să moduleze reorganizarea centrală
- să reducă sau să inhibe atrofierea organelor [5]
În ultimii ani regenerarea sistemului nervos periferic a avansat, fie că vorbim despre tehnici
chirurgicale ce implică microsuturi pentru repararea nervilor sau despre autogrefe și alogrefe. Cu
toate acestea, este loc de îmbunătățiri.
Una din abordările ce pot aduce plusuri alogrefelor este încărcarea lor cu biomolecule
precum peptidele, hormonii și factorii de creștere. [6] Factorul de creștere neuronală (NGF) face
parte din familia neurotrofinelor. Neutrofina este o proteină ce asigură supraviețuirea, creșterea și
plasticitatea neuronilor. Alte familii de factori de creștere utili în regenerarea nervilor sunt
familia factorilor derivați din celule gliale (GNDF) și familia citokinelor neuropoietice (CNTF).
Fiecărei familii de factori de creștere îi corespunde un anumit receptor, interacționând printr-un
mecanism de tip lacăt-cheie și având ca target diferite tipuri de neuroni (figura 4). [7]

Figura 4. Familiile principale de factori de creștere și receptorii utilizați în regenerarea

nervilor

O altă abordare este reprezentată de printarea 3D a unor matrici compozite, utilizând

materiale sintetice, naturale și/sau biologice. Tehnica prezintă numeroase avantaje, printre care și
permiterea unei reproduceri precise ale structurilor țesutului cu rezoluție la scară de microni. De
asemenea, poate fi modulată flexibilitatea materialului, iar gradul de reproductibilitate este unul
mare. Tehnicile de printare 3D includ:
- stereolitografia

8
- extrudarea
- inkjet [8]
Tabelul 1. Comparație între tehnicile de printare 3D [8]

Stereolitografie Extrudare Inkjet

Natural, sintetic Natural, sintetic Natural, sintetic

Materiale
Cu unul sau mai Cu unul sau mai Cu un singur lumen
Design multe lumenuri multe lumenuri ce
pot fi bifurcate
Nerv sciatic Nerv sciatic Nerv sciatic
Model și lungime (șobolan) - 10 mm (șobolan) - 10 mm (șobolan) - 10 mm
Nerv peroneal
(șobolan) - 15 mm
250 μm 100 μm 85 μm
Rezoluție maximă

9
5. Concluzie
Regenerarea nervilor periferici a avansat în ultimii ani și poate avea loc utilizând mai
multe tipuri de abordări precum folosirea unor suturi atunci când este posibil, folosirea unor
scaffold-uri compozite alături de biomolecule ce pot promova regenerarea, etc. În acest
proiect au fost descrise trei materiale: scaffold-uri hibride chitosan/CaTiO3 , scaffold-uri de
poli(3,4-etilendioxitiofen)-acid hialuronic/chitosan/gelatină și scaffold-uri de acid poli(l-
lactic co-ε-caprolactonic)/mătase acoperit cu polipirol. Materialele au fost caracterizate prin
microscopie electronică de baleiaj, metodă ce a servit la observarea morfologiei probelor.

10
References

[1] Q. X. R. M. L. H. L. Z. Guicai Li, "Nanoengineered porous chitosan/CaTiO3 hybrid scaffolds for

accelerating Schwann cells growth in peripheral nerve regeneration".

[2] S. G. ,. Z. Z. L. T. L. X. M. ShupingWang, "Hyaluronic acid doped-poly(3,4-

ethylenedioxythiophene)/chitosan/gelatin (PEDOT-HA/Cs/Gel) porous conductive scaffold for nerve
regeneration".

[3] Z. Z. D. L. T. W. H. Z. J. L. Binbin Suna, "Polypyrrole-Coated Poly(l-lactic acid-co-ε-caprolactone)/Silk

Fibroin Nanofibrous Nerve Guidance Conduit Induced Nerve Regeneration in Rat".

[4] "SCRIBD," [Online]. Available: https://www.scribd.com/doc/204194446/Microscopia-Electronica-

de-Baleiaj.

[5] P. Tos, G. Ronchi, S. Geuna and B. B, "Future perspectives in nerve repair and regeneration.".

11