MÉTODOS PARA IDENTIFICAR Y CUANTIFICAR

MACROMOLÉCULAS
FUNDAMENTO DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICOS

Los métodos para determinación de las

diferentes moléculas biológicas se
basan en las características
diferenciales de las moléculas que
pueden hallarse en los seres vivos. Las
diferencias de estas moléculas se
encuentran en sus propiedades
químicas, físicas y bioquímicas, por lo
que los métodos y técnicas que se han ido desarrollando se han fundamentado
en estas propiedades. La evolución de los procedimientos para analizar las
muestras biológicas ha permitido el crecimiento exponencial de la bioquímica. La
bioquímica y los procedimientos para su estudio se han ido desarrollando de
manera cooperativa, de manera que el conocimiento de la bioquímica se
fundamenta en la capacidad de los métodos y las técnicas para conocer qué es
lo que ocurre dentro de los seres vivos, y las nuevas técnicas que van
apareciendo en los últimos años se fundamentan en los conocimientos
bioquímicos, de forma que ambos van avanzando de manera sinérgica.

Los métodos de análisis bioquímicos deben permitir determinar la existencia de

una molécula en presencia de otras, ya que las muestras biológicas son una
mezcla de diferentes moléculas. Además, en muchos casos, puede ser
necesario conocer la cantidad de una biomolécula determinada que se encuentre
presente en la muestra. Así, los métodos de análisis bioquímicos de la presencia
de una determinada sustancia requieren que está presente alguna propiedad
que pueda observarse; así, en los primeros análisis que se realizaron, estas
propiedades como el color, el olor, etc. En el caso de que la sustancia no muestre
una propiedad mensurable, por ejemplo, haciendo que reacciones con alguna
sustancia específica, que le permitirá desarrollar una característica como
presentar color, precipitar, pasar a estado gaseoso, etc.
DIÁLISIS

La diálisis es una forma de filtración molecular. Es un proceso que separa

moléculas de acuerdo con su tamaño, mediante el empleo de membranas
semipermeables que contienen poros de dimensiones inferiores a las
macromoleculares. Estos poros permiten que moléculas pequeñas, tales como
las de los disolventes, sales y metabolitos pequeños, se difundan a través de la
membrana pero bloqueen el tránsito de moléculas mayores.

La diálisis se emplea rutinariamente para cambiar el disolvente en el que se

encuentran disueltas las macromoléculas. Una disolución macromolecular se
introduce en el saco de diálisis, que se sumerge en un volumen relativamente
grande de disolvente nuevo. Las moléculas pequeñas pasan a través de la
membrana al fluido externo hasta que se alcanza el equilibrio, las
macromoléculas permanecerán en el interior de saco de diálisis. El proceso
puede repetirse varias veces a fin de sustituir completamente un sistema
disolvente por otro.

Existen factores que afectan la velocidad de la diálisis:

 Solvente:

 Solución acuosa: en general, la velocidad de diálisis es mayor en

agua destilada, sin embargo en muchos casos para estabilizar
moléculas objeto de investigación es necesario utilizar soluciones
de fuerza iónica y pH definidos.
 Solución de una macromolécula: durante la diálisis penetra agua
en el saco por ósmosis, por lo tanto el tubo debe llenarse
completamente con el fin de evitar la dilución del contenido.
  Condiciones físicas:
 Temperatura: entre más alta sea la temperatura, mayor será la
velocidad de diálisis. A temperaturas elevadas, la viscosidad del
solvente es menor y la velocidad de difusión aumenta.

ULTRACENTRIFUGACIÓN

La ultrafiltración es el proceso
capaz de fraccionar, separar y
concentrar sustancias sin que
éstas sufran cambios de fase,
en el cual se utiliza una
membrana semipermeable
con poros de tamaño definido,
que determina el tamaño de
las partículas que pasarán a
través de ella. Debido a que la membrana utilizada es semipermeable, es
necesaria la presencia de una presión (entre 4 a 8 atm) que auxilie a las
partículas a fluir a través de la misma.
Tipos de Membranas:

Existen actualmente dos categorías de membranas de ultrafiltración que

presentan ambas una estructura asimétrica.

Las membranas formadas con polímeros orgánicos. Están

constituidas de una "piel activa"(capa que define el tamaño de las
partículas que podrán pasar por la membrana) soportada sobre
una estructura macroporosa.
La segunda generación de membranas de ultrafiltración se prepara
a partir de materiales cerámicos. Las capas sucesivas se producen
por un fritado de granos cerámicos que generan poros residuales
cuyo tamaño depende del tamaño de los granos; para obtener una
capa activa de ultrafiltración es necesario usar suspensiones
coloidales de óxidos que luego se depositan sobre un material
macro poroso y se fritan.
En la práctica se utilizan ambas, una delgada capa de las membranas orgánicas
determina el tamaño de macromoléculas que se pueden separar, sobre una
gruesa capa de las inorgánicas que le aportan resistencia a la presión.

Factores que intervienen en el rendimiento de una membrana:

Formación de una capa de polarización en la superficie de la membrana.

A medida que el solvente es removido a través de ella, las especies
rechazadas tienden a acumularse en la interface membrana solución.
Este efecto degradativo se manifiesta por si solo produciendo una
depresión del flujo, lo que significa una desventaja de la UF.
La formación de una capa de gel por coloides y las macromoléculas
acumuladas delante de la membrana llegan a una concentración crítica a
partir de la cual se forma un gel que es responsable de una resistencia
adicional al pase del flujo transmembrana.
Taponamiento interno de las membranas producido por el bloqueo de los
poros por el soluto.
La presión influencia el flujo de solvente, el caudal de filtrado aumenta con
la presión hasta un cierto valor límite a partir del cual el caudal de
estabiliza o disminuye.
En cuanto a la temperatura, se observa en general un aumento del flujo
del solvente con un aumento de la temperatura, el cual se debe
esencialmente a la disminución de la viscosidad del fluido.

UF A PEQUEÑA ESCALA (LABORATORIO):

Se utilizan tubos para centrifuga modificados, los cuales tienen un recipiente

con forma de cono adentro con la membrana en las paredes, estos se llenan
con la solución problema y se centrifuga, lo que origina la presión necesaria
para que el proceso se lleve a cabo, el solvente y las partículas de menor
tamaño que los poros se colectan en el tubo más grande.

UF A GRAN ESCALA (INDUSTRIAL):

Membrana de fibra hueca: los módulos contienen varios tubos o fibras de

pequeño diámetro (de 0,6 a 2 mm). La solución a filtrar fluye a través de los
núcleos abiertos de fibras y el líquido filtrado es recogido en un cartucho que
rodea las fibras. (Amorós & Amaya, 2013)

CROMATOGRAFÍA: DE INTERCAMBIO IÓNICO, AFINIDAD Y DE

ALTA PRECISIÓN (HPLC)

La cromatografía es un método de
separación de los componentes de una
muestra según su capacidad para
distribuirse entre una fase móvil, que
contiene la muestra, y una fase
estacionaria. Cuando la fase móvil es
un líquido hablamos de cromatografía de líquidos.

La cromatografía de líquidos clásica fue la primera en aplicarse y se llevaba a

cabo en columnas de vidrio rellenas de partículas granulares sólidas en las que
el flujo se producía por gravedad. Si los gránulos eran los suficientemente
pequeños para conseguir una buena separación, los tiempos de separación se
hacían demasiado grandes. Si se disminuía el tamaño de las partículas o se
forzaba el flujo mediante una bomba o por la presión de un gas, se aumentaba
la rapidez, pero a costa de un aumento considerable de la altura de plato teórico
y, en consecuencia, una disminución de la eficacia de la separación. (Paez,
2016)
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

La cromatografía de intercambio iónico es un

método que permite la separación de moléculas
basada en sus propiedades de carga eléctrica.
Se compone de dos fases: la fase estacionaria o
intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase
estacionaria insoluble lleva en la superficie
cargas electrostáticas fijas, que retienen
contraiones móviles que pueden intercambiarse
por iones de la fase móvil, la cual suele ser una
disolución acuosa con cantidades moderadas de
metanol u otro disolvente orgánico miscible con
agua que contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer. Los iones
de ésta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria.
(Strack, 2015)

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

La cromatografía por afinidad

es un tipo de cromatografía
de líquidos que se basa en la
unión reversible entre el
analito de interés y un ligando
específico, inmovilizado en un
soporte sólido inerte. Cuando
la muestra pasa por la
columna, sólo son retenidas
las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad y las que
no se unen avanzan con la fase móvil. Después, los analitos retenidos pueden
ser arrastrados cambiando las condiciones de la fase móvil.

Las matrices o soportes empleados en cromatografía de afinidad como fase

estacionaria deben ser rígidos, resistentes, insolubles, permeables y reactivos.
(Castaño, 2015)
Cromatografía de alta precisión (HPLC)

El uso del gas especial y el equipo

correctos cuando realice una
cromatografía de líquidos de alto
rendimiento (HPLC) mejorará
considerablemente la precisión de
sus resultados.

La HPLC es particularmente útil para la separación de materiales con grandes

pesos moleculares que presentan una volatilidad muy baja y no pueden
separarse mediante cromatografía de gases. Se usa principalmente en la
biotecnología, en ciencias y la industria farmacéutica.

La HPLC utiliza una fase móvil líquida para separar los componentes de la
muestra. Los componentes se disuelven en un disolvente y a continuación se
hacen pasar por la columna a una gran presión. A continuación, interactúan con
la fase estacionaria y salen en momentos distintos, igual que ocurre con la
cromatografía de gases. Si una cantidad excesiva de gas permanece disuelta en
la fase móvil líquida a la presión de la columna, el gas puede salir del detector y
provocar grandes picos no deseados. Estos pueden eliminarse mediante el
burbujeo de helio de gran pureza a través del líquido cuando el sistema HPLC
no disponga de un desgasificador integrado. El helio debe presentar unos niveles
bajos de hidrocarburos, ya que estos pueden disolverse en el disolvente y
generar ruido de línea base. (Lopez, 2015)

FUNDAMENTO DEL ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE

ANALIZADORES AUTOMÁTICOS

Los primeros sistemas automáticos para

el análisis de aminoácidos descritos en
1958 basados en la separación de
aminoácidos por cromatografía de
intercambio catiónico y posterior
reacción con ninhidrina, permanecen
hoy día como la metodología más fiable
para el análisis de aminoácidos en péptidos y proteínas. Analizadores
comerciales basados en esa metodología están disponibles en compañías como
Beckman y Pharmacia. A altas temperaturas (³ 100ºC), todos los aminoácidos
primarios reaccionan con dos moléculas de ninhidrina para formar un cromóforo
(púrpura de Ruthermann) con máxima absorción a 570 nm.

En la cuantificación de los aminoácidos individuales puede utilizarse el

coeficiente de absorción molar del compuesto coloreado, aunque su valor varía
de un aminoácido a otro y debe determinarse para las condiciones particulares
del análisis. Sin embargo, se debe escoger un valor de referencia para utilizarlo
en la cuantificación de los aminoácidos totales de una mezcla.

La reacción coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analíticos, así como

en la visualización de las bandas de los aminoácidos después de su separación
por electroforesis o por cromatografía. El reactivo que se utiliza en estas
circunstancias se prepara generalmente disuelto en etanol; cuando se añade
2,4-6colidina, las diferencias de color entre cada mancha ayudan a la
identificación de los distintos aminoácidos. (Diaz, 2015)

ELECTROFORESIS

La electroforesis
es un método de
separación
basado en la
movilidad de las
biomoléculas en
una fase líquida
sometida a un
campo eléctrico.
Las moléculas que posean carga negativa migrarán hacia el polo positivo de un
aparato electroforético y viceversa. La inclusión de una matriz sólida, además de
la fase líquida, permitió agregar un nuevo punto de separación y versatilidad en
la electroforesis. De esta manera, no solo las biomoléculas pueden ser
separadas por su carga, sino también por su tamaño. La inclusión de una matriz
permite algo que invariablemente sorprende a los estudiantes de biología
molecular: recuperar físicamente a la biomolécula que ha sido separada en un
gel, con la ayuda de una navaja y un agente de visualización.

El aparato electroforético moderno tiene los siguientes componentes: un

contenedor que evite la contaminación y derramamiento de las biomoléculas,
dos polos que atraerán a las biomoléculas, una fuente de poder generadora de
campo eléctrico regulable, una matriz que permita un segundo punto de
resolución y, finalmente, una solución amortiguadora de pH que mantenga la
integridad de las biomoléculas.

Algunas aplicaciones electroforéticas de alta resolución requieren que el aparato

pueda ser enfriado para evitar la formación de corrientes. Otros tienen sistemas
de observación en tiempo real (Invitrogen, 2008a) o sistemas ópticos
automatizados. Algunos más han sido adaptados para no solamente realizar
electroforesis sino también para transferir las biomoléculas que se separaron en
la matriz a una superficie donde puedan ser fijadas. Este método se conoce
como electrotransferencia y se emplea para aplicaciones de hibridación en
membrana.

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

La aplicación de la electroforesis en la separación de ácidos nucleicos permite

hacer tareas simples, como verificar su síntesis o integridad, y complejas, como
seguir los pasos enzimáticos de modificación durante la construcción de
elaboradas colecciones de ADN. Su fundamento químico reside en que los
ácidos nucleicos son polímeros de carga negativa unidos por enlaces covalentes
fosfodiéster. De esta manera, el ADN y el ARN se moverán en un campo
electroforético hacia el polo positivo.
La matriz sólida preferida para separar los ácidos nucleicos es la agarosa pues
da una capacidad de separación adecuada para la mayoría de las actividades
rutinarias. Además, puede ser flexibilizada con la concentración utilizada. La
electroforesis en agarosa es accesible debido a su bajo costo, a la diversidad de
diseños de cámaras, y a que es fácil de preparar (Brody y Kern, 2004). El uso de
acrilamida como matriz sólida, en lugar de la agarosa, aumenta la resolución a
la escala de pares de bases y se aplica en el monitoreo de los pequeños ARNs,
la separación de moléculas durante la secuenciación y en la separación de
moléculas de pesos moleculares similares pero diferente composición de
nucleótidos en gradientes desnaturalizantes.

El ARN necesita un agente desnaturalizante en la matriz debido a que al ser de

cadena sencilla puede hibridarse consigo mismo modificando su tamaño
molecular aparente- Frecuentemente se usa formaldehído o urea como agente
desnaturalizante para romper los puentes de hidrógeno intramoleculares. Por
otra parte, la visualización de los ácidos nucleicos en la electroforesis necesita
de un agente. Estos son generalmente compuestos químicos de estructura plana
que se intercalan entre los enlaces de hidrógeno de los ácidos nucleicos, por
ejemplo, bromuro de etidio o SYBR green. Cuando estas moléculas se excitan
con luz ultravioleta emiten fluorescencia que indica la posición de los ácidos
nucleicos, la cual está en función de su tamaño molecular.

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

Las proteínas son

biomoléculas cuyos
monómeros son aminoácidos
polimerizados por medio de
enlaces peptídicos. A
diferencia de los ácidos
nucleicos, que poseen una carga neta negativa, la carga de las proteínas es muy
variable porque en ellas puede haber aminoácidos tanto negativos como
positivos. De esta manera, las primeras separaciones electroforéticas proteicas
eran toscas y necesitaban un gradiente de pH que las atrapara en su punto
isoeléctrico (punto donde la proteína tendrá una carga neta de cero y no se podrá
mover más en un campo eléctrico). Laemmli (1970) implementó un tratamiento
para poder separar a las proteínas con base en su peso molecular. Este consiste
en la homogenización de la carga con dodecilsulfato de sodio (SDS), un
detergente que simultáneamente desnaturaliza a las proteínas y las cubre de
una carga neta negativa para que migren hacia el polo positivo durante la
electroforesis. Este método se conoce como SDS–PAGE (Polyacrylamide Gel
Electrophoresis). SDS–PAGE o electroforesis 1D (de una dimensión) es útil para
las aplicaciones rutinarias como el seguimiento de los niveles de acumulación de
proteínas, así como para su purificación, separación, hibridación con anticuerpos
y análisis de peso molecular.

AVANCES EN LA ELECTROFORESIS

El aparato electroforético más

miniaturizado es el Bio–
analyzer 2100. Esta máquina
realiza la electroforesis en
matrices de tan solo 1 * 2 mm
(a diferencia de las matrices
tradicionales que pueden
medir varios centímetros) con gran resolución gracias a un sistema óptico–digital
de lectura. El aparato electroforético más automatizado es QIAxcel. Está basado
en microelectroforesis en capilares y permite la visualización de los datos en
tiempo real. Se puede realizar el procesamiento de miles de muestras de forma
automática. Los costos elevados de estos aparatos son prohibitivos para
laboratorios individuales, pero se les encuentra en instalaciones compartidas.
(Julián M. Peña–Castro, 2013)

ESPECTROSCOPÍA: ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA,

ESPECTROFOTOMETRÍA DE LUZ VISIBLE Y ULTRAVIOLETA.

La espectroscopia surgió con el

estudio de la interacción entre la
radiación y la materia como función de
la longitud de onda (λ). En un principio
se refería al uso de la luz visible
dispersada según su longitud de onda,
por ejemplo por un prisma. Más tarde
el concepto se amplió enormemente para comprender cualquier medida en
función de la longitud de onda o de la frecuencia. Por tanto, la espectroscopia
puede referirse a interacciones con partículas de radiación o a una respuesta a
un campo alternante o frecuencia variante (ν). Una extensión adicional del
alcance de la definición añadió la energía (E) como variable, al establecerse la
relación E=hν para los fotones. Un gráfico de la respuesta como función de la
longitud de onda (o más comúnmente la frecuencia) se conoce como espectro.
(Fuentes, 2016)

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

En química analítica, la espectrometría de

absorción atómica es una técnica para
determinar la concentración de un elemento
metálico determinado en una muestra. Puede
utilizarse para analizar la concentración de más
de 62 metales diferentes en una solución.

Aunque la espectrometría de absorción atómica data del siglo XIX, la forma

moderna fue desarrollada en gran medida durante la década de los 50 por un
equipo de químicos de Australia, dirigidos por Alan Walsh.

PRINCIPIOS EN LOS QUE SE BASA

La técnica hace uso de la

espectrometría de absorción para
evaluar la concentración de un analito
en una muestra. Se basa en gran
medida en la ley de Beer-Lambert. En
resumen, los electrones de los átomos
en el atomizador pueden ser
promovidos a orbitales más altos por un instante mediante la absorción de una
cantidad de energía (es decir, luz de una determinada longitud de onda). Esta
cantidad de energía (o longitud de onda) se refiere específicamente a una
transición de electrones en un elemento particular, y en general, cada longitud
de onda corresponde a un solo elemento.
Como la cantidad de energía que se pone en la llama es conocida, y la cantidad
restante en el otro lado (el detector) se puede medir, es posible, a partir de la ley
de Beer-Lambert, calcular cuántas de estas transiciones tienen lugar, y así
obtener una señal que es proporcional a la concentración del elemento que se
mide. (Fuentes, Espectrometria.com, 2016)

ESPECTROFOTOMETRÍA DE LUZ VISIBLE Y ULTRAVIOLETA

La espectrometría ultravioleta-visible o espectrofotometría UV-Vis implica la

espectroscopia de fotones en la región de radiación ultravioleta-visible. Utiliza la
luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo
(IR) cercano.

En esta región del espectro electromagnético, las moléculas se someten a

transiciones electrónicas.

Esta técnica es complementaria de la espectrometría de fluorescencia, que trata

con transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la
espectrometría de absorción mide transiciones desde el estado basal al estado
excitado.
APLICACIONES

La espectrometría UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinación

cuantitativa de soluciones de iones metálicos de transición y compuestos
orgánicos muy conjugados.

SOLUCIONES DE IONES METÁLICOS DE TRANSICIÓN

Las soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas (es decir,
absorben la luz visible) debido a que los electrones en los átomos de metal se
pueden excitar desde un estado electrónico a otro. El color de las soluciones de
iones metálicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como
algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de una solución diluida de
sulfato de cobre es muy azul; agregando amoníaco se intensifica el color y
cambia la longitud de onda de absorción máxima.

COMPUESTOS ORGÁNICOS

Los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de

conjugación, también absorben luz en las regiones del espectro
electromagnético visible o ultravioleta. Los disolventes para estas
determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en agua,
o el etanol para compuestos orgánicos solubles. Los disolventes orgánicos
pueden tener una significativa absorción de UV, por lo que no todos los
disolventes son adecuados para su uso en espectrometría UV. El etanol absorbe
muy débilmente en la mayoría de longitudes de onda. La polaridad y el pH del
disolvente pueden afectar la absorción del espectro de un compuesto orgánico.
La tirosina, por ejemplo, aumenta su máximo de absorción y su coeficiente de
extinción molar cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando disminuye la
polaridad de los disolventes. (Fuentes, Espectrometria.com, 2016)
Bibliografía
Amorós, L., & Amaya, E. (2013). Docencia-Virtual. Obtenido de
http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BQblog/Dialisis%20y%20ultrafiltracion.pdf

Castaño, E. (2015). LidiaConLaQuimica. Obtenido de

https://lidiaconlaquimica.wordpress.com/2015/08/16/cromatografia-por-afinidad/

Diaz, D. (13 de Junio de 2015). Monografias.com. Obtenido de

https://www.monografias.com/trabajos7/amin/amin2.shtml

Fuentes, H. (2016). Espectrometria.com. Obtenido de https://www.espectrometria.com/

Fuentes, H. (2016). Espectrometria.com. Obtenido de

https://www.espectrometria.com/espectrometra_de_absorcin_atmica

Fuentes, H. (2016). Espectrometria.com. Obtenido de

https://www.espectrometria.com/espectrometra_ultravioleta-visible

Julián M. Peña–Castro, *. O.–R.–F. (2013). Los métodos experimentales que permiten el

estudio de las macromoléculas de la vida: historia, fundamentos y perspectivas.
Universidad Nacional Autónoma de México, 239-340.

Lopez, L. (2015). Carburos Metalicos. Obtenido de

http://www.carburos.com/Industries/Analytical-Laboratories/analytical-lab-
applications/product-list/high-performance-liquid-chromatography-hplc-analytical-
laboratories.aspx?itemId=5C5233E1630347DF9163B6FBE9CF3F2D

Paez, L. (2016). LidiaconlaQuimica. Obtenido de

https://lidiaconlaquimica.wordpress.com/2015/08/07/introduccion-a-la-
cromatografia-de-liquidos/

Strack, Á. -C.-D.-G.-H.-L.-M.-R. (2015). DocenciaenLinea. Obtenido de

http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-
Virtual/BQblog/Cromatografia%20de%20intercambio%20ionico.pdf