Sistema Rh e suas complexidades

Dra Lilian Castilho

 Sistema Rh

Sistema complexo
 49 antígenos
 muitos fenótipos
 no mínimo 200 alelos
 um fenótipo pode gerar vários genótipos

Principais antígenos
 D; C/c; E/e
 8 haplótipos: Dce(R1),Ce(r’), DcE(R2),
cE(r”), Dce(R0), ce(r), DCE(RZ), CE(ry)
 Sistema Rh:Terminologia
Rh:Terminologia

Rh não Rhesus

Sistema ISBT: 004

Símbolo ISBT: RH

Fenótipo: D+C+E-c+e+
RH:1,2-3,4,5
Dce/ce ou Dce/dce=R1r

Provável genótipo: DCE/ce, RH*1,2,5/RH*4,5
ou R1r
 Expressão das proteínas RhD e RhCE
RHD RHCE RHAG

Genes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mRNAs (A)n (A)n (A)n

C/c E/e
103 226 Y

Proteínas
1 417 1 417 1 409
 5’
RHD e RHCE 3’ 3’

RHD RHCE

Rh Rh SMP1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
box box

69Kb, 10 exons

Proteína transmembrana 30-32kDa

95% identidade (nt e aa)

49 ags definidos sorológicamente

RHD flanqueado por 2 caixas Rhesus

SMP= Simple Membrane Protein WAGNER e FLEGEL, 2000
Genes Rh:
D-positivo/D-negativo

RHD RHCE

D+ (D/D)

D+ (D/d)

D- (d/d)
 Rh:
Genes, Proteínas, Antígenos

P N U D D SMP1 ce, Ce, cE, CE Rh-positivo

SMP1 ce, Ce, cE, CE Rh-negativo

X Deletado X D

RhD RhCE

COOH N COOH
N
H H
2 2
 Bases moleculares das
variantes RH

Mutações missenses com troca de um único

aminoácido ou mutações dispersas

Rearranjos gênicos com produção de genes
híbridos

Proximidade dos genes RHD e RHCE e
orientações opostas no cromossomo podem
aumentar a chance de trocas genéticas

Teoria: formação de hair pin
Produ ção de genes RH h
Produção íbridos
híbridos

RHD SMP1 RHCE

RHD-CE(4-7)-D RHCE

Wagner & Flegel, 2000

 Mosaic nature of the Rh0 factor of
human blood

Em 1948 foi relatado que durante a rotina pré-natal da primeira
gestação, uma gestante foi tipada como RhD-negativo e seu
soro analisado não demonstrou presença de anticorpos

Durante a rotina pré-natal da segunda gestação e das

gestações subsequentes, a gestante foi tipada como Rh-
positivo. Assim, o relato de 1948 foi considerado um erro devido
a pobre qualidade dos anti-soros de tipagem Rh daquele tempo.

Wiener e colbs. Experimental Medicine and Surgery, 1957;15:75-81

 Porque a tipagem RhD
é algumas vezes problem ática?
problemática?

Grande número de variáveis nos testes sorológicos

1. Múltiplos Métodos – Tubo, Microplaca, Gel

Alguns realizam teste da AGH para D fraco, outros não
Rotina de doadores- Automação

2. Variedade de Reagentes – Contém diferentes clones

Podem reagir diferentemente com D fraco e D parcial
Maioria – reatividades com DIV, DVa, e DVI
Discrepâncias na tipagem Rh

3. Variabilidade na expressão da proteína RhD ( ~120 diferentes genes = variações)

Ocorrem por alterações na sequência do gene RHD
D fraco - 53 mutações diferentes
D Parcial ~ 50 “ “
Del ~ 8 “ “
“outras” ~ 18
 Variação na expressão do antígeno RhD
D Fraco
- incidência- 0.2-3% - diferenças populacionais
- requer teste indireto da AGH para ser detectado (depende do
reagente utilizado)
- mutações de único polimorfismo (SNP) no gene

- efeito na quantidade da proteína, mas não nos epítopos de D

geralmente não desenvolvem anti-D
Variação na expressão do antígeno RhD
Del
- expressão muito fraca do antígeno RhD : sempre
fenotipado como D negativo
- detectado por eluição
- mutações de único polimorfismo (SNP) no gene
- mutações em sítios de splice
- impedem a integração com a membrana
expressão

- DEL RHD(K409K) encontrado nos raros Asiáticos D

negativos e são C+ (28% dos Japoneses D-neg)
Variação na expressão do antígeno RhD
D Parcial
- tipagem D-positivo
- SNPs- extracelular
- OU muitos genes híbridos- regiões do gene
RHD substituídas por RHCE

- novos antígenos e epítopos D alterados

podem desenvolver anti-D
Epítopos de D expressos na proteína Rhce
DHAR, Crawford

RHD RHCE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
GENE RHD AUSENTE Crawford
W16C Q233E L245V Africanos

GENE RHD AUSENTE RoHAR – DHAR

exon D Caucasianos

Amino ácido(s) D-especifico(s) na proteína Rhce

causam reatividade com alguns anti-D monoclonais

Principais causas de discrepâncias na tipagem RhD

 Diferenças na reatividade de hemácias DHar
e Crawford+ com alguns reagentes anti-D

REAGENTE Monoclonal IgM IgG DHar Crawford

Gammaclone GAMA401 F8D8 monoclonal POS POS
Immucor Series 4 MS201 MS26 monoclonal POS NEG
Immucor Series 5 Th28 MS26 monoclonal POS NEG
Ortho BioClone MAD2 Policlonal-humano NEG NEG
Diamed Gel MS201 MS26 monoclonal POS NEG

Hemácias DHar e Crawford+ são não-reativas com anti-D policlonal

Discrepâncias na tipagem RhD ocorrem mais

com os reagentes monoclonais
 Quimeras D+/D- em indivíduos ccee

1000
Counts
0
0 1 2 3 4
10 10 10 10 10

1000
95% D neg + 5% D pos

Counts
0
1000
Counts
0
BMC Genet 2(2001)10

Fenotipados como D neg, genotipagem

indicada
Imungenicidade estabelecida

Todos os pacientes D neg que receberam quimeras

D+/D- desenvolveram anti-D
 Tipagem RhD
Em doadores de sangue:
sangue

Objetivo: rotular as hemácias que apresentam o antígeno RhD como

RhD-positivo
Problemas:
D Fraco - alguns não são identificados – mesmo com o teste da AGH
Del - todos são tipados como RhD negativo

Estes fenótipos podem estimular a produção de anti-D em

pacientes RhD-negativo

Importante: todos os Del e a maioria dos D fracos são herdados com C+ ou

E+, portanto podem ser removidos do pool de doadores RhD-negativo
realizando-se a fenotipagem dos antígenos C e E.
 Tipagem RhD
Em pacientes e gestantes:

Objetivo: detectar todos que apresentam risco de desenvolver anti-D

Maioria dos D fracos- não apresentam risco de desenvolver anti-D

(raras exceções)
D parcial – risco de desenvolver anti-D, mas os fenotipados como
D positivo não são detectados
- mulheres em idade fértil e gestantes devem ser consideradas
RhD-negativo para fins transfusionais e profilaxia Rh

Problemas:
Testes sorológicos não distinguem D fraco de D parcial
Mutações de D fraco também podem alterar epítopos
Casos enviados ao nosso
laboratório (2006)
RHD Número
Discrepâncias
D fraco tipo 2 4
D fraco tipo 1 16
D fraco tipo 4 17
Del (M295I) 1
DAU-2 2

40
D+ com anti-D
DAR 6
DIIIa 1
DIVa type 1 4
DIVb 1
DVI 6
DHMi 2
20
 Aloimunização anti-D por doadores
classificados como “D neg.“

D fraco tipo 2
Fenótipo DEL
 1 imunização  RHD(IVS5-38del4)
 Transfusion, 2000
 1 imunização

D fraco tipo 1  Transfusion, 2005

 1 imunização
RHD (K409K)

 Vox Sang, 2004
 Tipo DEL mais prevalente

D fraco tipo 26  1 imunização secundária
 1 imunização  Transfusion, 2005

na gestação
 Transfusion , 2005

Editorial na Transfusion 45(2005)466

 Tipos de D fraco entre receptores
de sangue com anti-D

31 observações desde 1998

D fraco: auto anti-D
n=24 * *
*

D fraco tipo 4.0: auto anti-D *
n=3, baixo título

D fraco: alo anti-D
n=4

D fraco tipos 4.2, 11 e 15

 Blood 95(2000)2699
http://www.uni-ulm.de/~wflegel/RH/RIR/#title
 Recomendação para a
tipagem RhD

Pacientes e gestantes

 2 anticorpos monoclonais IgM

 que nao detectam DVI

Doadores

 Anticorpo policlonal ou monoclonal IgG DVI+ ou

blend (IgM+IgG)
 teste da AGH em gel
 Reagentes anti-D na detecção de D
fraco e D parcial (Policlonais: tubo/gel)
Amostras Tipos de D fraco e Graus de aglutinação Densidades
D parcial antigênicas
Anti-D/AGH Anti-D/AGH
(tubo) (gel)
9 DF1 2+ 3+ 1273
4 DF2 0 1+ 462
1 DF3 1+ 3+ 1936
13 DF4 2+ 4+ 2184
2 DAR 0 (+) 988
1 DHMi 0 1+ 1112
3 DVI 0 1+ 1050
2 DF1/DHMi (+) 2+ 1577
1 DF4/DAR (+) 2+ 1432
 Reagentes anti-D na detecção de D
fraco e D parcial (Monoclonais: tubo/gel)
Amostras D Fraco/ D Clones de Anti-D IgM Clones de Anti-D IgG/AGH Densidades
parcial antigênicas

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

56 DF1 2 2 2 2 4 4 4 3 3 3 3 4 1273

15 DF2 0 0 0 0 2 2 2 1 1 1 1 2 462

28 DF3 3 3 3 3 4 4 4 3 3 3 3 4 1936

44 DF4 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 2184

5 DAR 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 2 1 988

2 DHMi 0 0 0 0 0 0 1 2 1 1 1 1 1112

4 DVI 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 1 2 1050

2 DAU-2 0 0 0 0 0 0 1 2 1 2 1 2 431

Clones IgM: MS201, P3X61, HM10, BS232, LDM3, MIMA 36 Clones IgG:ESD1, HM16, P3X35, P3X290, MS26, 175-2
 D parcial

Anticorpos monoclonais IgM
 que nao detectam DVI
 DII, DIII, DVI, DVa

Anticorpos monoclonais IgG

 que detectam DVI
 DVI, DFR, DBT, RoHAR

Identificação em gel
 Painel com 6 soros monoclonais (DII, DIII, DIVa, DIVb, DV,
HAR
DVII, DFR, DBT, R0 )
 Painel com 12 HAR
soros monoclonais (DII, DIII, DIVa, DIVb, DV,
DVII, DFR, DBT, R0 , DAR, DCS, DOL)
 Implicações Clínicas

Transfus ão de sangue RhD
Transfusão RhD+ + em pacientes que apresentam
os tipos de D fraco mais frequentes (DF1 -DF4) possibilta
(DF1-DF4)
um melhor aproveitamento dos estoques de sangue RhD RhD--
negativo

Gestantes com os tipos de D fraco mais frequentes n ão
não
necessitam de IgRh ((melhor
melhor utiliza ção da profilaxia Rh
utilização Rh,,
menor custo
custo))

Detec ção da maioria dos D fracos e D parciais em doadores
Detecção
de sangue aumentam a seguran
segurançaça transfusional e reduzem
os risco de aloimunização
aloimunização
 Bases moleculares dos
fenótipos RhD
fenótipos -negativo
RhD-negativo

Deleção do gene RHD: mais comum em
populações Européias

Gene RHD intacto mas não expresso: comum
em populações Orientais

Genes híbridos

Mutações que geram stop codon prematuro

Inserções e deleções que levam a alterção no
quadro de leitura

Mutações em sítios de splice
 RhD-negativo
Maioria dos Ingleses, 18% Africanos, 63% Japoneses, 80%
Brasileiros

RHD RHCE

Rh SMP1
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
67% Africanos, 11% Brasileiros box

RHDψ
RHDψ
ψ
ψ
Rh Rh SMP1
box 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
box 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

(C)cess
(C)ce

15% Africanos, 3% Brasileiros, 2% Japoneses

 RHD em D “neg”
400 doadores de sangue brasileiros
RHD- RHD+

RHD D Fraco =4 (%) D Parcial=6 (%) DEL dCes RHDψ

deletado

DF1 DF2 DF5 DAR DHMi DVI RHD(IVS3

+1(G>A)

377 1 2 1 2 1 3 2 4 7
 Variantes RHCE
Problemas na fenotipagem do antígeno C
Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos
mistos com um gene híbrido D-CE-D específico

RHD RHCE
ces
W16C L245V

15 % D/Ce/D híbrido: D-negativo Variante ce

C-positivo

Fenótipo C positivo; desenvolve anti-C

Gene híbrido D-CE-D associado a variante e; desenvolve anti-e

Este haplótipo RH é frequente em pacientes falciformes

aproximadamente 22% Africanos
 Variantes RHCE
Problemas na fenotipagem do antígeno e
Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos
ce “convencional”

Muitos genes diferentes, todos com expressão alterada do antígeno e

ces
W16C L245V G336C

ceMO
W16C V223F
ceEK
W16C M238V R263G M267K

ceAR
W16C M238V L245V R263G M267K I306V

ceBI
W16C M238V A273V L378V

Fenótipo e-positivo
Desenvolvem anti-e e/ou anti-ce
Frequentes em pacientes falciformes
Reações de monoclonais anti-e com
variantes e

Variante MS16 MS21 MS63 MS69 MS70

Variante MS16 MS21 MS63 MS69 MS70
hrs– (+) (+) 0 0 0
(ceMO)

hrs– 1+ 1+ 0 (+) 1+
(ceAR)

hrB– 1+ 1+ 1+ 1+ 1+
(ceEK)

hrB– 1+ 1+ 1+ 1+ 0
(ceS)
Cys16 0 1+ (+) 0 nt
(ce)
RN (+) 0 0 (+) 0
Variantes RHCE
Fenotipagem E+ com anti-E

Categoria Mecanismo
Mecanismo
Categoria
EI Met167Lys (Ew+)

EII RHCE(1)-RHD(2,3)-RHCE(4-10)

EIII Gln333Glu e Met238Val em cE

EIV Arg201Tyr em cE
Casos enviados ao nosso laboratório
Variantes RHCE

RHCE Número
Discrepâncias e
ceMO hrs- 1
ces 4
Cys16 6
Discrepâncias C
(C)ces hrB- 3

Discrepâncias E
E cat I 1
 Aplicações clínicas
Genotipagem RH

Pacientes com fenótipos D fraco
 D fracos mais frequentes devem ser transfundidos
com hemácias RhD pos (3 a 6% das unidades RhD-
neg são preservadas)

Gestantes
 Diagnóstico pré natal (genotipagem RHD fetal)
 IgRh na gestação (D fraco tipos raros e D parcial)

Doadores de sangue
 Triagem para DEL, D fraco e D+/D- quimeras entre
doadores sorológicamente D neg (prevenção da
aloimunização)
Aplicações clínicas
Genotipagem RH

Anti D e planejamento familiar

 Genótipo paterno para zigozidade RHD , se

mãe possue anti D (indicação da genotipagem

RHD fetal)

Variantes RHCE em pacientes e doadores

 Alterações na expressão de C, e, E

 Alo anti-C, -e, E na presença dos respectivos

ags
 Ausência de um ag de alta frequência
(prevenção da aloimunização e RTH)
 CASO CLINICO
 Paciente masculino descendente de Africanos
 64 anos
 Portador de anemia falciforme, politransfundido
 Solicitado 2 unidades de sangue
 PAI positiva/Autocontrole negativo
 Anticorpos identificados no soro: anti-
anti-Jkb
 Fenotipagem: R1R2, K-
K-, Fy(a-
Fy(a-b-),Jk(a+b-
),Jk(a+b-)
 Provas de compatibilidade: incompatíveis com
hemácias R1R2, Jk(b-
Jk(b-)
 CASO CLINICO

 Identificado anti-
anti-D, -C (auto, alo??)
 Paciente D+, C+
 Encaminhado para genotipagem
 Genótipo do RH*D, RH*cc,
paciente:
RH*Ee, KEL*2/KEL*2, FY*B/FY*B GATA
mutado, JK*A/JK*A
 Genotipagem complementar
GENOTIPAGEM COMPLEMENTAR

I4
C

Ex7

VS+
RHD-CE-D
RH*D, RH*cc

VS--
VS
(C)ces (r’s)
GENOTIPAGEM COMPLEMENTAR

100 pb
425 pb
294 pb
131 pb

DIIIa
 GENOTIPAGEM COMPLEMENTAR

r’s
V-VS+
L245V G336C L245V G336C

DIIIa
602C>G
455A>C 667T>G
 CONCLUSÃO

 Genotipagem do paciente: RH*D-

RH*D-CE-
CE-Ds, RH*DIIIa
 Fenotipagem do paciente: B, D+C+E+c+e+, VS+
(R2r’s), D parcial categoria IIIa
 Paciente aloimunizado com anti-
anti-C, anti-
anti-D, anti-
anti-Jkb,
anti--hrB?
anti
 Sangue selecionado para a transfusão: r”r”, Jk(b-
Jk(b-)
 Mosaic nature of the Rh0 factor of
human blood

Com a publicação de inúmeros relatos descrevendo novas
especificidades de anticorpos Rh-Hr, a sorologia e
nomenclatura destes tipos sanguíneos estão se tornando cada
vez mais complexas.

O número de fatores sanguíneos caracterizando cada

aglutinógeno Rh-Hr parece estar limitado principalmente pelo
custo e ingenuidade na procura e identificação de novos
anticorpos (Wiener, 1957)

Wiener e colbs. Experimental Medicine and Surgery, 1957;15:75-81

 Perspectivas futuras

Futuro
 Genotipagem em larga escala, ex.chips RHD,
RHCE incluindo variantes

Limitações
 Muitas regiões do gene devem ser analisadas
 Necessário estudos populacionais principalmente
em populações miscigenadas
 Algorítimo complexo para interpretação
Perspectivas futuras

Genó
Genótipo
Fenó
Fenótipo

aglutinação DNA