Replicación del DNA

NATURALEZA DE UN CROMOSOMA??

Es lineal?
Es circular?
Esta formado por muchos fragmentos?
Es igual en procariotes que en eucariotes?

COMO SE DUPLICA?

Tiene un sitio de inicio?

Múltiples sitios?

QUIEN INICIA??
Replicación cromosoma circular
Cromosoma circular
 Mutantes termocondicionales

control
40oC
dna A, dnaB, dnaC
30oC
otras wt
b
3HT

30oC
a
30oC

t
 Minicromosomas para determinar el origen mínimo

E. coli
DNA cromosomal (E. coli) + Enzima de restricción

DNA plasmídico + Enzima de restricción

origen
+

+
R
R
mezclado

Transformar
bacterias
ligasa

Medio con antibiótico

 X DNA

NO se replica

Ori-coli
Medio con antibiótico

R
Se replica
Secuencia del origen de replicación bacteriano

R1

R4

R2 R3

Región de los treceámeros (tres 4 Nonámeros o cajas DnaA (R)

repeticiones de 13 nucleótidos),
70% AT
once sitios GATC en la secuencia de 245pb
OriC E. coli

Secuencia rica en T-A

Metodo de footprinting para determinar el sitio de origen de la
replicación
 Dna A reconoce el sitio de inicio de la replicación

1) Nucleasa + DNA Ori

2) Dna A + DNA Ori 1 2 3 4
3) DnaB + DNA Ori
4) DnaC + DNA Ori 245

1
Sitios de unión de DnaA en el origen
 Proteína DnaA

• Monómero 52kDa
• Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas
dnaA
• Complejo DnaA-ATP mayor afinidad por el DNA que complejo
DnaA-ADP, y éste que DnaA solo.
• Estequiometría de hasta 20 subunidades de DnaA por oriC
• Une ATP y lo hidroliza a ADP en forma dependiente de DNA
• Una vez abiertos los treceámeros, DnaA se ubica en las
cadenas sencillas
Reconocimiento del oriC

DnaA reconoce el origen, lo activa

y lo protege. Parece existir una
fase helicoidal básica en la región
de origen
 DnaA, REGULACION

DnaA
DnaB
Interacciones de DnaA DnaC
RNA polimerasa
Ici
SeqA
DiaA
DNA Girasa
Orígenes de replicación
dnaA
Regulación por DnaA
dam
Factores sigma
Proteínas Fts

Unión a membrana
ATP/ADP (RIDA)
Sitios datA (5 cajas DnaA)
Regulación de DnaA Mutantes, sobreproducción
Hda/IdaB, subunidad beta
DARS 1,2 (DnaA reactivating sequence 1,2)
 Ori C ACTIVACION DEL
ORIGEN

DnaA-ATP

DnaA-ATP

DnaB-DnaC (6X)

DnaA-ADP
DnaA-ADP

Dna B DnaC
 DnaB
• Monómeros de 60kDa que
forman un homohexámero
• Actividad de helicasa
• Dominios para :
 Unión a DNA de cadena
doble
 Unión a DNA cadena sencilla
 Interacción con DnaC y DnaA
 Hidrólisis de NTPs (ATP)
Dna C
• Monómeros de 28 kDa
• Homohexámero que permite
la llegada de DnaB
• ATPasa: al hidrolizar ATP
pierde afinidad por DnaB
Por qué sus mutantes afectaron
la iniciación en el origen?
La helicasa rodea una de las hebras del DNA dúplex y se desplaza rompiendo
puentes de hidrógeno, logrando la apertura de la doble hélice por exclusión
estérica. Una hebra es retenida en el interior del anillo y la otra es excluida.
 DnaA, REGULACION
ATP/ADP (RIDA)
Unión a membrana
Sitios datA (5 cajas DnaA)
Regulación de DnaA Hda/IdaB, subunidad beta
Mutantes, sobreproducción
DARS 1,2 /DnaA reactivating sequence 1,2)

Orígenes de replicación
DnaA
Regulación por DnaA
Dam
Factores sigma
Proteínas Fts

DnaA
DnaB
Interacciones de DnaA DnaC
RNA polimerasa
Ici
SeqA
DiaA
DNA Girasa
 Cajas DnaA en:

datA oriC dnaA

X X X X X X X X X XXX DNA
promotor
duplicación

X X X X X X X X X XXX

X X X X X X X X X XXX
 REGULACION POR METILACION

Me
SeqA
GATC
CTAG
Me

DAM
Reconocimiento y
activación del oriC
Resumen

Hda/IdaB
Beta
FACTORES QUE INFLUENCIAN LA INICIACION DE LA REPLICACION PROCARIOTE

dna A

X
X OriC
DnaA
X DnaA

D naA - ATP

Exceso DnaA

Ici
DNA primasa
datA
DNA pol III
holo (beta)
DnaB
SeqA

DnaC
DnaA - ADP

DnaC

DNA hemimetilado

DnaA - ATP

Dam Me

Membrana
 SSB

Las proteínas SSB se unen con alta

afinidad al DNA de cadena sencilla y lo
protegen de nucleasas y de asociaciones
intracatenarias
La replicación del DNA requiere un cebador

• Dna G, Primasa, ≈ 60 kDa

• RNA polimerasa

• Sintetiza cebador de ≈ 12nt

• DNA Primasa reconoce a DnaB

 DNA Pol I
• Arthur Kornberg

• primera polimerasa descrita

• Péptido de 103 kDa

• Dependiente de molde de
• DNA

• Dirección de la síntesis 5´-3´

• Requiere extremo 3 ´OH

Actividades de la DNA polimerasa I
• Mutantes de E.coli en el gen de la Pol I son “viables”, por lo
tanto la DNA polI no es la principal enzima replicativa (pero no
soportan deleciones del gen).
• Mutantes de DNA pol II son viables, aún con el gen deletado.
• La DNApol III es la principal enzima en la replicación del DNA.
Las mutaciones son letales.
 DNA polimerasas bacterianas
Enzima gen Polimeriza- Actividad Actividad Función
ción 5´-3’ exonucleasa exonucleasa principal
3´-- 5´ 5´-- 3´

I polA + + + Reparación

II polB + + - Reinicio de la
replicación,
reparación
III polC + + - Replicasa
Subunidades de la DNA polimerasa III de E.coli
sub # por Mr Función Pol III
holoenzima Núcleo
dnaE α 2 Alfa 132,000 Subunidad catalítica
dnaQ ε 2 épsilon 27,000 Proofreading
Pol III’
holE θ 2 theta 10,000 Acoplador
dnaX τ 2 tau 71,000 Dimerización
dnaX γ 1 gamma 48,000 Abrazadera que
Pol III*
holA δ 1 delta 35,000 carga las
subunidades β al
holB δ´ 1 delta 33,000
DNA
holC χ 1 xi 15,000 Complejo γ ó
holD ψ 1 psi 12,000 complejo τ

dnaN β 4 beta 37,000 Procesividad Pol III holo

Pol III’

Pol III*
 DNA polimerasa III

La DNA pol III es la que replica las dos cadenas de DNA a la vez.
Corrige errores con su actividad exonucleasa 3´- 5´
Subunidad beta
homodímero
• Fidelidad se refiere al seguimiento exacto de la secuencia
de DNA que sirve como molde
• La fidelidad de la replicación en bacterias: ≈10-8 a 10-10
• Procesividad # de nucleótidos que se sintetizan en un
solo evento de unión. Una enzima procesiva agrega miles.
• Distributividad. Se refiere a la síntesis que avanza
agregando pocos nucleótidos por evento de unión.
Pol III’

Formación
de la
holoenzima
Pol III*

¿Dímero asimétrico?
Procesividad de la DNApolimerasa III

La procesividad de la DNApol lII* aumenta de

50 nts a más de 50,000 nts gracias a la
subunidad β
 DnaB -DnaC

Hda/IdaB
Beta
DNA primasa

DnaA
FRAGMENTO DE OKASAKI
La replicación es semidiscontinua

Fragmentos de Okazaki 1200-2000 nt

Interrupción de la replicación por la cadena retrasada??
El molde de la cadena
retrasada se debe doblar
para parecer que va en la
misma dirección que la
cadena adelantada
RNasa H remueve el cebador, pero no es
eficiente eliminando desoxinucleótidos (el
último del cebador)

DNA polimerasa I ayuda a remover el

cebador, actividad exonucleasa 5´-3´
Actividad de polimerasa reemplaza los
nucleótidos eliminados ≈17

DNA ligasa cataliza la

formación de enlace
fosfodiéster
DNA ligasa
 Topoisomerasas

Topoisomerasa I
Topoisomerasas I
Topoisomerasa III

Topoisomerasa II
Topoisomerasas II (DNA Girasa)
Topoisomerasa IV
Topoisomerasas I
 Topoisomerasas II

Girasa
• Topoisomerasas II
Topo IV Decatenasa
Termino de la replicación
 Síntesis del DNA

• Semiconservativa

• Dependiente de cebador de RNA

• Semidiscontinua

• Bidireccional
 EUCARIOTE
•Tamaño de genoma
Pol procariote: 1000 nt/seg
Pol eucariote: 2000 nt/min (al menos 25 veces más lenta que la pol
de bacterias)

•Orígenes de replicación
Varios orígenes de replicación?
Diferentes tipos ó es una secuencia única?
Experimentos con plásmidos
Levaduras vs eucariotes superiores
Estructura del origen-deleciones

•Replicación
Depende del ciclo celular
Inicio de la replicación en eucariotes

Mas de 10 kpb
Inicio de la replicación en eucariotes
Saccharomyces cerevisiae

ATTTAATATTTTGGA

Encontradas en zonas silenciadas

 ORIGEN DE REPLICACION
ATTTAATATTTT
TAAATTATAAAA

ARS: Secuencias de Replicación Autónoma.

PROTEINAS ORC (1-6)

M ARS

ORC: Complejo de Replicación del Origen

CDC6 CDT1
M-G1 ARS
G1- S PROTEINAS MCM (2-7)

CDC6 CDT1
ARS
MCM: Minicromosomales de Mantenimiento

CDT1 HELICASA:
CDC6 MCM 6 x 2
MCM 4 x 2 (ATP asa)
MCM 7 x 2

MCM 5, MCM 2 y
MCM 3

CDT1
CDC6

PUNTO DE
CONTROL
Regulación del Pre-RC

FASE M
Ciclinas B-CDK-M
(Secuestra a Cdt1)

Ciclinas B-CDK-M

FASE G1/S
 CDC45
CDT1
CDC6 Sld3

Ciclinas /CDK-G1
Pol α
CDC45 MCM 10
CDT1 Sld3
CDC6

DDK/CDK-S

Pol α
CDC45 MCM 10
CDT1 ACTIVACIÓN DEL
CDC6 Sld3
COMPLEJO DE
INICIACIÓN
 ORC : 6 subunidades, se fija selectivamente a ARS en un
mecanismo dependiente de ATP.

CDC6

Proteínas estructurales

CDT1

MCM, (Mcm 2–7, pesos moleculares de 101, 91,

97, 82, 93, y 81 kDa). Helicasa

CDC45

Sld3 La unión de la proteína Cdc45 en el origen completa la

formación del complejo de pre-iniciación

Pol α En eucariotes, la DNA pol α/Primasa es parte de un

MCM 10 complejo de 4 proteínas (180, 68, 58 y 48 kDa), p48
y p58, son requeridas para la actividad de Primasa.
 DNApolδ
MCM8 (primasa)
DNApolε

CDC45
Sld3
Cebador
RNA/DNA

RPA; factor de replicación A

RFC; factor de replicación C

DNA pol ε GINS

Cadena continúa

DNA pol δ PCNA

Cadena discontinúa
RPA; factor de replicación A: Es un heterotrímero, recubren el
DNA de hebra sencilla protegiéndolo del ataque por
exonucleasas e impidiendo que vuelva a formar hebras dobles
entre las bases componentes.

RFC; factor de replicación C: Es un heteropentámero, encargado de

cargar a PCNA alrededor del DNA.. El RFC reconoce el extremo 3’
del pre-fragmento de Okazaki y, mediante la hidrólisis del ATP.
 Proliferating Cell Nuclear Antigen
PCNA
Proteína 29kDa

Incrementa procesividad
de la DNA pol delta ≈ 40

Forma un trímero
alrededor del DNA

GINS

•Heterotetrámero
 Polimerasas de eucariotes
DNA polymerases undertake replication or repair
DNA polymerase Function Structure
α High fidelity replicases 350kDa tetramer
alfa Nuclear replication
Polimerasa-primasa
δ Nuclear replication 250kDa tetramer
delta Cadena discontinua
ε Nuclear replication 350kDa tetramer
epsilon Cadena continua
γ Mitochondrial replication 200kDa dimer
gamma
β High fidelity repair 39kDa monomer
beta Base excision repair
ζ Low fidelity repair Heteromer
zeta Thymine dimer bypass
η Base damage repair Monomer
eta
ι Requiered in meiosis Monomer
iota
κ Deletion and base substitution monomer
kappa
 PCNA
(Helicasa)

MCM8 (primasa)

Pol δ-cadena lagging

Pol ε-cadena líder
Cdt1

DDK
Pol ε
Polδ
 Terminación en eucariotes
El dilema de los cromosomas lineales
Terminación en eucariotes
Telomeros
Terminación en eucariotes
Telomerasa

U
Terminación en eucariotes
Telomerasa
ORIGEN DE REPLICACION EUCARIOTE

Solo uno o múltiples?

Tiempo de replicación/tamaño de genoma
Replicación en embriones/células somáticas
Múltiples orígenes?/Orígenes diferenciales?
Encendido durante el ciclo

Existe una secuencia única?

Experimentos con plásmidos
Levaduras vs eucariotes superiores
Estructura del origen-deleciones

Replicación una vez por ciclo?

Depende del ciclo celular
Inicio de la replicación en eucariotes

Mas de 10 kpb
Inicio de la replicación en eucariotes
Saccharomyces cerevisiae

ATTTAATATTTTGGA

Encontradas en zonas silenciadas

 ARS

Proteínas ORC

ORC
1-6

Cdc6 Cdt1

ORC
1-6
 Cdc6 Cdt1
ORC
1-6

Proteínas
MCM 2 al 7

Cdc6 Cdt1
ORC
1-6

Cinasa de G1/S
Cdc6, Cdt1 MCM 2,3,5
ORC ?????

MCM MCM
4,6,7 4,6,7

ORC
 Cdc6-Cdt1

MCM MCM
ORC
Cdc6-Cdt1

Cdc45, sld3

MCM MCM
ORC

DDK, CDK

Cdc Cdc
45 45
MCM MCM

Cdc6 RPA, DNApolα-primasa

, cdt1
Cdc RPA
45
polα-
MCM RFC, DNApolδ,
primasa
DNApolε
 5 polipéptidos 4 polipéptidos

PCNA
(Helicasa)
(PCNA-like)
MCM8 (primasa) 4-5 polipéptidos

Pol δ-cadena lagging

Pol ε-cadena líder
Regulación del Pre-RC
 Cdt1

DDK
Cdt1
 Proliferating Cell Nuclear Antigen
PCNA
Proteína 29kDa

Incrementa procesividad
de la DNA pol delta ≈ 40

Forma un trímero
alrededor del DNA
 Polimerasas de eucariotes
DNA polymerases undertake replication or repair
DNA polymerase Function Structure
α High fidelity replicases 350kDa tetramer
Nuclear replication
Polimerasa-primasa
δ Nuclear replication 250kDa tetramer
Cadena discontinua
ε Nuclear replication 350kDa tetramer
Cadena continua
γ Mitochondrial replication 200kDa dimer
β High fidelity repair 39kDa monomer
Base excision repair
ζ Low fidelity repair Heteromer
Thymine dimer bypass
η Base damage repair Monomer
ι Requiered in meiosis Monomer
κ Deletion and base substitution monomer
Pol ε
Polδ
 Terminación en eucariotes
El dilema de los cromosomas lineales
Terminación en eucariotes
Telómeros
Terminación en eucariotes
Telomerasa

U
Terminación en eucariotes
Telomerasa
3’