UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA

VETERINATA BUCURESTI
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

Alimente cu rol functional si efectul

consumului asupra microbiotei

Prof.coordonator: Mihaela Ghidurus

Student: Ungureanu Alina

BUCURESTI

2017
 CUPRINS

1.Introducere
2.Caracterizarea microbiotei intestinale
3.Kitul de analiza al amoniacului
4. Realizarea mediilor de cultura
5. Referinte bibliografice
 INTRODUCERE

Intestinul uman adăpostește diversi microbi care joacă un rol fundamental în

bunăstarea gazdei lor. Constituenții microbiotei-bacteriile, virușii și ai eucariotelor-au
dovedit a interacționa unul cu altul dar și cu sistemul imunitar al gazdei, în moduri
care influențează dezvoltarea bolii.

Aceste interacțiuni sugerează că o abordare holistică in studierea microbiotei,

care merge dincolo de caracterizarea compoziției comunității și cuprinde interacțiuni
dinamice între toate componentele tesutului microbiotei si al gazdei, de- a lungul
timpului va fi cruciala pentru construirea modelelor predictive pentru diagnosticarea
și tratamentul bolilor legate de dezechilibrele microbiotei.

Adapostim cel puțin 100 de trilioane celule microbiene si un cvadrilion de

viruși în și pe noi. In mod colectiv, asociațiile microbiene care locuiesc în și pe corpul
uman constituie microbiota noastra, iar genele care le codifică sunt cunoscute sub
numele de microbiom. Această comunitate complexă conține bacterii, eucariote, viruși
și cel puțin un arheon, care interacționează între ele dar și cu gazda, având un un
impact puternic asupra sănătății umane și psihologice. Numai o mică minoritate dintre
acestea pot fi cultivate.. Studii multiple au făcut posibilă caracterizarea și compararea
rapida a mai multor probe permițând detectarea bolilor asociate microbiotei noastre.

Microbiota joacă un rol major in domeniul sanatatii si a bolii la om; într-adevăr,

ea este denumită uneori noastre „organul uitat”. Microbiota este implicata în recoltarea
și stocarea energiei, precum și într-o varietate de funcții metabolice, cum ar fi
fermentația și absorbtia carbohidratilor nedigerati, o trăsătură care a acționat, probabil,
ca o forță evolutivă puternică spre stabilirea bacteriilor ca simbionți umani. Poate chiar
mai important, microbiota intestinala interactioneaza cu sistemul imunitar, oferind
semnale pentru a promova maturarea celulelor imune și dezvoltarea normală a
funcțiilor imunitare.
 Caracterizarea microbiotei intestinale

Determinarea a ceea ce constituie o microbiota sanatoasa și variabilitatea gasita în

populații este o condiție prealabilă pentru evaluarea abaterilor care sunt asociate cu stările de
boală. Microbii colonizeaza toate suprafețele corpului uman, care sunt expuse mediului, cu
majoritatea care se află în tractul intestinal. Comunități microbiene distincte sunt, de
asemenea, găsite în gură ,in vagin si pe piele .

Componenta bacteriana a microbiotei a făcut obiectul de studiu intensiv în ultimii ani,

condus de proiecte la scară largă, cum ar fi Proiectul microbiomului uman.

Microbiota intestinala este în mod obișnuit dominata de bacterii și în mod specific de

către membrii diviziilor Bacteroidetes și Firmicutes. Deși există o gamă foarte mare a
variației taxonilor prezenți în intestin și a variabilitatii interindividuale în compoziția
microbiană, s-a sugerat că microbiota celor mai multe persoane poate fi clasificata într-una
din cele trei variante bazate pe dominanta genurilor. (Bacteroides, Prevotella, sau
Ruminococcus).

Pe masura ce ne dezvoltam si ne schimbam de la copilărie la bătrânețe, asa se modifica

si microbiota noastră. Spre deosebire de studiile descrise mai sus, unde scara timpului este
relativ scurta, sau subiecții sunt deja adulți, colonizarea initiala a tractului intestinal al
sugarilor a deschis o fereastră în dinamica succesiune a intestinului .In mod traditional copii
au fost considerati sterili in uter .

Interacțiuni complexe microbiene in cazul bolilor

Bolile complexe sunt rareori cauzate de un singur factor, și înțelegerea modului în care
diferitele elemente interactioneaza pentru a induce un fenotip boala este crucială pentru a
facilita predictia si tratamentul unor astfel de stări . Studii recente au furnizat o serie de
exemple de astfel de interacțiuni complexe. De exemplu, cu toate că virusul herpetic poate
provoca boli acute, infecția latenta cu virusul herpetic a demonstrat protectia șoarecilor
împotriva agenților patogeni bacterieni Listeria monocitogenes și Yersinia pestis prin
stimularea nivelurilor crescute de interferon-g și factorul de necroză tumorală.

Helicobacter pylori oferă un al doilea exemplu al modului în care interacțiunea dintre

membrii microbiotei și gazda poate avea un impact major în domeniul sănătății. Infecția cu H.
pylori este corelată cu boli respiratorii, cum ar fi boala pulmonară obstructivă cronică (BPOC)
și tuberculoza pulmonară . Dovada este, cu toate acestea, contradictorie cu privire la natura
acestei corelații: unele studii arata un risc crescut de a dezvolta boli la subiecții infectați cu H.
pylori dar studii recente au observat efectul opus, cand H. pylori conferă protecție împotriva
tuberculozei.
 Kitul de analiza al amoniacului

Temperatura de stocare 2-8 °C

A nu se ingheta
Descrierea produsului
Acest kit este pentru determinarea cantitativa si enzimatica a amoniacului in probe alimentare
si biologice. Amoniacul reactioneaza cu acidul α-cetoglutaric (KGA ) si reduce NADPH
(nicotinamid adenin dinucleotid fosfat) in prezenta L-glutamat dehidrogenaza GDH la forma
L –glutamat si nicotinamid adenin dinucleotid fosfat oxidat NADP+ :

KGA +NH4+ +NADPH -------> L-Glutamat +NADP+ +H2O

Scăderea absorbanței la 340 nm , din cauza oxidarii NADPH , este proporțională cu

concentrația de amoniac . L-Glutamat dehidrogenaza reationeaza in mod specific cu
amoniacul.
Kitul de analiza alamoniacului poate fi utilizat pentru a determina concentratiile de amoniac
in domeniul 0,2-15 µg/ml.

Componente
Compozitia reactivului amoniac - 10 flacoane
Reactivul uscat conține acid α-cetoglutaric , NADPH , tampoane, stabilizatori și agenți de
umplere nonreactivi. Reactivul trebuie păstrat la 2-8 ° C . Ar trebui să fie aruncată în cazul în
care conținutul flaconului nu se dizolvă complet după reconstituire , sau dacă in soluția
reconstituită apare tulbure sau de culoare galbenă .
• 1 flacon
L - Glutamat dehidrogenaza , din ficat bovin
Enzima este disponibil sub formă de soluție în 50 % glicerol .
Soluția de enzimă trebuie depozitată la 2-8 ° C .
A NU SE CONGELA .
Acest reactiv este stabil timp de cel puțin 1 an la temperatura de 2-8 ° C.
Activitate : ≥525 unități / ml
Definitia unitatii : O unitate va reduce 1,0 umol de acid α cetoglutaric la L - glutamat pe
minut la pH 7,3 și 25 ° C in prezența ionilor de amoniu.

Soluție standard de amoniac 1 flacon

Concentrația de amoniac din soluția standard este 10 ug/m
(~588 uM ca sulfat de amoniu). Soluția trebuie păstrată la 2-8 ° C și este stabila timp de cel
puțin 1 an. Pentru a evita evaporarea sau absorbția amoniacului, soluția standard de amoniac
trebuie să fie păstrata limitat atunci când nu este utilizata.
Soluția standard de amoniac este utilizata pentru a asigura fiabilitatea testului.
Nu este necesar pentru a rula protocolul standard pentru a determina concentrația de amoniac
din probe.

Echipamente necesare, dar care nu sunt furnizate:

• Spectrofotometru potrivit pentru masurarea absorbantei la 340 nm
• Cuve
• Pipete capabile de a doza cu precizie de la 10 ul la 1 ml

Precautii
Kitul este numai pentru utilizare R&D , nu pentru diagnosticarea in vitro,de droguri, de uz
casnic, sau pentru alte utilizări. Vă rugăm să consultați Fișa tehnică de securitate pentru
informații privind pericolele și Instrucțiuni de manipulare în condiții de siguranță.

Instructii de preparare
Reactivul de analiza al amoniacului
Reconstituiți fiecare flacon cu 10 ml de apă. După adăugarea apei, puneti capacul flaconului
și imediat se amestecă de mai multe ori prin răsturnare. NU SE AGITA. Reactivul pentru
testul de amoniac pregătit trebuie să fie menținute limitat pentru a evita posibila absorbție a
amoniacului. Reactivul contine ~3.4 mM acid α-cetoglutaric și ~0.23 mM NADPH. Este
stabil, în absența creșterii microbiene vizibile, timp de cel puțin 1 zi, la 18-26 ° C, și timp de 2
săptămâni la 2-8 ° C. Reactivul reconstituit poate fi porționat și depozitat la -20 ° C, timp de 6
luni. A se evita ciclurile de inghet / dezghet.
Solutia de L – Glutamat dehidrogenaza și soluția standard de amoniac sunt livrate gata de
utilizare.

Pregatirea probelor :
Proba trebuie să fie limpede și incoloră . Se ajustează pH-ul 7-8.
Probele lichide trebuie diluate cu apă până la o concentrație de amoniac de 0.20-15 ug / ml (
0,1 ml volum final probă ) . Se filtrează , dacă este necesar , să se clarifice . Soluțiile de probă
, care sunt puternic colorate și au o concentrație scăzută de amoniac ar trebui decolorate .
Produsele carbonatate sau fermentate trebuie să fie degazate.
Probele solide ar trebui sa cantareasca aproximativ 0,1 mg .
Se extrage proba solidă cu apă . Se diluează extractul cu apă până la o concentrație de
amoniac de 0.20-15 ug / ml ( 0,1 ml volum final probă ) .
Se filtreaza , dacă este necesar , să se clarifice.

Procedura
Orice compuși prezenți în probă care reacționează cu NADP + / NADPH în condițiile acestui
test va duce la rezultate inexacte pentru determinarea concentrației de amoniac . Probele care
conțin fragmente de proteine sau proteine care eliberează amoniac din aminoacizi vor avea ca
rezultat valori false ridicate de amoniac . L - glutamat dehidrogenaza este inhibată de metale
grele , cum ar fi cupru , argint , mercur , fier și zinc . Concentrații mari de taninuri din
eșantion va încetini reacția datorită inhibării L-glutamat dehidrogenazei.
Asigurati-va ca zona de lucru nu contine surse de amoniac.

KIT QUANTOFIX AMMONIUM

Kitul contine :
 1 recipient de aluminiu cu 100 benzi test
 2 sticle cu NH4+ -1
 1 vas de masurat marcat la 5 ml

Interval de masurare 10-400 mg/L NH4

Gradiatia culorii: 0,10,25,50, 100,200,400 mg/L NH4
Reactivul NH4 -1 contine solutie de hidroxid de sodiu 32 %.

Indicatii generale:
Se scot doar benzile de care ai nevoie. Se inchide imediat recipientul dupa scoaterea unei
benzi.
Instructiuni de folosire:
 Se iau 5 ml din proba de analizat si se introduce in vasul marcat
 Se adauga 10 picaturi NH4+ -1 in fiecare proba
 Se agita cu atentie
 Se scufunda banda test in solutie pentru 5 secunde
 Se indeparteaza excesul de lichid
 Se compara cu scala de culori
Daca ionii de amoniu sunt prezenti , banda de test se face portocalie.
REALIZAREA MEDIILOR DE CULTURA SI INSAMANTAREA

Am realizat 8 medii de cultura diferite, fiecare fiind specific unei anumite grupe de
microorganism.

1. Mediul Wilkins-Chalgren Anaerob agar- este un mediu recomandat pentru cultivarea

microorganismelor anaerobe si testarea sensibilitatii la antibiotic
2. Nutrient agar-este un mediu simplu; se utilizeaza pentru cultivarea bacteriilor
nepretentioase
3. SPS Agar modificat- este un mediu folosit pentru izolarea selective a Clostridium
perfringens din alimente
4. Mac Conkey Agar NO2- este un mediu selective si de diferentiere pentru izolarea
bacteriilor Gram – si bacterii gasite in mod normal in tractul intestinal si bacilli, bazat
pe fermentatia lactica;
5. Chapman Agar- este un mediu care se foloseste pentru izolarea selective si cultivarea
stafilococilor. Microorganismele care utilizeaza manitol transforma mediul in galben;
6. MRS Agar- este un mediu care incurajeaza cresterea bacteriilor acido-lactice care
include specii precum Lactobacillus, Streptococcus , Pediococcus, Leuconostoc;
7. Azide-Blood-Agar-Base- este un mediu folosit pentru izolarea selective si cultivarea
speciilor de Staphylococcus si Streptococcus;
8. BSM Agar- este un mediu folosit pentru izolarea selective si identificarea
bifidobacteriilor precum Bifidobacterium longum si Bifidobacterium infantis;
Bifidobacteriilor cresc foarte bine pe acest mediu atunci cand sunt inhibate tulpiniile
de Lactobacillus si Streptococcus. Coloniile de Bifidobacterium cresc in 24-48 h si au
culoarea violet/brun.
Toate mediile au fost sterilizate in autoclave la 121 grade C.si apoi repartizare in placi Petri.

Se fac cate 5 dilutii din fiecare proba de analizat:

-0,1 ml proba

-0,9 ml apa distilata

Se folosesc tuburi Eppendorf

Ultima dilutie se pastreaza si din aceasta se insamanteaza pe fiecare din cele 8 medii de
cultura.
Insamantarea se face prin tehnica in gazon. Placile insamantate se introduce la thermostat 48
h. apoi se citesc , se identifica si se caracterizeaza grupele de microorganism dezvoltate pe
placile Petri..
 Referinte bibliografice

1. Barton, E.S., White, D.W., Cathelyn, J.S., Brett-McClellan, K.A., Engle,

M., Diamond, M.S., Miller, V.L., and Virgin, H.W., 4th. (2007).
Herpesvirus latency confers symbiotic protection from bacterial infection.
Nature 447, 326–329.

2. Costello, E.K., Lauber, C.L., Hamady, M., Fierer, N., Gordon, J.I., and
Knight, R. (2009). Bacterial community variation in human body habitats
across space and time. Science 326, 1694–1697.

3. Turnbaugh, P.J., Ridaura, V.K., Faith, J.J., Rey, F.E., Knight, R., and
Gordon, J.I. (2009b). The effect of diet on the human gut microbiome: a
metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice. Sci. Transl. Med.
1, 6ra14.

4. Wu, G.D., Chen, J., Hoffmann, C., Bittinger, K., Chen, Y.Y., Keilbaugh,
S.A., Bewtra, M., Knights, D., Walters, W.A., Knight, R., et al. (2011).
Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes.
Science 334, 105–108.